Summary
Lentivirussen zijn een waardevol onderzoeksinstrument voor het verkennen van genfunctie, maar onderzoekers kunnen wensen om de productie van pantropic bekende lentivirus codering of vermoede oncogenen te vermijden. Als alternatief, presenteren we een veiliger protocol voor het gebruik van ecotropic lentivirus op menselijke cellen aangepast aan de ecotropic receptor mSlc7a1 uit te drukken.
Abstract
Stem en tumor celbiologie studies vereisen vaak virale transductie van menselijke cellen met bekende of vermoedelijke oncogenen, het verhogen van de belangrijkste veiligheidsproblemen voor laboratorium personeel. Pantropic lentivirussen, zoals de veelgebruikte VSV-G pseudotype, zijn een waardevol instrument voor het bestuderen van genen de functie omdat ze transduceren vele soorten cellen, waaronder niet-delende cellen. Echter, kunnen onderzoekers willen de productie en centrifugeren van pantropic virussen coderen oncogenen als gevolg van hogere bioveiligheidsniveau handling-eisen en veiligheid te voorkomen. Een aantal krachtige oncogenen, zoals c-Myc en SV40 grote T antigen, is bekend dat de productie van geïnduceerde pluripotente stamcellen (IPSC) te verbeteren. Alle andere bekende IPSC-inducerende genetische veranderingen (OCT4, SOX2, KLF4, NANOG, LIN28, en p53 verlies van functie) hebben ook links naar kanker, waardoor ze van de relatief hoge veiligheid zorg ook.
Hoewel deze kanker-gerelateerde virussen zijn nuttig in het bestuderen van cellulaire herprogrammering en pluripotentie, moeten ze veilig gebruikt worden. Om deze problemen bioveiligheid, demonstreren we een methode voor de transductie van menselijke cellen met ecotropic lentivirus, met extra nadruk op de lagere kosten en comfortabele bediening. Wij hebben ecotropic lentivirus met een voldoende hoge titer tot meer dan 90% van de transduceren receptor-expressie menselijke cellen blootgesteld aan het virus, het valideren van de effectiviteit van deze aanpak.
Lentivirus wordt vaak geconcentreerd door ultracentrifugatie, maar dit proces duurt enkele uren en kunnen produceren aërosolen besmettelijk voor de mens biomedische onderzoekers. Als alternatief, virale deeltjes kunnen meer veilig gesedimenteerd op cellen door complexvorming met chondroïtine sulfaat en polybreen (CS / PB). Deze techniek verhoogt de functionele virale titer tot 3-voudig in cellen die stabiel uitdrukken muriene retrovirus receptor, met een verwaarloosbare extra tijd en kosten. Transductie van menselijke dermale fibroblasten (HDFS) is maximaal verbeterd met behulp van CS / PB concentraties van ongeveer 4-maal lager dan de optimale waarde die eerder gerapporteerd voor kanker cellijnen, wat suggereert dat polymeerconcentratie moet worden getitreerd voor het doel celtype van belang. Wij zijn dan ook beschrijven het gebruik van methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide (MTT) voor het testen van toxiciteit voor het polymeer in een nieuwe cel type. We observeren equivalent leefbaarheid van HDFS na het virale transductie met behulp van polymeer complexering of de standaard dosis van polybreen (PB, 6 ug / ml), wat aangeeft een minimale acute toxiciteit.
In dit protocol beschrijven we het gebruik van ecotropic lentivirus voor overexpressie van oncogenen in menselijke cellen, het verminderen van bioveiligheid risico's en het verhogen van de transductie tarief. We tonen ook aan het gebruik van polymeer complexatie aan transductie te verbeteren terwijl het vermijden van aërosolvormende centrifugeren van virale deeltjes.
