Summary
Les lentivirus sont un précieux outil de recherche pour explorer la fonction des gènes, mais les chercheurs peuvent souhaiter éviter la production de l'encodage des lentivirus pantropique connus ou soupçonnés oncogènes. Comme alternative, nous présentons un protocole de sécurité pour l'utilisation de lentivirus écotrope sur des cellules humaines modifiées pour exprimer des récepteurs mSlc7a1 écotrope.
Abstract
Des études souches et la biologie des cellules tumorales ont souvent besoin de transduction virale des cellules humaines avec des oncogènes connus ou suspectés, soulevant des questions de sécurité majeur pour le personnel de laboratoire. Lentivirus pantropique, comme le couramment utilisé VSV-G pseudotype, sont un outil précieux pour étudier la fonction des gènes, car ils peuvent transduire nombreux types cellulaires, y compris les cellules ne se divisent pas. Cependant, les chercheurs peuvent souhaiter éviter la production et la centrifugation de virus oncogènes pantropique encodage raison de la hausse des exigences de biosécurité de niveau et de manipulation des questions de sécurité. Plusieurs oncogènes puissants, y compris c-Myc et antigène T de SV40 grandes, sont connus pour augmenter la production de cellules souches pluripotentes induites (COPSi). Tous les autres connus iPSC induisant des modifications génétiques (Oct4, Sox2, KLF4, NANOG, LIN28, et la perte de fonction de p53) ont également des liens vers le cancer, les rendant de préoccupation de sécurité relativement élevé ainsi.
Bien que ces virus liés au cancer sont utiles dans l'étude de la reprogrammation cellulaire et de pluripotence, ils doivent être utilisés en toute sécurité. Pour répondre à ces questions de biosécurité, nous démontrons une méthode pour la transduction des cellules humaines avec des lentivirus écotrope, avec un accent supplémentaire sur un coût réduit et manipulation aisée. Nous avons produit des lentivirus écotrope avec titre suffisamment élevé pour transduire supérieure à 90% de cellules exprimant le récepteur humain exposé au virus, de valider l'efficacité de cette approche.
Lentivirus est souvent concentrés par ultracentrifugation; cependant, ce processus prend plusieurs heures et peuvent produire des aérosols infectieux à l'homme les chercheurs biomédicaux. Comme alternative, les particules virales peuvent être de manière plus sûre sur les cellules sédimentées par complexation avec le sulfate de chondroïtine et de polybrène (CS / PB). Cette technique augmente le titre fonctionnelle virale jusqu'à 3 fois dans des cellules exprimant de façon stable des récepteurs rétrovirus murin, avec le temps et le coût ajouté négligeables. La transduction des fibroblastes dermiques humains (HDFS) est améliorée en utilisant au maximum CS / PB concentrations d'environ 4 fois inférieure à la valeur optimale antérieurement pour des lignées cellulaires cancéreuses, ce qui suggère que la concentration du polymère doit être adaptée pour le type de cellules cibles d'intérêt. Nous avons donc décrire l'utilisation du bromure de tétrazolium-methylthiazolyldiphenyl (MTT) pour le dosage de la toxicité de polymère dans un type de cellules nouvelles. Nous observons la viabilité équivalent de HDFS après transduction virale en utilisant soit la complexation polymère ou la dose standard de polybrène (PB, 6 pg / ml), indiquant un minimum de toxicité aiguë.
Dans ce protocole, nous décrivons l'utilisation de lentivirus écotrope de la surexpression d'oncogènes dans les cellules humaines, la réduction des risques de biosécurité et d'augmenter le taux de transduction. Nous démontrons également l'utilisation de polymères pour améliorer la complexation transduction tout en évitant les aérosols formant centrifugation des particules virales.
Discussion
Recombinant GAMMARETROVIRUS écotrope à base de virus leucémie murine de Moloney (MLV) et ses récepteurs mSlc7a1 sont bien étudiés et largement disponible, ayant été utilisé pendant plus de 20 ans pour fournir des transgènes dans les cellules murines. GAMMARETROVIRUS écotrope a aussi été utilisée plus récemment pour offrir oncogènes dans les cellules humaines;. Dans le contexte de la reprogrammation cellulaire, l'utilisation de mSlc7a1 pour éviter la production de virus oncogènes humains amphotropes hébergement est bien établi 4,5 Cependant, lentivirus fournit des avantages significatifs sur GAMMARETROVIRUS dans la transduction de populations de cellules réfractaires, y compris les 6 cellules primaires qui sont souvent la cible souhaitable pour la reprogrammation, parce que les lentivirus de pré-intégration complexe permet la transduction des cellules ne se divisant 7.
Les lentivirus ont été produites avec des dizaines de pseudotypes différents, y compris les MLV, dans un effort pour modifier le tropisme du virus, la toxicité et d'autres propriétés. 8 lentivirus écotrope MLV pseudotypé a été utilisé pour transduire des cellules de souris, 9, mais a rarement été utilisée sur des cellules humaines 10. Nous proposons donc l'utilisation de MLV-pseudotypées lentivirus écotrope comme un véhicule sûr, rentable et très efficace pour livrer des oncogènes connus ou présumés, y compris les facteurs cellulaires reprogrammation, pour les cellules humaines.
