Summary
Lentiviruses genin fonksiyonu keşfetmek için çok değerli bir araştırma aracı; Ancak, araştırmacılar bilinen pantropic lentivirüs kodlama ya da şüphesi onkogenler üretimi önlemek için isteyebilirsiniz. Alternatif olarak, biz ecotropic reseptör mSlc7a1 ifade etmek için modifiye insan hücreleri üzerinde ecotropic lentivirüs kullanmak için daha güvenli bir protokol mevcut.
Abstract
Kök ve tümör hücre biyolojisi çalışmaları genellikle laboratuvar personeli için önemli güvenlik sorunları yükselterek, bilinen ya da şüphelenilen onkogenler insan hücrelerinde viral transdüksiyon gerektirir. Yaygın olarak kullanılan VSV-G pseudotype Pantropic lentiviruses, gen fonksiyonu olmayan bölünen hücreleri de dahil olmak üzere çok sayıda hücre tipleri, transduce çünkü çalışmak için değerli bir araç. Ancak, araştırmacılar, üretim ve yüksek biyogüvenlik düzey sürüş gereksinimleri ve güvenlik sorunları nedeniyle onkogenler kodlama pantropic virüs santrifüj önlemek için isteyebilirsiniz. C-Myc ve SV40 büyük T antijeni dahil olmak üzere birçok güçlü onkogenler, bağlı pluripotent kök hücreleri (iPSC) üretimini artırmak için bilinmektedir. Tüm diğer iPSC indükleyici genetik değişiklikler (OCT4, SOX2, KLF4, NANOG, LIN28 ve p53 kaybı) fonksiyonu da nispeten yüksek güvenlik endişesi de bunları yaparken, kanser bağlantılar var.
Kanser ile ilgili bu virüsler hücresel yeniden programlama ve pluripotency eğitim yararlı olsa da, güvenli bir şekilde kullanılması gerekir. Bu biyogüvenlik konuları ele almak için, düşük maliyet ve uygun taşıma hakkında ek vurgu ecotropic lentivirüs insan hücrelerinin transdüksiyon için bir yöntem göstermektedir. Biz% 90 daha fazla uyum sağlamak yeterince yüksek titreye sahip ecotropic lentivirüs reseptör ifade, bu yaklaşımın etkinliği doğrulayarak, virüse maruz kalan insan hücreleri.
Lentivirüs genellikle Ultrasantrifügasyon yoğunlaşmıştır; Ancak, bu işlem birkaç saat sürer ve infeksiyöz aerosollerin insan biyomedikal araştırmacıların üretebilir. Daha güvenli bir alternatif, viral parçacıkların, kondroitin sülfat ve polybrene (CS / PB) kompleks hücrelerin üzerine tortulaşmış olabilir gibi. Bu teknik, fonksiyonel viral titresi stably önemsiz eklenen zaman ve maliyet, fare retrovirüs reseptör ifade hücreleri 3-kat artar. Insan dermal fibroblastlar (HDFS) İletimi maksimum bu polimer konsantrasyonu ilgi hedef hücre tipi için titre edilmelidir, kanser hücre hatları için daha önce rapor edilen en iyi değerden yaklaşık 4 kat daha düşük CS / PB konsantrasyonları kullanılarak geliştirilmiştir. Bu nedenle yeni bir hücre tipi polimer toksisite için tahlil methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide (MTT) kullanımını tanımlamak. Biz, minimal akut toksisite gösteren viral transdüksiyon sonra polimer kompleksleşme veya polybrene (PB, 6 mg / ml) standart dozda ya HDFS eşdeğer canlılığı gözlemliyoruz.
Bu protokol, biyogüvenlik riskleri azaltarak ve transdüksiyon hızını artırarak, insan hücrelerinde onkogenlerin aşırı ekspresyonu için ecotropic lentivirüs kullanımı açıklanmaktadır. Ayrıca viral parçacıkların aerosol oluşturan santrifüj kaçınarak transdüksiyon geliştirmek için polimer kompleksleşme kullanımını göstermek.
