Summary
Bir
Abstract
Normal beyin fonksiyonu, sinir devreleri olgunlaştı ve rafine zaman doğum sonrası gelişim üzerinde de sadece büyük nöronal yollarda kurulan embriyonik gelişim dayanır, ama. Bu aşamada Misregulation gibi otizm ve şizofreni 1,2 gibi nörolojik ve psikiyatrik bozukluklara yol açabilir. Birçok genin prenatal beyin okudu ve birçok gelişim süreçleri 3-5 için çok önemlidir bulundu. Ancak, doğum sonrası beyin işlevi farelerde silinmesi genellikle neonatal gelişim sırasında ölümcül götüren kısmen ve erken gelişim kendi ihtiyacı postnatal analiz engellemektedir kısmen, büyük ölçüde bilinmemektedir. Bu engelleri aşmak için, bu genlerin floxed allel farelerde 6 oluşturulan ediliyor. Ifade Cre recombinase belirli hücre tipleri, koşullu silme postnatal beyin gen fonksiyonu çalışma elde edilebilir ki transgenik allel ile birleştirildiği zaman. Ancak bu yöntem, böylece fare beyni büyük bir ölçekte genetik analiz genişleme sınırlama, uygun genotipler ile fareler üretmek için ek allelleri ve ekstra zaman (3-6 ay) gerektirmektedir.
Burada postnatal beyin geliştirme, hızlı ve sistematik bir şekilde bu floxed allel çalışma viral-ifade Cre kullanan tamamlayıcı bir yaklaşım göstermektedir. Rekombinant adeno-ilişkili virüs (rAAVs) 7,8 kodlama Cre neonatal beyin içine enjekte edilerek, beynin farklı bölgelerinde ilgi gen silebilir. Viral titresi kontrol ve floresan protein işaretleyici coexpressing, biz aynı zamanda mozaik gen inaktivasyonu ve seyrek nöronal etiketleme elde edebilirsiniz. Bu yöntem, erken geliştirme birçok genin gereksinimi, dallanma ve döşeme, sinaps oluşumu ve arıtmanın yanı sıra, atlar ve bize aksonal ve dendritik büyüme de dahil olmak üzere, doğum sonrası beyin gelişiminde çok kritik süreçlerin kendi hücre otonom fonksiyon, çalışma sağlar. Bu yöntem, kendi laboratuvarı (yayınlanmamış) ve diğerleri 8,9 başarıyla kullanılmaktadır ve lentivirüs 9 yanı sıra, shRNA veya baskın olarak aktif proteinlerdeki 10 ifade gibi diğer virüsler, uzatılabilir . Ayrıca, elektrofizyoloji bu tekniği birleştiren yanı sıra yakın zamanda geliştirilen optik görüntüleme araçları 11 genetik yollar fare ve sıçanlarda sinir devresi gelişimi ve işlevi nasıl etkilediğini incelemek için yeni bir strateji, bu yöntem sağlar .
Protocol
1. Enjeksiyon için hazırlanması virüsler
- rAAVs önerilen ticari bir satıcıdan satın alındı, ancak kişinin kendi laboratuarında imal edilebilir onlar da (aşağıya tartışma bakınız). Virüs çözümü genellikle mililitrede ~ 1x10 12 genom kopya (GC / ml) bir titrede üretilir ve tam titresi hücrelerinin çok sayıda işlemek için kullanılan olabilir. Alternatif olarak, seyrek etiketleme istenilen düzeyde üretmek için seyreltilmiş olabilir. Kullanıcı tarafından belirlenen uygun seyreltme gerekir, ancak 1:10 seyreltme başlanması tavsiye edilir.
- Kullanmadan önce buz üzerinde virüs hemen çözülmesini sağlayın. Virüs çözümü istenen ön sulandırma hacmi küçük bir (~ 250μl) PCR tüp içine aktarın. Bir doku kültürü kaputu steril DPBS uygun bir hacmi kullanarak virüs çözümü sulandırınız. Sulandırılmış virüs çözümü gerekli olana kadar buz üzerinde saklayın.