Discussion
Recombinant ecotropic gammaretrovirus gebaseerd op Moloney murine leukemia virus (MLV) en zijn receptor mSlc7a1 zijn goed bestudeerd en op grote schaal beschikbaar, die al meer dan 20 jaar transgenen te leveren aan muizen cellen. Ecotropic gammaretrovirus is ook meer recent gebruikt om oncogenen te leveren aan menselijke cellen,. In het kader van cellulaire herprogrammering, het gebruik van mSlc7a1 op generatie van amfotrope virus herbergen menselijke oncogenen te voorkomen is goed ingeburgerd maar 4,5, lentivirus biedt aanzienlijke voordelen ten opzichte van gammaretrovirus in transduceren vuurvaste celpopulaties, 6 inclusief primaire cellen die vaak gewenst zijn doelen voor herprogrammering, omdat de lentivirale pre-integratie complex maakt transductie van niet-delende cellen. 7
Lentivirussen zijn geproduceerd met tientallen verschillende pseudotypes, waaronder MLV, in een poging om virus tropisme, toxiciteit en andere eigenschappen. 8 MLV-pseudogetypeerde ecotropic lentivirus is gebruikt om muizen cellen, 9 transduceren maar is zelden gebruikt op menselijke cellen te veranderen 10. Daarom het gebruik van de MLV-pseudogetypeerde ecotropic lentivirus te stellen als een veilige, kosteneffectieve en zeer efficiënte voertuig bekend is of vermoed oncogenen, met inbegrip van cellulaire herprogrammering factoren, te leveren aan menselijke cellen.
Het is van cruciaal belang op te merken dat dit protocol niet helemaal de noodzaak om te produceren en te gebruiken pantropic lentivirus te elimineren, maar eerder dit protocol scheidt het oncogen (s) van de pantropic virus, isolerende onderzoekers van potentiële self-inoculatie met kanker-gerelateerde virussen. Het eiwit mSlc7a1 en haar menselijke homoloog hSlc7a1 zijn alom uitgedrukt aminozuur transporteurs zonder bekende tumorgeniciteit of het vermogen om een selectieve groei voordeel op ontvangende cellen, waardoor 11 mSlc7a1 van een relatief laag risico voor opname in amfotrope virus. Deze extra stap kan met name nuttig zijn in laboratoria ontbreken gewijd virus of weefselkweek faciliteiten van het vereiste niveau van bioveiligheid.
In sommige situaties kan het mogelijk zijn om volledig te elimineren van het gebruik van pantropic virus door het transfecteren van de Slc7a1 plasmide direct in doelcellen, maar veel cellen die nuttig zouden zijn doelwit van deze techniek zijn ook ongevoelig zijn voor transfectie. Als alternatief, de mogelijkheid om te isoleren Slc7a1-getransduceerde cellen door blasticidine selectie houdt in dat VSV-G pseudogetypeerde lentivirus kan eenmaal worden gebruikt om een voorraad van receptor-expressie cellen, waarna ecotropic virus routinematig gebruikt kunnen worden om deze cellen transduceren voor velen te genereren experimenten. Onderzoekers moeten altijd volgen hun institutionele veiligheid van richtlijnen voor het werken met een lentivirus, ongeacht de tropisme.
Titers van ecotropic virus bereikt met dit protocol zijn matig lager zijn dan VSV-virus pseudogetypeerde, over het algemeen 10-20% van de pantropic virus titer, in overeenstemming met eerdere studies. Negen Deze titers werden gemeten in menselijke cellen stabiel getransduceerd met Slc7a1, zodat de lagere waargenomen titer voor ecotropic virus kan gedeeltelijk te wijten aan verschillende expressie van de receptor-gen in target cellen. Niettemin, de virale titers bereikt in ons protocol zijn meer dan voldoende voor de meeste toepassingen en leiden tot transductie van de meerderheid van de cellen, in sommige gevallen> 90% van de cellen.
Centrifugatie-gebaseerde technieken worden vaak gebruikt om virale deeltjes concentreren. Echter, centrifugeren vereist verscheidene uren, genereert infectieuze aërosolen kunnen voortbrengen, en kan resulteren in een significant verlies van virale deeltjes. 12 Als een alternatief, complexatie met CS / PB kan worden gebruikt om transductie te verbeteren zonder dat virale tropisme. 3 Deze methode is snel (5 minuten ) en goedkoop ($ 0,03 per 10 ml virus), terwijl ongeveer een verdrievoudiging van de waargenomen titer. Geen speciale uitrusting of merkgebonden reagentia nodig zijn, en zagen we een minimale acute toxiciteit na blootstelling van HDFS aan CS / PB, in overeenstemming met eerder werk in andere cellijnen. 13 Een potentieel nadeel van dit protocol is dat een aantal microscopisch zichtbare polymeer complexen zich te houden aan de cellen voor meerdere dagen in de cultuur. We kunnen niet uitsluiten dat deze complexen, maar niet openlijk toxisch voor de cellen, kan meer subtiele effecten op cellulaire processen.