Discussion
Moloney fare lösemi virüsü (MLV) ve onun reseptörü mSlc7a1 dayalı Rekombinant ecotropic gammaretrovirus iyi çalışılmış ve yaygın olarak kullanılabilir, fare hücreleri transgenlerin sunmak için 20 yılı aşkın süredir kullanılmaktadır. Ecotropic gammaretrovirus insan hücrelerine onkogenler sunmak için de son zamanlarda daha çok olmuştur. Hücresel yeniden programlama bağlamında, mSlc7a1 kullanımı iyi kurulmuş amphotropic virüs barındıran insan onkogenler nesil önlemek için 4,5 Ancak, lentivirüs gammaretrovirus göre önemli avantajlar sağlar lentiviral ön-entegrasyon kompleksi sağlar çünkü refrakter hücre popülasyonlarının, sık sık yeniden programlama için arzu edilen hedeflere 6 dahil birincil hücreler, uyum olmayan bölünen hücreleri transdüksiyon 7
Lentiviruses MLV virüs tropizm, toksisite ve diğer özellikleri 8 MLV pseudotyped ecotropic lentivirüs fare hücreleri, 9 uyum sağlamak olmuştur ama insan hücreleri üzerinde nadiren kullanılır olmuştur değiştirmek için bir çaba da dahil olmak üzere onlarca farklı pseudotypes, ile üretilmiştir 10 Bu nedenle, insan hücrelerinde hücresel yeniden programlama faktörler de dahil olmak üzere, bilinen ya da şüphelenilen onkogenler, teslim etmek için güvenli, uygun maliyetli ve yüksek verimli bir araç olarak MLV pseudotyped ecotropic lentivirüs kullanımını öneriyoruz.
Daha doğrusu, bu protokol, kanserle ilgili virüsleri ile self-aşılama potansiyel araştırmacılar, yalıtım, pantropic virüs onkogen (ler) ayırır; bu protokolü tamamen pantropic lentivirüs üretmek ve kullanmak gereksinimini ortadan kaldırmak olmadığını not etmek önemlidir. Protein mSlc7a1 ve insan homologu hSlc7a1 yayg amino asit taşıyıcıları bilinen Tümör Gelişimi veya alıcı hücreler üzerinde seçici bir büyüme avantajı tanımak yeteneği, 11 amphotropic virüs içine dahil edilmesi için nispeten düşük riskli verme mSlc7a1 ile ifade edilir. Bu adım, gerekli biyogüvenlik düzeyi adanmış virüs veya doku kültürü tesisleri eksik laboratuvarlarda özellikle yararlı olabilir.
Bazı durumlarda pantropic virüsü hedef hücreleri doğrudan Slc7a1 plazmid transfecting kullanımı tamamen ortadan kaldırmak için mümkün olabilir, ancak bu tekniğin yararlı hedefler olacaktır birçok hücre transfeksiyon dirençli. Alternatif olarak, izole etme yeteneği blasticidin seçim hücreleri Slc7a1-transduced VSV-G pseudotyped lentivirüs ecotropic virüs bu hücrelerin çoğu için uyum sağlamak rutin olarak kullanılan bu tarihten sonra reseptör eksprese eden hücrelerin, bir stok oluşturmak için bir kez kullanılabileceği anlamına gelir deneyler. Araştırmacılar, her zaman tropizm ne olursa olsun, herhangi bir lentivirüs çalışan için kurumsal güvenlik yönergeleri takip etmelidir.
Bu protokol ile elde ecotropic virüs titreleri orta önceki çalışmalar ile anlaşma genellikle VSV pseudotyped virüs, pantropic virüs titresi% 10-20 daha düşüktür. 9 Bu titreleri stably Slc7a1 ile transduced insan hücrelerinde ölçüldü, bu nedenle alt ecotropic virüs için gözlenen titresi hedef hücrelere reseptör geninin çeşitli ifade kısmen olabilir. Bununla birlikte, protokolde elde viral titreleri çoğu uygulama için yeterli olandan daha fazla ve bazı durumlarda, hücrelerin çoğunluğunun transdüksiyon yol>% 90 hücre.
Santrifüj tabanlı teknikler genellikle viral parçacıkların konsantre kullanılır. Ancak, santrifüj, birkaç saat gerektirir infeksiyöz aerosollerin üretir ve viral parçacıkların önemli bir kaybına neden olabilir. 12, CS / PB ile kompleks bir alternatif olarak viral tropizm değiştirmeden transdüksiyon geliştirmek için kullanılabilir. 3 Bu yöntem (5 dakika hızlıdır gözlenen titresi yaklaşık üç katına ise, (10 ml virüs başına $ 0.03)) ve ucuz. Hiçbir özel ekipman veya tescilli reaktifler ve gerekli diğer hücre hatları önceki çalışma ile anlaşma, CS / PB HDFS maruz kaldıktan sonra en az akut toksisite gözlenen bu protokol 13 Bir potansiyel dezavantajı bazı mikroskobik görünür polimer kompleksleri uymasını kültür hücreleri birkaç gün. Biz bu kompleksleri, hücrelere açıkça zehirli olmasa da, hücresel süreçleri daha ince etkileri olabileceği olasılığını ekarte edemez.
