Summary
一个
Abstract
不仅依赖于胚胎发育的主要神经通路建立正常的脑功能,但也发育时神经回路的成熟和完善。 Misregulation在这个阶段,可能会导致神经和精神疾病,如自闭症和精神分裂症1,2。许多基因已在胎儿的大脑研究,发现许多 3-5发育过程至关重要。然而,他们在出生后大脑功能在很大程度上是未知的,部分原因是因为他们在小鼠的缺失往往会导致新生儿发育期间,以杀伤力,部分原因是因为他们在早期发展的要求,阻碍了产后的分析。为了克服这些障碍,这些基因的floxed等位基因,目前正在生成在小鼠 6 。当结合表达Cre重组酶在特定的细胞类型,有条件的删除,可以实现在产后的大脑研究基因功能的转基因等位基因。然而,这种方法需要额外的等位基因和额外的时间(3-6个月),以产生适当的基因型的小鼠,从而限制了在鼠脑大规模扩展的遗传分析。
在这里,我们展示了一个互补的方法,使用病毒的表达Cre重组迅速,系统地研究这些floxed等位基因在出生后大脑发育。通过注入重组腺相关病毒(rAAVs)7,8编码的Cre新生儿的大脑,我们可以删除该基因在大脑的不同区域的利益。通过控制病毒滴度和共表达荧光蛋白标记,我们可以同时实现镶嵌基因的失活和稀疏神经元的标签。这种方法绕过了许多基因在早期发展的要求,使我们能够学习他们的细胞自主的功能在许多关键的过程,在出生后大脑发育,包括轴突和树突状增长,分支,和平铺,以及突触的形成和完善。该方法已成功地使用在我们自己的实验室(未公布结果)和其他8,9,并可以扩展到其他的病毒, 如 9,以及慢病毒的shRNA或主导活性蛋白 10的表达,。此外,通过与电相结合的技术,以及最近开发的光学成像工具11,这种方法提供了一个新的战略,以研究如何遗传途径影响神经电路的发展和在小鼠和大鼠的功能。
Protocol
1。准备用于注射的病毒
- rAAVs均购自商业供应商的建议,但他们也可以在自己的实验室中产生的(见下面的讨论)。 〜1 × 12,每毫升的基因组副本(GC /毫升)的滴度和病毒解决方案通常是生产,可在全滴度用来处理大量的细胞。此外,他们可能会被摊薄产生稀疏标签的理想水平。适当稀释,必须由用户决定,但建议开始1:10稀释。
- 使用前在冰上解冻病毒。转移到一个小(〜250μl)PCR管中的病毒解决方案所需的预稀释量。稀释病毒的解决方案,使用适当的音量在组织培养罩无菌DPBS。存储在冰块稀释病毒解决方案,直到需要它。
注意:处理所有病毒,应按照您的机构批准的与生物安全议定书进行
2。注射器装载和设备组装
- 加载针连接的玻璃注射器和PCR管的病毒解决方案,轻轻拉出柱塞。拉出柱塞,直到注射器可以看到一个非常小的泡沫,空气,这表明,所有的解决方案是在注射器中,并没有留在装载针。此外,少量的惰性染料可以被添加到解决方案,以使其可见。
注:应加载针通常没有足够长的时间,以达到大多数其它管子的底部使用一个小的PCR管。 - 卸下装载的的针头和地方注射器注射泵块注射器,安全注射器固定。
- 轻轻插入到注射器的连接管的一端插入另一端的持针器。插入注射针持针器。注射针到底应该直接接触的持针器的连接管内结束。
- 慢慢地压低柱塞手动推通过连接管的解决方案。推,直到小滴的解决方案是在注射针的尖端可见。
- 仔细柱塞推块的位置和推块支架的地方,它的安全。
- 设定注射参数:注射速度应约8μl/min(〜130nl / S);注射量一般为1 - 2ul;选择适当的注射器直径为您正在使用的注射器大小(见注射器泵手册的指引)。
- 设置电磁炉〜38 ° C和覆盖用纸巾或其他薄膜屏障,以保护幼崽,在恢复阶段。
3。注射程序和小狗恢复
- 通过对他们进行冷麻醉IACUC批准协议后,准备注射P0或P1鼠标幼仔。挫伤一些纸巾与水和冰的地方。广场上的纸巾(保持他们良好的分离)的幼崽所需的数字(4-5),并轻轻地折叠,使他们对幼崽的纸巾湿纸巾覆盖。轻轻地放置纸巾上的少量碎冰和孵化幼崽,大约5分钟。幼崽可以保持长达15分钟的上冰,收回罚款事后。
- 后小狗是足够的麻醉,放置在一个固定块(我们使用的泡沫塑料块,通常持有15毫升管)和注射部位的最佳途径,它的位置。皮层,它是最简单的方法,奠定其腹动物的单位,而小脑是很有帮助的小狗的头块的边缘位置,以提供更好的访问的头骨后部。小狗可能被固定在一个创可贴,如果需要的话。
- 一方面小狗的头,而用另一只手在所需的站点通过插入头骨针手动到位。它是有帮助的拉扯皮肤紧,以防止注射过程中移动。皮层,它是有益的,使一个明确的解剖标志,如颅骨的lambda缝合,注射,因为这将有助于在未来的注射。通过头骨小脑可以看出,作为一个组织直接躺在尾鳍的丘细条状。应插入针深度略有不同动物个体之间和株,可以通过针预定标记衡量,但皮质和小脑,我们发现,从表面的深度〜0.5 - 1毫米通常适合。其他网站的插入深度应确定实验的最终用户。
