Summary
Lentiviren sind eine wertvolle Recherche-Tool für die Erkundung der Genfunktion, aber Forscher möge Produktion von pantropic Lentivirus Kodierung bekannten oder vermuteten Onkogene zu vermeiden. Als Alternative stellen wir ein sicheres Protokoll für die Verwendung von ecotropen Lentivirus auf menschliche Zellen geändert, um die ecotropen Rezeptor mSlc7a1 auszudrücken.
Abstract
Stamm-und Tumor-Zellbiologie Studien erfordern häufig virale Transduktion humaner Zellen mit bekannter oder vermuteter Onkogene, Erhöhung wichtigen Fragen der Sicherheit für das Laborpersonal. Pantropic Lentiviren, wie die häufig verwendeten VSV-G Pseudotyp, sind ein wertvolles Werkzeug zur Untersuchung der Genfunktion, weil sie vielen Zelltypen, einschließlich nicht-teilenden Zellen transduzieren. Allerdings können Forscher wollen Produktions-und Zentrifugation pantropic Viren kodieren Onkogene durch höhere Sicherheitsstufe Umgang mit Anforderungen und Fragen der Sicherheit zu vermeiden. Mehrere starke Onkogene, einschließlich c-Myc und SV40 large T-Antigen, sind bekannt, die Produktion von induzierten pluripotenten Stammzellen (IPSC) zu verbessern. Alle anderen bekannten iPSC-induzierenden genetischen Veränderungen (Oct4, Sox2, Klf4, NANOG, LIN28 und p53 Verlust der Funktion) auch Links zu Krebs, so dass sie relativ hoher Sicherheit betreffen, sowie.
Während diese im Zusammenhang mit Krebs Viren nützlich beim Studium der Reprogrammierung und Pluripotenz sind, müssen sie sicher verwendet werden. Um diese Fragen der biologischen Sicherheit, zeigen wir eine Methode zur Transduktion humaner Zellen mit ecotropen Lentivirus, mit zusätzlichem Schwerpunkt auf reduzierte Kosten und eine bequeme Handhabung. Wir haben ecotropen Lentivirus mit einer ausreichend hohen Titer produziert, um mehr als 90% der transduzieren-Rezeptor-exprimierenden menschlichen Zellen mit dem Virus, der Validierung der Wirksamkeit dieses Ansatzes.
Lentivirus ist oft durch Ultrazentrifugation konzentriert, allerdings dauert dieser Vorgang mehrere Stunden und kann Aerosole Infektionskrankheiten des Menschen biomedizinische Forscher produzieren. Als Alternative, virale Partikel können mehr sicher auf Zellen werden durch Komplexierung mit Chondroitinsulfat und Polybren (CS / PB) sedimentiert. Diese Technik erhöht die funktionelle virale Titer von bis zu 3-fach in den Zellen stabil exprimieren Mäuse-Retrovirus-Rezeptor, mit vernachlässigbaren zusätzlichen Zeit-und Kosten. Transduktion von humanen dermalen Fibroblasten (HDF) ist maximal erweitert mit CS / PB-Konzentrationen etwa 4-fach niedriger als der optimale Wert zuvor für Krebszelllinien gemeldet, was darauf hindeutet, dass Polymer-Konzentration für die Zielzelle Art der Verzinsung sollte titriert werden. Deshalb beschreiben die Verwendung von methylthiazolyldiphenyl-Tetrazolium Bromid (MTT) zum Testen auf Polymer-Toxizität in einem neuen Zelltyp. Wir beobachten, entspricht Lebensfähigkeit der HDF nach einer viralen Transduktion entweder mit Polymer-Komplexierung oder der Standard-Dosierung von Polybren (PB, 6 pg / ml), was darauf hinweist minimal akute Toxizität.
In diesem Protokoll, beschreiben wir die Verwendung von ecotropen Lentivirus für die Überexpression von Onkogenen in menschlichen Zellen, wodurch die biologische Sicherheit Risiken und die Erhöhung der Transduktion Rate. Wir zeigen auch die Verwendung von Polymer-Komplexierung Transduktion zu verbessern und gleichzeitig die Vermeidung aerosolbildende Zentrifugation von Viruspartikeln.
Discussion
Rekombinante ecotropen gammaretrovirus auf Moloney Maus-Leukämie-Virus (MLV) und sein Rezeptor mSlc7a1 Basis sind gut untersucht und überall erhältlich, mit mehr als 20 Jahren verwendet worden, um Transgenen auf murine Zellen liefern. Ecotropen gammaretrovirus wurde auch in jüngerer Zeit, um Onkogene, menschliche Zellen zu liefern verwendet;. Im Rahmen der Reprogrammierung, die Verwendung von mSlc7a1 zu Generation amphotropen Virus beherbergen menschlichen Onkogene zu vermeiden, ist gut etabliert 4,5 Allerdings sieht Lentivirus erhebliche Vorteile gegenüber gammaretrovirus in transduzierenden feuerfesten Zellpopulationen, 6 einschließlich Primärzellen, die oft wünschenswert, Ziele für die Neuprogrammierung, weil die lentiviralen Präintegrationskomplexes ermöglicht Transduktion von nicht-teilenden Zellen. 7
Lentiviren haben mit Dutzenden von verschiedenen Pseudotypen, einschließlich MLV, in dem Bemühen, Virus Tropismus, Toxizität und andere Eigenschaften. 8 MLV-pseudotypisiert ecotropen Lentivirus wurde verwendet, um Zellen der Maus, 9 transduzieren, hat aber nur selten auf menschliche Zellen verwendet worden verändern produziert . 10 Wir schlagen daher die Verwendung von MLV-pseudotypisiert ecotropen Lentivirus als eine sichere, kostengünstige und hocheffiziente Fahrzeug bekannter oder vermuteter Onkogene, einschließlich der Reprogrammierung Faktoren, die menschliche Zellen zu liefern.