Burada güvenli ve verimli bir şekilde onkojenik faktörleri ile insan hücrelerinin uyum için bir metodoloji tarif var. Bu yaklaşım, iPS hücreleri de dahil olmak üzere onkogenler ve kök hücre biyolojisi inceleyen araştırmacılar için harika bir yardımcı programdır olmalıdır.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
California Rejeneratif Tıp Enstitüsü tarafından bu proje için finansman sağlanmıştır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pLenti6/UbC/mSlc7a1 | Addgene | 17224 | Murine MLV receptor |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | VSV-G envelope |
| pCMV-dR8.91 | Addgene | D. Trono lab14
Packaging plasmid (equivalent plasmid psPax2 is available from Addgene, Cat. Number 12260) |
|
| pHCMV-Ec–nv | Addgene | 15802 | Ecotropic envelope |
| FUGW | Addgene | 14883 | GFP control plasmid |
| OptiMEM | Invitrogen | 31985 | |
| Fugene HD | Roche Group | 04 709 705 001 | |
| Hexadimethrine bromide (Polybrene) | Sigma-Aldrich | H9268 | |
| Chondroitin sulfate sodium salt from shark cartilage | Sigma-Aldrich | C4384 | |
| Blasticidin S | Fisher Scientific | BP 2647100 | |
| Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide (MTT) | Sigma-Aldrich | M2128 | |
| Igepal CA-630 | Sigma-Aldrich | I3021 |
References
- Davis, H. E., Rosinski, M., Morgan, J. R., Yarmush, M. L. Charged polymers modulate retrovirus transduction via membrane charge neutralization and virus aggregation. Biophys J. 86, 1234-1242 (2004).
- Marino, M. P., Luce, M. J., Reiser, J. Small- to large-scale production of lentivirus vectors. Methods Mol Biol. 229, 43-55 (2003).
- Landazuri, N., LeDoux, J. M. Complexation of retroviruses with charged polymers enhances gene transfer by increasing the rate that viruses are delivered to cells. J Gene Med. 6, 1304-1319 (2004).
- Ohnuki, M., Takahashi, K., Yamanaka, S. Generation and characterization of human induced pluripotent stem cells. Curr Protoc Stem Cell Biol. 4, 4A.2-4A.2 (2009).
- Hotta, A. EOS lentiviral vector selection system for human induced pluripotent stem cells. Nat Protoc. 4, 1828-1844 (2009).
- Reiser, J. Transduction of nondividing cells using pseudotyped defective high-titer HIV type 1 particles. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 15266-15271 (1996).
- Cullen, B. R. Journey to the center of the cell. Cell. 105, 697-700 (2001).
- Cronin, J., Zhang, X. Y., Reiser, J. Altering the tropism of lentiviral vectors through pseudotyping. Curr Gene Ther. 5, 387-398 (2005).
- Schambach, A. Lentiviral vectors pseudotyped with murine ecotropic envelope: increased biosafety and convenience in preclinical research. Exp Hematol. 34, 588-592 (2006).
- Koch, P., Siemen, H., Biegler, A., Itskovitz-Eldor, J., Brustle, O. Transduction of human embryonic stem cells by ecotropic retroviral vectors. Nucleic Acids Res. 34, e120-e120 (2006).
- Yoshimoto, T., Yoshimoto, E., Meruelo, D. Molecular cloning and characterization of a novel human gene homologous to the murine ecotropic retroviral receptor. Virology. 185, 10-17 (1991).
- Cepko, C. Large-scale preparation and concentration of retrovirus stocks. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 9, Unit 9.12-Unit 9.12 (2001).
- Doux, J. M. L. e, Landazuri, N., Yarmush, M. L., Morgan, J. R. Complexation of retrovirus with cationic and anionic polymers increases the efficiency of gene transfer. Hum Gene Ther. 12, 1611-1621 (2001).
- Zufferey, R. Self-inactivating lentivirus vector for safe and efficient in vivo gene delivery. J Virol. 72, 9873-9880 (1998).