注:针应该轻易地穿透颅骨,如果它不,不推太难,因为这会伤害动物。重新定位针,轻轻再试一次。 - 注入病毒解决方案。该注射液是开始由按泵上的START键,或令人沮丧的脚踏板,根据模型的压力注射器使用。在一个脚踏板的情况下,建议有一个同事协助按下按钮,以尽量减少不必要的手部动作,可能会影响注射。
- 选定的卷已被注射后,保持在针几秒钟,然后轻轻滑动顺利取出针。务必抓住小狗的头,以尽量减少多余的动作。由于注射设备与乙醇的实验之间的清洗和消毒伤口小,使用防腐剂是不必要的。
- 放在有盖的电磁炉与温度设定在38〜小狗° C到温暖的恢复,通常5-10分钟。在此期间,您可能会继续注入其他幼仔。
- 所有的幼崽后已痊愈(他们应该是粉红色和移动)的家庭床上用品的一部分,并轻轻揉搓它的幼仔。返回的幼鼠的母亲为一组。
注:这是非常重要,以确保幼仔温暖和暴露在家里床上用品,返回他们的母亲和作为一个群体,他们返回之前。如果不这样做可能会导致伤害或杀死幼崽的母亲。
4。设备清洗
- 注射后是完整的和幼崽已返回他们的母亲,清洁,完全用丙酮或70%的乙醇加载注射器注射设置。通过注射几次安装的解决方案,每次使用新鲜的溶液冲洗。这将删除任何剩余的病毒解决方案,并沉淀。丙酮或乙醇,然后蒸发。
注:丙酮是首选的清洁,但如果你的安装使用任何丙酮敏感元件,如氰基丙烯酸酯粘合剂,然后用70%的乙醇对这些步骤。 - 消毒漂白水和丢弃废物的工作区,在一个适当的生物危害容器中。
5。分析
- 牺牲IACUC批准的安乐死方法所需年龄的动物。灌注固定,建议在以后的感染,特别是在成年动物神经元,可视援助。
- 标准的免疫程序,可用于荧光信号放大。简言之,100微米浮动vibratome部分,与PBS +1%Triton X - 100的的透和PBS +1%Triton X - 100的的10%正常山羊血清阻止。第孵育阻断抗体在4℃过夜,额外的清洗和阻塞的解决方案。部分,然后培养在阻塞的解决方案与二级抗体在室温下2小时,彻底洗净,在幻灯片上安装防褪色的安装媒体coverslipped。冰冻切片也可用于可视化标记的神经元,但内源性荧光可能会丢失。
6。代表性的成果:
一个成功的注射过程会产生强大的感染地区没有观察到的组织损伤或其他不良影响的动物在注射部位的神经元。如图1所示,可以观察到感染的蔓延,在创建记者小鼠(ROSA26R)rAAV8 - Cre重组注入不同解剖部位的12。到特定的地区,如皮层和上丘注射,通常产生并蔓延到最小邻近地区(图1A - B)的局部感染。高滴度的病毒解决方案的使用,使感染邻近地区,如海马,更容易(图1A)。注射用低滴度病毒感染稀疏解决的结果,通常保持注射部位附近,rAAV8 - Cre重组小脑注射ROSA26R记者小鼠(图1C - D)中线。我们观察ROSA26R记者小鼠重组注射rAAV8 - Cre重组后2天之内,建议,都可以发生感染,重组和报告基因的表达较快。此外,我们已经成功地使用这种技术研究在非 - 罗萨使用floxed有条件的等位基因位点基因缺失的影响,其结果将刊登在别处。
感染细胞的数量应与注入的病毒解决方案的滴度相关。例如,注射的两个rAAV8到小脑表达不同荧光蛋白的病毒的高滴度解决方案的混合感染浦肯野许多差异标记的细胞(图2A)。相反,注射低滴度病毒解决方案,可以在稀疏感染援助在可视化的单细胞(图2B)的结果。可直接观察到荧光标记的神经元在鲜切花,活组织(图2B),或可以受到免疫宽视场或合作,以提高以后的图像采集的内源性荧光信号nfocal荧光显微镜(图2A,图3A - C)。最后,rAAV8皮层与精细的工序强大的标签(图3A - C),在感染的神经元类型的各种能力。
图1:LacZ的ROSA26R记者在P0 rAAV8 - Cre重组注入老鼠的大脑中的染色表明Cre重组活动和感染的位置。
- 宽领域的矢状查看了P14的大脑呈现出高滴度(1 × 10 12 GC /毫升)注射到皮层和上丘。使用高滴度的病毒,使得它更可能是邻近地区也会被感染。
- P14的皮质矢状切面注射低滴度(1 × 10 11 GC /毫升),少传播病毒的演示与本地感染。
- 注射低滴度的中线(1 × 10 9 GC /毫升)病毒解决方案的一个P28小脑wholemount的观点表明,感染是稀疏的,和通常的注射部位附近。
- 在C小脑中线的矢状查看)。请注意,一般只Purkinje细胞rAAV8感染。
图2:rAAV8表达荧光蛋白的高与低滴度注射小脑标签 。
- 矢状切面的P21cerebellum两个病毒表达EGFP(绿色)和DsRed的(红色)的混合感染。高滴度的病毒混合感染的浦肯野细胞的大量。
- 一个在P14的生活非常低滴度病毒感染小脑浦肯野细胞成像后立即清扫。
图3:rAAV8 - DsRed的皮质标签。
各种皮层神经元类型的例子,在一个P21的皮层在P0 rAAV8 - DsRed的,是由感染冠状切片。
