Summary
Lentiviruses जीन समारोह की खोज के लिए एक मूल्यवान अनुसंधान उपकरण हैं, हालांकि, शोधकर्ताओं pantropic lentivirus एन्कोडिंग में जाना जाता है या संदिग्ध ओंकोजीन के उत्पादन से बचने के लिए इच्छा हो सकती है. एक विकल्प के रूप में, हम ecotropic lentivirus ecotropic रिसेप्टर mSlc7a1 व्यक्त संशोधित मानव कोशिकाओं पर प्रयोग के लिए एक सुरक्षित प्रोटोकॉल उपस्थित थे.
Discussion
पुनः संयोजक ecotropic Moloney murine लेकिमिया वायरस (MLV) और उसके रिसेप्टर mSlc7a1 पर आधारित gammaretrovirus और अच्छी तरह से अध्ययन कर रहे हैं व्यापक रूप से उपलब्ध है, 20 से अधिक वर्षों के लिए इस्तेमाल किया गया murine कोशिकाओं को transgenes उद्धार. Ecotropic gammaretrovirus भी अधिक हाल ही में इस्तेमाल किया गया है मानव कोशिकाओं को ओंकोजीन देने, सेलुलर reprogramming की संदर्भ में, mSlc7a1 का उपयोग amphotropic शरण वायरस मानव ओंकोजीन की पीढ़ी से बचने के लिए अच्छी तरह से स्थापित है 4,5 हालांकि, lentivirus gammaretrovirus अधिक महत्वपूर्ण लाभ प्रदान करता है दुर्दम्य सेल आबादी, 6 सहित प्राथमिक कोशिकाओं है कि अक्सर reprogramming के लिए वांछनीय लक्ष्य, transducing क्योंकि lentiviral जटिल पूर्व एकीकरण की अनुमति देता है में गैर विभाजित कोशिकाओं के पारगमन 7.
Lentiviruses अलग pseudotypes के दर्जनों MLV सहित, एक करने के लिए वायरस tropism, विषाक्तता, और अन्य गुण 8 ecotropic MLV - pseudotyped lentivirus के लिए माउस कोशिकाओं, 9 transduce इस्तेमाल किया गया है लेकिन शायद ही कभी मानव कोशिकाओं पर प्रयोग किया गया है. बदल प्रयास में, के साथ उत्पादन किया गया है 10 इसलिए हम एक सुरक्षित, लागत प्रभावी, और अत्यधिक कुशल वाहन सेलुलर reprogramming कारकों सहित ज्ञात या संदिग्ध ओंकोजीन, मानव कोशिकाओं को देने के रूप में MLV pseudotyped ecotropic lentivirus के उपयोग का प्रस्ताव है.
बल्कि, इस प्रोटोकॉल pantropic वायरस से ओंकोजीन (एस) अलग, कैंसर से संबंधित वायरस के साथ संभावित आत्म टीका से शोधकर्ताओं को इन्सुलेट, यह महत्वपूर्ण है ध्यान दें कि इस प्रोटोकॉल पूरी तरह से pantropic lentivirus उत्पादन और उपयोग करने की आवश्यकता को खत्म नहीं करता है. प्रोटीन mSlc7a1 और उसके मानव homologue hSlc7a1 सर्वत्र कोई ज्ञात tumorigenicity या प्राप्तकर्ता कोशिकाओं पर एक चयनात्मक विकास लाभ प्रदान करने की क्षमता, 11 amphotropic वायरस में शामिल करने के लिए अपेक्षाकृत कम जोखिम बना mSlc7a1 के एमिनो एसिड के साथ ट्रांसपोर्टरों व्यक्त कर रहे हैं. यह जोडी कदम समर्पित आवश्यक जैव सुरक्षा स्तर के वायरस या टिशू कल्चर सुविधाओं की कमी प्रयोगशालाओं में विशेष रूप से उपयोगी हो सकता है.