NOT: tüm virüsleri taşıma, kurum tarafından onaylanmış bir biyogüvenlik protokolü uyarınca yapılmalıdır
2. Şırınga yükleme ve ekipman montajı
- Cam şırınga pistonu hafifçe çekerek yükleme iğne bağlayın ve PCR tüp virüs çözümü hazırlamak. Hava çok küçük bir kabarcık şırınga görülebilir kadar pistonu çekerek, bu çözüm şırınga ve yükleme iğne sol olmadığını gösterir. Alternatif olarak, küçük bir miktarda inert boya görünür hale getirmek için çözüm olabilir.
NOT: küçük bir PCR tüp olarak kullanılmalıdır yükleme iğne genellikle çoğu diğer tüplerin alt ulaşmak için yeterince uzun değildir. - Kaldır yükleme iğne ve şırınga tutucu ile güvence, bir şırınga pompası şırınga blok şırınga.
- Şırıngaya bağ hortumun bir ucunu nazikçe, iğne tutucu diğer ucunu takın. Iğne tutucu içine bir iğne takın. Enjeksiyon iğne ucu, doğrudan iğne tutucu bağ tüp içinde sonuna başvurmalısınız.
- Yavaş yavaş bağ tüp yoluyla çözüm itmek için piston elle bastırın. Çözüm küçük bir damla, bir iğne ucu görünür kadar itin.
- Dikkatle itici blok yanında piston konumu ve itici blok dirseğini ile sabitleyin.
- Enjeksiyon parametrelerini ayarlayın: enjeksiyon oranı yaklaşık 8μl/min (~ 130nl / s); enjeksiyon hacmi genellikle 1-2ul; şırınga boyutu için (kılavuzlar için şırınga pompası kılavuzuna bakın) kullanarak uygun şırınga çapı seçin.
- Ocak ayarlayın ~ 38 ° C ve iyileşme döneminde yavrular korumak için, bir kağıt havlu veya ince bir bariyer ile kaplayın.
3. Enjeksiyon prosedürü ve yavru kurtarma
- P0 ve P1 fare yavrular, bir IACUC onaylanan protokole soğuk anestezi onlara tabi enjeksiyon için hazırlayın. Birkaç kağıt havlu, su ve buz üzerinde yer ile nemlendirin. Yavrular istenilen sayıda (4-5) (ayrı tutmak) kağıt havlu yerleştirin ve hafifçe nemli kağıt havlu ile kaplıdır, böylece yavrular üzerine kağıt havlu kat. Kağıt havlu üstüne hafifçe ezilmiş buz bir miktar yerleştirin ve yavrular yaklaşık 5 dakika boyunca inkübe edin. Yavrular 15 dakika kadar buz üzerinde saklanır ve daha sonra ince kurtarmak olabilir.
- Yavru yeterince uyuşturulduktan sonra, bir montaj bloğu yerleştirin (normalde 15ml tüpleri tutan plastik bir blok kullanın) ve enjeksiyon için en iyi erişim için pozisyon. Korteks için beyincik için blok kenarına yavru kafatasının arkasına daha iyi bir erişim sağlamak için baş pozisyonu yardımcı olur, karın hayvan düz koymak için en kolay yoldur. Istenirse yavru bir bant yardımı ile yerine sabitlenir olabilir.
- Iğne elle diğer elinizle istediğiniz siteye kafatası yoluyla takılı iken tek elle yerde yavru kafa tutun. Enjeksiyon sırasında hareket etmesini engellemek için cildin sıkı çekmek için yararlıdır. Korteks için gelecek enjeksiyonları yardımcı olacak, kafatası lambda dikiş gibi iyi tanımlanmış bir anatomik işaretine göre enjeksiyonları yapmak için yararlıdır. Beyincik dokusu colliculus doğrudan kaudal yatan ince bir şerit olarak kafatası yoluyla görülebilir. Iğne takılı olmalıdır derinliği bireysel hayvanlar ve suşları arasında biraz değişir ve iğne üzerinde önceden belirlenmiş belirteçleri ile ölçülür olabilir, ancak biz korteks ve serebellum ~ 0.5 derinliği bulmak yüzeyinden 1mm genellikle uygundur. Diğer siteler için ekleme derinliği son kullanıcı tarafından deneysel olarak tespit edilmelidir.