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Discussion
这里介绍的新生儿病毒注射方法提供了一个简单而快速的方式来产生体内马赛克产后大脑发育的研究。该方法需要利用floxed等位基因目前可用的,以及那些正在通过高通量基因靶向项目6。使用Cre转基因表达相比,这种方法提供了一种快速的方法来测试基因在不同细胞类型的功能,携带floxed等位基因的小鼠可直接用于实验,整个病毒注射过程从开始到结束,可在不到一小时完成。此外,感染细胞的数量,可以通过改变滴度的病毒,它允许单个神经元稀疏标签,很容易控制。虽然我们只描述的样本图像的神经元的形态分析,受感染的神经元可扩展到许多重要的发育过程,包括轴突和树突增长,分支和平铺,以及诸如脊柱形态发生突触发展。
程序的三个最关键的部分是针对注射部位,注射设备的可靠性,和幼崽的生存的准确性。第一个方面 - 精度 - 最好通过经验教训。注射设备的可靠性是指一个事实,就是必须确保有没有堵塞,渗漏,或与设备在注射之前,其他问题。最后,幼崽的生存通常不是一个问题,如果在步骤3.7中提到的提示之后。
此过程的一个明显的修改是使用表达不同的基因的病毒混合。的rAAV - CRE - GFP和rAAV - RFP的,两种病毒混合,例如,可以注入到人烟稀少标记基因敲除(绿色)和控制(红色)在一个单一的动物细胞产生马赛克。这提供了一个独特的优势,比传统的基因敲除单细胞分析,与野生型或突变的等位基因相同的小鼠大脑中的神经元的形态分析,尤其有用。这也可以限制,但是,如果要执行行为的研究,它可能需要操纵大量的神经元产生显着影响。我们发现,我们通常可以执行注射出生后3(P3),但是从年龄的P4和头骨上往往容易与注射针头穿刺太厚。然而,在某一年龄的头骨厚度,可以在动物不同,所以这个问题必须加以评估,实验者。
除了 使用荧光蛋白表达的Cre表达病毒,许多荧光记者小鼠的loxP位一站式loxP位等位基因已产生13和可纳入floxed等位基因。虽然包括新的等位基因增加所需的时间获得适当的基因型小鼠,可以同时监控这些记者小鼠Cre重组活动和标签的单个神经元。
由于选择性向性重组rAAVs,不同的神经细胞类型可以选择一个特定的rAAV血清型(图1D)在解剖区域标记。特异性也可以通过使用不同的促销员。此外,其他病毒,如慢病毒,可用于感染的神经元 10 。它的优点是,这些病毒可以携带较大的DNA插入表达不仅Cre重组,但还有其他遗传材料,如shRNA的和主导的活性基因。此外,这种方法也可用于新开发的转基因大鼠14日有条件地表达Cre重组线路没有很好地建立。最后,一旦这种技术是在实验室中成立,它可以进一步结合其他分析工具,如在体内 ,双光子成像11和/或电生理,神经回路的发育和功能研究每个基因的功能。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作是由来自美国国立卫生研究院研究所(NINDS)RO1的赠款支持。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
rAAV8-Cre, -GFP, -DsRed, | Vector Biolabs | #7060, #7061, custom order | http://www.vectorbiolabs.com |
Harvard Pump 11 Plus | Harvard Apparatus | #702208 | (No foot pedal port) |
Retinal Pigment Epithelium Injection Kit | World Precision Instruments, Inc. | RPE-KIT | Contains connective tubing, injection needles (36G), and needle holder |
NanoFil Syringe, 100μl | World Precision Instruments, Inc. | NANOFIL-100 | Includes reusable loading needle |
D-PBS | Invitrogen | 14040-117 | |
GFP antibody | Aves | GFP-1020 | |
DsRed antibody | Clontech Laboratories | 632496 | |
Heating Block | VWR international | 97042-610 | |
ROSA26R mouse | Jackson Laboratory | 003309 |
References