Es ist wichtig zu beachten, dass dieses Protokoll nicht vollständig beseitigen die Notwendigkeit zu produzieren und zu nutzen pantropic Lentivirus, sondern trennt dieses Protokoll das Onkogen (s) aus dem pantropic Virus, isolierende Forscher vor möglichen Selbst-Impfung mit dem Krebs-verwandten Viren. Das Protein mSlc7a1 und seine menschliche Homolog hSlc7a1 sind ubiquitär Aminosäure-Transporter ohne bekannte Tumorigenität oder Fähigkeit, ein selektives Wachstum Vorteil Empfänger-Zellen übertragen, 11 machen mSlc7a1 von relativ geringem Risiko für den Einbau in amphotrope Virus exprimiert. Dieser zusätzliche Schritt kann besonders nützlich in Labors fehlen gewidmet Virus oder Gewebekultur Einrichtungen der erforderlichen Sicherheitsstufe.
In manchen Situationen kann es möglich sein, vollständig zu eliminieren die Verwendung von pantropic Virus durch Transfektion der Slc7a1 Plasmid direkt in Zielzellen, jedoch sind viele Zellen, die nützliche Ziele dieser Technik werden auch feuerfeste der Transfektion. Als Alternative, die Fähigkeit zu isolieren Slc7a1-transduzierten Zellen durch Blasticidin Auswahl bedeutet, dass VSV-G pseudotypisiert Lentivirus einmal verwendet werden kann, um einen Bestand von Rezeptor-exprimierenden Zellen, nach denen ecotropen Virus routinemäßig eingesetzt werden können, um diese Zellen für viele transduzieren generieren Experimente. Forscher sollten immer nach ihrer institutionellen Sicherheit Richtlinien für die Arbeit mit einem Lentivirus, unabhängig von ihrer Tropismus.
Titer ecotropen Virus mit diesem Protokoll erreicht werden moderat niedriger als VSV-pseudotypisiert Virus, in der Regel 10-20% des pantropic Virustiter, in Übereinstimmung mit früheren Studien. 9 Diese Titer in menschlichen Zellen wurden gemessen stabil transduzierten mit Slc7a1, so dass die unteren beobachtet Titer für ecotropen Virus kann teilweise durch vielseitige Ausdruck der Rezeptor-Gen in die Zielzellen. Dennoch sind die viralen Titer in unserem Protokoll erreicht mehr als ausreichend für die meisten Anwendungen und führen zu Transduktion der Mehrzahl der Zellen, in einigen Fällen> 90% der Zellen.
Centrifugation-basierte Techniken werden häufig verwendet, um virale Partikel zu konzentrieren. Allerdings erfordert Zentrifugation mehrere Stunden, erzeugt infektiöse Aerosole, und kann zu einem erheblichen Verlust der viralen Partikel führen. 12 Als Alternative Komplexierung mit CS / PB kann zur Transduktion ohne dass virale Tropismus zu verbessern. 3 Diese Methode ist schnell (5 Minuten ) und preisgünstig ($ 0,03 pro 10 ml-Virus), während etwa einer Verdreifachung der beobachteten Titer. Keine besondere Ausrüstung oder proprietären Reagenzien erforderlich sind, und wir beobachteten minimal akuten Toxizität nach der Exposition des HDF zu CS / PB, in Übereinstimmung mit früheren Arbeiten in anderen Zelllinien. 13 Ein potenzieller Nachteil dieses Protokolls ist, dass einige mikroskopisch sichtbare Polymer-Komplexe zu halten die Zellen für mehrere Tage in Kultur. Wir können nicht ausschließen, dass diese Komplexe, die zwar nicht offen toxisch auf die Zellen, können subtilere Effekte auf zellulärer Prozesse haben.
Hier haben wir eine Methodik zur sicheren und effizienten Transduktion humaner Zellen mit onkogenen Faktoren beschrieben. Dieser Ansatz sollte von großem Nutzen für Forscher studieren Onkogene und Stammzellbiologie einschließlich iPS-Zellen sein.
Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Die Finanzierung für dieses Projekt wurde von der California Institute for Regenerative Medicine zur Verfügung gestellt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pLenti6/UbC/mSlc7a1 | Addgene | 17224 | Murine MLV receptor |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | VSV-G envelope |
| pCMV-dR8.91 | Addgene | D. Trono lab14
Packaging plasmid (equivalent plasmid psPax2 is available from Addgene, Cat. Number 12260) |
|
| pHCMV-Ec–nv | Addgene | 15802 | Ecotropic envelope |
| FUGW | Addgene | 14883 | GFP control plasmid |
| OptiMEM | Invitrogen | 31985 | |
| Fugene HD | Roche Group | 04 709 705 001 | |
| Hexadimethrine bromide (Polybrene) | Sigma-Aldrich | H9268 | |
| Chondroitin sulfate sodium salt from shark cartilage | Sigma-Aldrich | C4384 | |
| Blasticidin S | Fisher Scientific | BP 2647100 | |
| Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide (MTT) | Sigma-Aldrich | M2128 | |
| Igepal CA-630 | Sigma-Aldrich | I3021 |
References
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