Hier hebben we beschreven een methode voor het veilig en efficiënt transducerende menselijke cellen met oncogene factoren. Deze aanpak moet worden van groot nut voor onderzoekers bestuderen van oncogenen en stamcelbiologie inclusief iPS cellen.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
De financiering voor dit project werd verstrekt door het California Institute voor regeneratieve geneeskunde.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pLenti6/UbC/mSlc7a1 | Addgene | 17224 | Murine MLV receptor |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | VSV-G envelope |
| pCMV-dR8.91 | Addgene | D. Trono lab14
Packaging plasmid (equivalent plasmid psPax2 is available from Addgene, Cat. Number 12260) |
|
| pHCMV-Ec–nv | Addgene | 15802 | Ecotropic envelope |
| FUGW | Addgene | 14883 | GFP control plasmid |
| OptiMEM | Invitrogen | 31985 | |
| Fugene HD | Roche Group | 04 709 705 001 | |
| Hexadimethrine bromide (Polybrene) | Sigma-Aldrich | H9268 | |
| Chondroitin sulfate sodium salt from shark cartilage | Sigma-Aldrich | C4384 | |
| Blasticidin S | Fisher Scientific | BP 2647100 | |
| Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide (MTT) | Sigma-Aldrich | M2128 | |
| Igepal CA-630 | Sigma-Aldrich | I3021 |
References
- Davis, H. E., Rosinski, M., Morgan, J. R., Yarmush, M. L. Charged polymers modulate retrovirus transduction via membrane charge neutralization and virus aggregation. Biophys J. 86, 1234-1242 (2004).
- Marino, M. P., Luce, M. J., Reiser, J. Small- to large-scale production of lentivirus vectors. Methods Mol Biol. 229, 43-55 (2003).
- Landazuri, N., LeDoux, J. M. Complexation of retroviruses with charged polymers enhances gene transfer by increasing the rate that viruses are delivered to cells. J Gene Med. 6, 1304-1319 (2004).
- Ohnuki, M., Takahashi, K., Yamanaka, S. Generation and characterization of human induced pluripotent stem cells. Curr Protoc Stem Cell Biol. 4, 4A.2-4A.2 (2009).
- Hotta, A. EOS lentiviral vector selection system for human induced pluripotent stem cells. Nat Protoc. 4, 1828-1844 (2009).
- Reiser, J. Transduction of nondividing cells using pseudotyped defective high-titer HIV type 1 particles. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 15266-15271 (1996).
- Cullen, B. R. Journey to the center of the cell. Cell. 105, 697-700 (2001).
- Cronin, J., Zhang, X. Y., Reiser, J. Altering the tropism of lentiviral vectors through pseudotyping. Curr Gene Ther. 5, 387-398 (2005).
- Schambach, A. Lentiviral vectors pseudotyped with murine ecotropic envelope: increased biosafety and convenience in preclinical research. Exp Hematol. 34, 588-592 (2006).
- Koch, P., Siemen, H., Biegler, A., Itskovitz-Eldor, J., Brustle, O. Transduction of human embryonic stem cells by ecotropic retroviral vectors. Nucleic Acids Res. 34, e120-e120 (2006).
- Yoshimoto, T., Yoshimoto, E., Meruelo, D. Molecular cloning and characterization of a novel human gene homologous to the murine ecotropic retroviral receptor. Virology. 185, 10-17 (1991).
- Cepko, C. Large-scale preparation and concentration of retrovirus stocks. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 9, Unit 9.12-Unit 9.12 (2001).
- Doux, J. M. L. e, Landazuri, N., Yarmush, M. L., Morgan, J. R. Complexation of retrovirus with cationic and anionic polymers increases the efficiency of gene transfer. Hum Gene Ther. 12, 1611-1621 (2001).
- Zufferey, R. Self-inactivating lentivirus vector for safe and efficient in vivo gene delivery. J Virol. 72, 9873-9880 (1998).