- Geschwind, D. H., Levitt, P. Autism spectrum disorders: developmental disconnection syndromes. Curr Opin Neurobiol. 17, 103-111 (2007).
- Giedd, J. N., Rapoport, J. L. Structural MRI of pediatric brain development: what have we learned and where are we going? Neuron. 67, 728-734 (2010).
- Chedotal, A., Richards, L. J. Wiring the brain: the biology of neuronal guidance. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2, (2010).
- Shen, K., Cowan, C. W. Guidance molecules in synapse formation and plasticity. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2, (2010).
- Chen, S. Y., Cheng, H. J. Functions of axon guidance molecules in synapse formation. Curr Opin Neurobiol. 19, 471-478 (2009).
- Guan, C., Ye, C., Yang, X., Gao, J. A review of current large-scale mouse knockout efforts. Genesis. 48, 73-85 (2010).
- Tenenbaum, L. Recombinant AAV-mediated gene delivery to the central nervous system. J Gene Med. 6, 212-222 (2004).
- Broekman, M. L., Comer, L. A., Hyman, B. T., Sena-Esteves, M. Adeno-associated virus vectors serotyped with AAV8 capsid are more efficient than AAV-1 or -2 serotypes for widespread gene delivery to the neonatal mouse brain. Neuroscience. 138, 501-510 (2006).
- Pilpel, N., Landeck, N., Klugmann, M., Seeburg, P. H., Schwarz, M. K. Rapid reproducible transduction of select forebrain regions by targeted recombinant virus injection into the neonatal mouse brain. J Neurosci Methods. 182, 55-63 (2009).
- Szulc, J., Aebischer, P. Conditional gene expression and knockdown using lentivirus vectors encoding shRNA. Methods Mol Biol. 434, 291-309 (2008).
- Pan, F., Gan, W. B. Two-photon imaging of dendritic spine development in the mouse cortex. Dev Neurobiol. 68, 771-778 (2008).
- Soriano, P. Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain. Nat Genet. 21, 70-701 (1999).
- Madisen, L. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nat Neurosci. 13, 133-1340 (2010).
- Tong, C., Li, P., Wu, N. L., Yan, Y., Ying, Q. L. Production of p53 gene knockout rats by homologous recombination in embryonic stem cells. Nature. 467, 211-213 (2010).