NOT: iğne kafatası kolayca nüfuz gerektiğini, yoksa bu hayvan zarar verebilir, çok zor TMEY. Iğne yeniden konumlandırmak ve yavaşça tekrar deneyin. - Virüs çözümü enjekte edilir. Enjeksiyon başlatmak.pompa START düğmesine basarak veya bir ayak pedalı karartıcı, enjektör kullanılan basınç model bağlı ed. Bir ayak pedalı yokluğunda bir meslektaşım enjeksiyon etkileyebilir gereksiz el hareketleri en aza indirmek için düğmeye basarak yardımcı olması tavsiye edilir.
- Seçilen hacim enjekte edildikten sonra, birkaç saniye için iğne yerde tutmak ve daha sonra yavaşça yavaşça kaydırarak iğneyi çıkarın. Gereksiz hareketleri en aza indirmek için yavrunun kafasını tutmak için emin olun. Enjeksiyon ekipmanı temizlenmeli ve sterilize etanol ile deneyler arasındaki yara küçük olduğundan, antiseptik kullanımı gereksizdir.
- ~ 38 sıcaklık set ile kapalı ocak yavru yerleştirin ° C kurtarma, genellikle 5-10 dakika kadar sıcak. Bu süre zarfında diğer yavrular enjekte devam edebilir.
- Yavruların hepsi iyileşti sonra (bunlar pembe ve hareketli olmalıdır), ev yataklar bir kısmını almak ve yavrular hafifçe ovalayın. Bir grup olarak yavrular anne dönün.
NOT: Bu yavrular anne onları geri dönen ve bir grup olarak onlara geri dönmek için önce sıcak ve ev yataklar maruz emin olmak için çok önemlidir. Bunu yapmadığınız takdirde yavrular yaralanmasına ya da öldüren anne neden olabilir.
4. Ekipman temizliği
- Enjeksiyon tamamlanır ve yavrular annelerinin iade edilmiş sonra, tam olarak aseton veya% 70 etanol ile şırınga yükleyerek enjeksiyon kurulum temiz. Her zaman taze solüsyon kullanarak çözüm, enjeksiyon kurulum birkaç kez yıkayın. Bu kalan virüs çözümü kaldırmak ve çökeltileri. Aseton veya etanol buharlaşır.
NOT: Aseton temizlik için tercih edilen, ancak kurulum siyanoakrilat yapıştırıcılar gibi herhangi bir aseton duyarlı bileşenleri kullanır, o zaman bu adımlar için% 70 etanol kullanın. - Biohazard uygun bir kap içinde, çamaşır suyu ve iptal atık ile çalışma alanı dezenfekte edin.
5. Analiz
- IACUC onaylanmış bir ötenazi yöntemi kullanılarak istenilen yaşta hayvanların Kurban. Perfüzyon fiksasyon, özellikle yetişkin hayvanların enfekte nöronlar, daha sonra görselleştirme yardımcı olmak için tavsiye edilir.
- Standart immün prosedürleri floresan sinyalini yükseltmek için kullanılıyor olabilir. Kısaca, PBS +% 1 Triton X-100 ile 100 mikron vibratome bölümleri yüzen permeabilize ve PBS +1% Triton X-100% 10 normal keçi serumu bloke. Bölüm 4 geceleme primer antikorlar ° C, yıkama ve engelleme ek çözüm engelleme inkübe edilir. Bölüm, sonra oda sıcaklığında 2 saat için sekonder antikor ile çözüm engelleme inkübe iyice yıkanır, kızaklar üzerinde monte edilmiş ve anti-solmaya montaj medya dakika muamele edilir. Cryosections etiketli nöronlar da görselleştirmek için kullanılabilir, ancak endojen floresan kaybolabilir.