कुछ स्थितियों में यह संभव हो सकता है पूरी तरह से Slc7a1 लक्ष्य कोशिकाओं में सीधे प्लाज्मिड transfecting द्वारा pantropic वायरस के उपयोग को समाप्त कर सकते हैं, तथापि, कई कोशिकाओं है कि इस तकनीक का उपयोगी लक्ष्य होगा भी अभिकर्मक के लिए आग रोक. एक विकल्प के रूप में, को अलग करने की क्षमता blasticidin चयन द्वारा कोशिकाओं Slc7a1 - transduced मतलब है कि VSV जी pseudotyped lentivirus एक बार इस्तेमाल किया जा सकता है रिसेप्टर व्यक्त कोशिकाओं, जिसके बाद ecotropic वायरस नियमित रूप से इस्तेमाल किया जा सकता है कई के लिए इन कोशिकाओं transduce के एक शेयर उत्पन्न प्रयोगों. शोधकर्ताओं ने हमेशा किसी भी lentivirus के साथ काम करने के लिए अपने संस्थागत सुरक्षा निर्देशों का पालन करना चाहिए, अपने tropism की परवाह किए बिना.
इस प्रोटोकॉल के साथ हासिल ecotropic वायरस के titers मामूली VSV pseudotyped वायरस, आम तौर पर पिछले अध्ययनों के साथ समझौते में pantropic वायरस टिटर के 10-20%, की तुलना में कम कर रहे हैं इन 9 titers मानव कोशिकाओं में मापा गया stably Slc7a1 के साथ transduced. तो, कम वायरस के लिए मनाया ecotropic टिटर आंशिक रूप से लक्ष्य कोशिकाओं में रिसेप्टर जीन के विभिन्न अभिव्यक्ति के कारण हो सकता है. बहरहाल, वायरल हमारे प्रोटोकॉल में प्राप्त titers सबसे अनुप्रयोगों के लिए पर्याप्त से अधिक कर रहे हैं और कोशिकाओं के बहुमत के पारगमन के लिए कुछ मामलों में, सीसा> कोशिकाओं के 90%.
Centrifugation आधारित तकनीकों का सामान्यतः वायरल कणों को ध्यान केंद्रित करने के लिए उपयोग किया जाता है. हालांकि, centrifugation कई घंटे की आवश्यकता है, संक्रामक एयरोसौल्ज़ उत्पन्न, और वायरल कणों के महत्वपूर्ण नुकसान में परिणाम कर सकते हैं के रूप में एक विकल्प है, सीएस / PB साथ complexation. वायरल tropism फेरबदल के बिना 12 से पारगमन को बढ़ाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है 3 इस विधि तेजी से (5 मिनट. ) और (10 मिलीलीटर वायरस के प्रति 0.03 डॉलर) सस्ती है, जबकि मोटे तौर पर मनाया टिटर tripling. कोई विशेष उपकरणों या स्वामित्व अभिकर्मकों की आवश्यकता होती हैं, और हम HDFs / सीएस पीबी प्रदर्शन के बाद अन्य सेल लाइनों में पिछले काम के साथ समझौते में कम से कम तीव्र विषाक्तता, मनाया 13 इस प्रोटोकॉल के एक संभावित दोष यह है कि कुछ microscopically दिखाई बहुलक परिसरों का पालन. संस्कृति में कई दिनों के लिए कोशिकाओं. हम संभावना है कि इन परिसरों, खुलकर कोशिकाओं को विषाक्त नहीं जबकि, सेलुलर प्रक्रियाओं पर अधिक सूक्ष्म प्रभाव हो सकता है बाहर शासन नहीं कर सकती.