Il est essentiel de noter que ce protocole n'est pas entièrement éliminer le besoin de produire et d'utiliser des lentivirus pantropique, mais plutôt ce protocole sépare l'oncogène (s) du virus de la pantropique, isolation des chercheurs de potentiel d'auto-inoculation avec des virus liés au cancer. Le mSlc7a1 protéine et son homologue humain sont hSlc7a1 exprimée de manière ubiquitaire transporteurs d'acides aminés avec aucune tumorigénicité connus ou capacité à conférer un avantage de croissance sélective sur les cellules réceptrices, 11 mSlc7a1 prise de risque relativement faible pour l'incorporation dans virus amphotrope. Cette étape ajoutée peut être particulièrement utile dans les laboratoires manquent de virus dédiés ou des installations de culture tissulaire du niveau requis de biosécurité.
Dans certaines situations, il peut être possible d'éliminer complètement l'utilisation de virus pantropique en transfectant le plasmide Slc7a1 directement dans les cellules cibles, mais de nombreuses cellules qui seraient des cibles utiles de cette technique sont aussi réfractaires à la transfection. Comme alternative, la possibilité d'isoler les cellules transduites-Slc7a1 par sélection blasticidine signifie que VSV-G lentivirus pseudotypées peut être utilisée qu'une fois pour générer un stock de cellules exprimant le récepteur, après quoi le virus écotrope peut être utilisée en routine pour la transduction de ces cellules pour de nombreux expériences. Les chercheurs devraient toujours suivre leurs directives de sécurité institutionnel pour travailler avec toute lentivirus, quel que soit son tropisme.
Les titres de virus écotrope obtenus avec ce protocole sont modérément plus faible que le virus VSV-pseudotypées, généralement à 10-20% du titre du virus pantropique, en accord avec les études précédentes. 9 Ces titres ont été mesurés dans les cellules humaines transduites avec Slc7a1 stablement, de sorte que le plus faible titre observé pour le virus écotrope peut être en partie due à l'expression variée du gène du récepteur dans les cellules cibles. Néanmoins, les titres viraux obtenus dans notre protocole sont plus que suffisantes pour la plupart des applications et conduire à la transduction de la majorité des cellules, dans certains cas> 90% des cellules.
Centrifugation basé techniques sont couramment utilisées pour concentrer les particules virales. Toutefois, la centrifugation nécessite plusieurs heures, génère des aérosols infectieux, et peut entraîner une perte importante de particules virales. 12 Comme alternative, la complexation avec CS / PB peut être utilisé pour améliorer la transduction sans altérer le tropisme viral. 3 Cette méthode est rapide (5 minutes ) et peu coûteux (0,03 $ par tranche de 10 virus ml), tandis qu'environ tripler le titre observé. Aucun équipement spécial ou de réactifs de propriété sont nécessaires, et nous avons observé un minimum de toxicité aiguë après exposition des HDFS à CS / PB, en accord avec des travaux antérieurs dans d'autres lignées cellulaires. 13 Un inconvénient potentiel de ce protocole est que certains complexes visibles au microscope polymères adhèrent à les cellules pendant plusieurs jours dans la culture. Nous ne pouvons pas exclure la possibilité que ces complexes, tout en n'étant pas manifestement toxiques pour les cellules, peuvent avoir des effets plus subtils sur les processus cellulaires.
Ici, nous avons décrit une méthodologie pour sûr et efficace de transduction des cellules humaines avec des facteurs oncogènes. Cette approche devrait être d'une grande utilité pour les chercheurs qui étudient les oncogènes et biologie des cellules souches, y compris les cellules iPS.
Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Le financement de ce projet était prévu par le California Institute for Regenerative.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pLenti6/UbC/mSlc7a1 | Addgene | 17224 | Murine MLV receptor |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | VSV-G envelope |
| pCMV-dR8.91 | Addgene | D. Trono lab14
Packaging plasmid (equivalent plasmid psPax2 is available from Addgene, Cat. Number 12260) |
|
| pHCMV-Ec–nv | Addgene | 15802 | Ecotropic envelope |
| FUGW | Addgene | 14883 | GFP control plasmid |
| OptiMEM | Invitrogen | 31985 | |
| Fugene HD | Roche Group | 04 709 705 001 | |
| Hexadimethrine bromide (Polybrene) | Sigma-Aldrich | H9268 | |
| Chondroitin sulfate sodium salt from shark cartilage | Sigma-Aldrich | C4384 | |
| Blasticidin S | Fisher Scientific | BP 2647100 | |
| Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide (MTT) | Sigma-Aldrich | M2128 | |
| Igepal CA-630 | Sigma-Aldrich | I3021 |
References
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