6. Temsilcisi Sonuçlar:
Başarılı bir enjeksiyon prosedürü gözlemlenebilir doku hasarı veya hayvansal diğer kötü etkileri ile enjeksiyon yerinde bölgedeki nöronların sağlam enfeksiyonu üretecektir. Şekil 1'de gösterildiği gibi, enfeksiyonun yayılmasını çeşitli anatomik siteleri rAAV8-Cre enjekte Cre-muhabiri fareler (ROSA26R) 12 görülebilir. Korteks ve üstün colliculus gibi belirli bölgelerde, içine enjeksiyon, genellikle komşu bölgeler (Şekil 1A-B) minimal yayılması ile yerel enfeksiyonlar oluşturur. Yüksek titreye virüs çözümü kullanılması daha muhtemeldir (Şekil 1A) hipokampus gibi bitişik olan alanlarda, enfeksiyon yapar. ROSA26R muhabiri fareler (Şekil 1C-D) orta hat serebellar rAAV8 Cre enjeksiyon gösterildiği gibi, tipik olarak enjeksiyon yeri yakınında kalır seyrek enfeksiyon düşük titreye virüs çözümü sonuçları, Enjeksiyon. Biz muhabiri genler enfeksiyon, rekombinasyon ve ifade nispeten hızlı bir şekilde oluşabilir düşündüren, rAAV8-Cre enjeksiyondan sonra 2 gün içinde ROSA26R muhabiri farelerde rekombinasyon gözlemledik. Ayrıca, başarılı floxed koşullu allel olmayan bir ROSA lokustaki gen silme etkilerini incelemek amacıyla bu tekniği kullandık, sonuçları başka bir yerde ilan edilecektir.
Enfekte hücrelerin sayısı enjekte viral çözüm titresi ile ilişkili olmalıdır. Örneğin, yüksek titresi çözümleri, beyincik farklı floresan proteinleri ifade iki rAAV8 virüslerinin bir karışımı enjekte farklı (Şekil 2A) etiketli birçok Purkinje hücreleri bozar. Aksine, düşük titresi virüs solüsyon enjekte tek hücre (Şekil 2B) görselleştirmek yardım etmek için seyrek enfeksiyona neden olabilir. Floresan etiketli nöronlar taze kesilmiş, canlı doku (Şekil 2B) doğrudan gözlenemeyen veya geniş alan veya ortak, daha sonra görüntü elde etmek için endojen floresan sinyalleri güçlendirmek için immün tabi tutulabilirnOdak floresan mikroskobu (Şekil 2A, Şekil 3A-C). Son olarak, rAAV8 ince süreçlerin güçlü etiketleme (Şekil 3A-C) ile kortekste nöron tipleri çeşitli bulaştırma yeteneğine sahiptir.
Şekil 1: P0 rAAV8-Cre enjekte edildi ROSA26R muhabiri farelerin beyin LacZ boyama Cre aktivite ve enfeksiyon yerini göstermektedir.
- P14 beyin yüksek titresi (1x10 12 GC / ml), korteks ve üstün colliculus içine enjeksiyon gösteren bir geniş alan sagital görünüm . Yüksek titresi virüs komşu alanlarda aynı zamanda enfekte olacağını daha olası hale getirir.
- Alt titresi (1x10 11 GC / ml) enjekte P14 korteksin sagital kesiti, virüs yaymak için daha az bir lokal enfeksiyon gösterir .
- Düşük titreye sahip orta hat (1x10 9 GC / ml) virüs çözümü enjekte P28 beyincik wholemount görünümü enfeksiyon seyrek ve genellikle enjeksiyon yerinde yakın kaldığını gösterir.
- C beyinciğin orta hat sagittal görünüm). Genellikle sadece Purkinje hücreleri rAAV8 tarafından enfekte unutmayın.
Şekil 2: floresan proteinleri ifade rAAV8 yüksek ve düşük titreleri ile enjeksiyon Serebellar etiketleme.
- EGFP (yeşil) ve DsRed (kırmızı) ifade eden bir karışımı iki virüs ile enfekte P21cerebellum sagital bölümü. Purkinje hücreleri çok sayıda enfekte virüslerin yüksek titresi karışımı kullanılmıştır.
- Çok düşük titreye viral enfeksiyon canlı P14 beyincik Purkinje hücre diseksiyonu sonra hemen görüntülenmiş.