यहाँ हम सुरक्षित और कुशलतापूर्वक oncogenic कारकों के साथ मानव कोशिकाओं transducing के लिए एक पद्धति में वर्णित है. ओंकोजीन आईपीएस कोशिकाओं सहित स्टेम कोशिका जीव विज्ञान के अध्ययन के शोधकर्ताओं के लिए महान उपयोगिता के इस दृष्टिकोण होना चाहिए.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
इस परियोजना के लिए अनुदान पुनर्योजी चिकित्सा के लिए कैलिफोर्निया संस्थान द्वारा प्रदान किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pLenti6/UbC/mSlc7a1 | Addgene | 17224 | Murine MLV receptor |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | VSV-G envelope |
| pCMV-dR8.91 | Addgene | D. Trono lab14
Packaging plasmid (equivalent plasmid psPax2 is available from Addgene, Cat. Number 12260) |
|
| pHCMV-Ec–nv | Addgene | 15802 | Ecotropic envelope |
| FUGW | Addgene | 14883 | GFP control plasmid |
| OptiMEM | Invitrogen | 31985 | |
| Fugene HD | Roche Group | 04 709 705 001 | |
| Hexadimethrine bromide (Polybrene) | Sigma-Aldrich | H9268 | |
| Chondroitin sulfate sodium salt from shark cartilage | Sigma-Aldrich | C4384 | |
| Blasticidin S | Fisher Scientific | BP 2647100 | |
| Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide (MTT) | Sigma-Aldrich | M2128 | |
| Igepal CA-630 | Sigma-Aldrich | I3021 |
References
- Davis, H. E., Rosinski, M., Morgan, J. R., Yarmush, M. L. Charged polymers modulate retrovirus transduction via membrane charge neutralization and virus aggregation. Biophys J. 86, 1234-1242 (2004).
- Marino, M. P., Luce, M. J., Reiser, J. Small- to large-scale production of lentivirus vectors. Methods Mol Biol. 229, 43-55 (2003).
- Landazuri, N., LeDoux, J. M. Complexation of retroviruses with charged polymers enhances gene transfer by increasing the rate that viruses are delivered to cells. J Gene Med. 6, 1304-1319 (2004).
- Ohnuki, M., Takahashi, K., Yamanaka, S. Generation and characterization of human induced pluripotent stem cells. Curr Protoc Stem Cell Biol. 4, 4A.2-4A.2 (2009).
- Hotta, A. EOS lentiviral vector selection system for human induced pluripotent stem cells. Nat Protoc. 4, 1828-1844 (2009).
- Reiser, J. Transduction of nondividing cells using pseudotyped defective high-titer HIV type 1 particles. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 15266-15271 (1996).
- Cullen, B. R. Journey to the center of the cell. Cell. 105, 697-700 (2001).
- Cronin, J., Zhang, X. Y., Reiser, J. Altering the tropism of lentiviral vectors through pseudotyping. Curr Gene Ther. 5, 387-398 (2005).
- Schambach, A. Lentiviral vectors pseudotyped with murine ecotropic envelope: increased biosafety and convenience in preclinical research. Exp Hematol. 34, 588-592 (2006).
- Koch, P., Siemen, H., Biegler, A., Itskovitz-Eldor, J., Brustle, O. Transduction of human embryonic stem cells by ecotropic retroviral vectors. Nucleic Acids Res. 34, e120-e120 (2006).
- Yoshimoto, T., Yoshimoto, E., Meruelo, D. Molecular cloning and characterization of a novel human gene homologous to the murine ecotropic retroviral receptor. Virology. 185, 10-17 (1991).
- Cepko, C. Large-scale preparation and concentration of retrovirus stocks. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 9, Unit 9.12-Unit 9.12 (2001).
- Doux, J. M. L. e, Landazuri, N., Yarmush, M. L., Morgan, J. R. Complexation of retrovirus with cationic and anionic polymers increases the efficiency of gene transfer. Hum Gene Ther. 12, 1611-1621 (2001).
- Zufferey, R. Self-inactivating lentivirus vector for safe and efficient in vivo gene delivery. J Virol. 72, 9873-9880 (1998).