Şekil 3: rAAV8-DsRed Kortikal etiketleme.
P0 az rAAV8-DsRed bulaşmış olan bir P21 korteksin koronal bölümlerde çeşitli kortikal nöron tipleri örnekleri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada sunulan yenidoğan viral enjeksiyon yöntemi, doğum sonrası beyin gelişimi ve çalışması için in vivo mozaikleri oluşturmak için basit ve hızlı bir şekilde sağlar . Bu yöntem yanı sıra şu anda proje 6 Hedefleme Yüksek Verimli Gen yoluyla alınıyor olduğunu mevcuttur floxed allellerin yararlanır . Cre transgenik ifade kullanımı ile karşılaştırıldığında, bu yöntem floxed allel taşıyan fareleri deneyler için doğrudan kullanılabildiği gibi, çeşitli hücre tipleri gen fonksiyonunu test etmek için hızlı bir yol sağlar ve tüm virüs enjeksiyon prosedürü baştan sona. bir saatin altında gerçekleştirilir. Buna ek olarak, enfekte hücrelerin sayısı, bireysel nöronların seyrek etiketleme sağlayan virüs, titresi değiştirerek kolayca kontrol edilebilir. Biz sadece örnek görüntüler nöronal morfoloji açıklanan rağmen, enfekte olmuş nöronların analiz dallanma ve döşeme, yanı sıra, omurga morfolojilerinden gibi sinaptik gelişme, aksonal ve dendritik büyüme de dahil olmak üzere birçok önemli gelişim süreçleri, genişletilebilir.
Prosedürün üç en kritik parçalar enjeksiyon yerinde, enjeksiyon ekipman güvenilirlik, ve yavruların hayatta kalma hedefleme doğruluğu. Ilk boy - doğruluk - en iyi deneyimi ile öğrenilir. Enjeksiyon ekipman güvenilirlik, aslında bir takunya, sızıntıları, ya da enjeksiyon öncesinde ekipmanları ile diğer sorunları olmadığından emin olmak gerektiğini ifade eder. Son olarak, Adım 3.7 'de belirtilen ipuçlarını takip eğer yavruların hayatta kalma genellikle bir sorun değildir.
Bu yordamı belirgin bir değişiklik, farklı genler ifade virüslerinin bir karışımı kullanmaktır. Örneğin, tek bir hayvan seyrek etiketli nakavt (yeşil) ve kontrol (kırmızı) hücreleri bir mozaik üretmek için iki virüs, rAAV-Cre-GFP ve rAAV-RFP, bir karışım enjekte edilebilir. Bu, özellikle yabani tip ve mutant allel aynı fare beyindeki nöronların morfolojik analizi için yararlı hale geleneksel gen tırnakları üzerinde tek hücre analizi için ayrı bir avantaj sağlamaktadır. Bu aynı zamanda bir sınırlama olabilir, ancak, gözlemlenebilir bir etkisi üretmek için çok sayıda nöron işlemek için gerekli olabilir hangi davranış çalışmaları, bir dilek gerçekleştirmek için. Biz yaş P4 Ancak, biz genellikle postnatal yaş 3 (P3) enjeksiyonları kadar gerçekleştirmek olduğunu bulmak ve kafatası genellikle çok kalın bir iğne ile kolayca ponksiyon. Ancak, belirli bir yaşta kafatası kalınlığı hayvandan hayvana değişebilir, bu nedenle bu sorun deneyci tarafından değerlendirilmesi gerekir.
Cre ifade virüs loxP-STOP-loxP allel ile çok sayıda floresan muhabiri fareler 13 üretilen edilmiştir ve floxed alleli ile dahil edilebilir ifade floresan proteinleri kullanarak ek olarak . Yeni allel de dahil olmak üzere uygun genotipler ile fareler elde etmek için gereken süreyi ekler olsa da, bu muhabir fareler aynı anda Cre aktivite ve etiket bireysel nöronlar izleyebilirsiniz.
Çünkü rekombinant rAAVs seçici tropizm, belirli bir rAAV serotip (Şekil 1D) seçerek farklı nöronal hücre tipleri anatomik bölgelerde etiketli olabilir. Özgüllük de farklı rehberleri kullanarak elde edilebilir. Buna ek olarak, böyle bir lentivirüs gibi diğer virüsler, nöronlar 10 bulaştırmak için kullanılabilir . Buradaki avantaj, bu virüsler Cre değil, aynı zamanda, shRNA baskın ve aktif genler gibi diğer genetik materyal, sadece ifade etmek için daha büyük DNA ekler taşıyabileceği. Ayrıca, yöntem koşullu ifade Cre hatları iyi kurulmuş yeni geliştirilen transgenik sıçan 14, kullanılabilir. Son olarak, bu kez tekniği laboratuarı kurulmuştur, daha fazla gibi in vivo olarak diğer analitik araçlar, iki-foton görüntüleme 11 ve / veya elektrofizyoloji, nöral devre gelişimi ve işlevi her genin işlevini çalışma ile kombine edilebilir
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma bir RO1 NIH (NINDS) hibesi ile desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| rAAV8-Cre, -GFP, -DsRed, | Vector Biolabs | #7060, #7061, custom order | http://www.vectorbiolabs.com |
| Harvard Pump 11 Plus | Harvard Apparatus | #702208 | (No foot pedal port) |
| Retinal Pigment Epithelium Injection Kit | World Precision Instruments, Inc. | RPE-KIT | Contains connective tubing, injection needles (36G), and needle holder |
| NanoFil Syringe, 100μl | World Precision Instruments, Inc. | NANOFIL-100 | Includes reusable loading needle |
| D-PBS | Invitrogen | 14040-117 | |
| GFP antibody | Aves | GFP-1020 | |
| DsRed antibody | Clontech Laboratories | 632496 | |
| Heating Block | VWR international | 97042-610 | |
| ROSA26R mouse | Jackson Laboratory | 003309 |
References
- Geschwind, D. H., Levitt, P. Autism spectrum disorders: developmental disconnection syndromes. Curr Opin Neurobiol. 17, 103-111 (2007).
- Giedd, J. N., Rapoport, J. L. Structural MRI of pediatric brain development: what have we learned and where are we going? Neuron. 67, 728-734 (2010).
- Chedotal, A., Richards, L. J. Wiring the brain: the biology of neuronal guidance. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2, (2010).
- Shen, K., Cowan, C. W. Guidance molecules in synapse formation and plasticity. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2, (2010).
- Chen, S. Y., Cheng, H. J. Functions of axon guidance molecules in synapse formation. Curr Opin Neurobiol. 19, 471-478 (2009).
- Guan, C., Ye, C., Yang, X., Gao, J. A review of current large-scale mouse knockout efforts. Genesis. 48, 73-85 (2010).
- Tenenbaum, L. Recombinant AAV-mediated gene delivery to the central nervous system. J Gene Med. 6, 212-222 (2004).
- Broekman, M. L., Comer, L. A., Hyman, B. T., Sena-Esteves, M. Adeno-associated virus vectors serotyped with AAV8 capsid are more efficient than AAV-1 or -2 serotypes for widespread gene delivery to the neonatal mouse brain. Neuroscience. 138, 501-510 (2006).
- Pilpel, N., Landeck, N., Klugmann, M., Seeburg, P. H., Schwarz, M. K. Rapid reproducible transduction of select forebrain regions by targeted recombinant virus injection into the neonatal mouse brain. J Neurosci Methods. 182, 55-63 (2009).
- Szulc, J., Aebischer, P. Conditional gene expression and knockdown using lentivirus vectors encoding shRNA. Methods Mol Biol. 434, 291-309 (2008).
- Pan, F., Gan, W. B. Two-photon imaging of dendritic spine development in the mouse cortex. Dev Neurobiol. 68, 771-778 (2008).
- Soriano, P. Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain. Nat Genet. 21, 70-701 (1999).
- Madisen, L. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nat Neurosci. 13, 133-1340 (2010).
- Tong, C., Li, P., Wu, N. L., Yan, Y., Ying, Q. L. Production of p53 gene knockout rats by homologous recombination in embryonic stem cells. Nature. 467, 211-213 (2010).
