Summary
Een
Abstract
Een normale hersenfunctie vertrouwt niet alleen op de embryonale ontwikkeling als de belangrijkste neuronale paden zijn gevestigd, maar ook op de postnatale ontwikkeling bij het neurale circuits zijn gerijpt en verfijnd. Misregulation in dit stadium kan leiden tot neurologische en psychiatrische aandoeningen zoals autisme en schizofrenie 1,2. Veel genen zijn onderzocht in de prenatale hersenen en vond cruciaal belang voor vele ontwikkelingsprocessen 3-5. Echter, hun functie in de postnatale hersenen is grotendeels onbekend, mede omdat hun verwijdering in muizen leidt vaak tot sterfte tijdens de neonatale ontwikkeling, en deels omdat hun eis in de vroege ontwikkeling belemmert de postnatale analyse. Om deze obstakels, worden floxed allelen van deze genen op dit moment geproduceerd in muizen 6. In combinatie met transgene allelen die uitdrukken Cre recombinase in specifieke celtypen, voorwaardelijke verwijdering kan worden bereikt om gen-functie in de postnatale hersenen te bestuderen. Echter, deze methode vereist bijkomende allelen en extra tijd (3-6 maanden) voor het genereren van de muizen met de juiste genotypen, waardoor het beperken van de uitbreiding van de genetische analyse van een grote schaal in de hersenen van muizen.
Hier laten we zien een complementaire aanpak die viraal geuit Cre gebruikt om deze floxed allelen bestuderen snel en systematisch in postnatale ontwikkeling van de hersenen. Door het injecteren van recombinant adeno-geassocieerde virussen (rAAVs) 7,8 codering Cre in de neonatale hersenen, we zijn in staat om het gen van interesse in de verschillende gebieden van de hersenen te verwijderen. Door het beheersen van de virale titer en coexpressing een fluorescerend eiwit marker, kunnen we tegelijkertijd realiseren mozaïek-gen inactivatie en spaarzame neuronale etikettering. Deze methode omzeilt de eis van vele genen in de vroege ontwikkeling, en stelt ons in staat om te studeren hun cel autonome functie in een groot aantal kritische processen in de postnatale ontwikkeling van de hersenen, waaronder axonale en dendritische groei, vertakkingen, en tegels, maar ook synapsvorming en verfijning. Deze methode is met succes gebruikt in onze eigen lab (niet gepubliceerde resultaten) en anderen 8,9, en kan worden uitgebreid tot andere virussen, zoals lentivirus 9, evenals voor de uitdrukking van shRNA of dominante actieve eiwitten 10. Bovendien, door het combineren van deze techniek met de elektrofysiologie, alsook recent ontwikkelde optische beeldvorming tools 11, deze methode zorgt voor een nieuwe strategie om te onderzoeken hoe genetische pathways invloed neurale circuit de ontwikkeling en functie in muizen en ratten.
Protocol
1. Voorbereiden virussen voor injectie
- rAAVs werden gekocht bij de aanbevolen commerciële leverancier, maar ze kunnen ook worden geproduceerd in het eigen lab (zie bespreking hieronder). Het virus oplossing is meestal geproduceerd in een titer van ~ 1x10 12 exemplaren van het genoom per milliliter (GC / ml) en kan gebruikt worden op volle titer van een groot aantal van de cellen te manipuleren. Als alternatief kunnen zij worden verdund tot het gewenste niveau van schaars etikettering te produceren. De aangewezen verdunning moet worden bepaald door de gebruiker, maar een 1:10 verdunning wordt aanbevolen te beginnen.
- Onmiddellijk dooi virussen op ijs voor gebruik. Breng de gewenste pre-verdunningsvolume van het virus oplossing in een kleine (~ 250μl) PCR-buis. Verdun de virus-oplossing met behulp van een geschikt volume van steriele DPBS in een weefselkweek kap. Bewaar verdunde virus oplossing op ijs totdat het nodig is.
LET OP: afhandeling van alle virussen moet worden uitgevoerd in overeenstemming met een protocol inzake bioveiligheid goedgekeurd door uw instelling
2. Spuit laad-en montage van apparatuur
- Sluit het laden naald om het glas spuit en het opstellen van het virus oplossing uit de PCR-buis door zachtjes te trekken van de zuiger. Trek de zuiger tot een zeer kleine luchtbel kan worden gezien in de spuit, dit geeft aan dat alle van de oplossing in de spuit en is niet meer in het laden naald. Als alternatief kan een kleine hoeveelheid inerte kleurstof toegevoegd worden aan de oplossing om zichtbaar te maken.
OPMERKING: Een kleine PCR buis moet worden gebruikt als het laden naald is meestal niet lang genoeg om de bodem van de meeste andere buizen te bereiken. - Verwijder de laad-naald en leg de spuit op de spuit blok van een spuit pomp, beveiligen met de spuit houder.
- Steek het ene uiteinde van de verbindende slang in de spuit, plaatst u het andere uiteinde in de naaldhouder. Steek de injectienaald in de naaldhouder. Het einde van de injectienaald moet direct contact opnemen met het einde van de verbindende buis binnenkant van de naaldhouder.
- Langzaam handmatig de zuiger om de oplossing door te drukken van de verbindende slang. Duwen totdat er een druppeltje van de oplossing is zichtbaar aan de punt van de injectienaald.
- Voorzichtig de positie van de zuiger naast de duwboot blok en maak het vast met de pusher blok beugel.
- Stel de injectie parameters: injectiesnelheid moet ongeveer 8μl/min (~ 130nl / s); injectievolume is typisch een-2ul, selecteer de juiste spuit diameter voor de spuit formaat dat u gebruikt (zie de spuit pomp handleiding voor richtlijnen).
- Zet de kookplaat tot ~ 38 ° C en dek af met een papieren handdoek of een ander dun belemmering voor de pups te beschermen tijdens de herstelfase.
3. Injectie procedure en pup herstel
- Bereid P0 of P1 muis pups voor injectie door hen te onderwerpen aan koude anesthesie na een IACUC goedgekeurde protocol. Bevochtig een paar papieren handdoekjes met water en leg ze op ijs. Plaats het gewenste aantal pups (4-5) op het papier handdoek (houd ze goed gescheiden) en voorzichtig Vouw het papier handdoeken over de pups, zodat ze gedekt zijn door vochtig papieren doekje. Plaats voorzichtig een kleine hoeveelheid ijs op de top van de papieren handdoeken en incubeer de pups gedurende ongeveer 5 minuten. De pups kunnen worden bewaard op ijs tot maximaal 15 minuten en daarna terug te fijn.
- Nadat de pup voldoende verdoofd, plaats het op een montage blok (we gebruiken een piepschuim blok dat normaal gesproken bevat 15 ml buizen) en plaats deze voor de beste toegang tot de plaats van injectie. Voor de cortex is het makkelijkst om het dier plat op haar buik, terwijl het voor de kleine hersenen is het zinvol om de pup de positie van het hoofd over de rand van het blok een betere toegang tot de achterkant van de schedel te bieden. De pup kan worden vastgezet met een band-steun, indien gewenst.
- Houd de pup het hoofd op zijn plaats met een hand terwijl de naald handmatig wordt ingebracht via de schedel op de gewenste plaats met de andere hand. Het is nuttig om trek de huid strak om te voorkomen dat bewegen tijdens injectie. Voor de cortex is het nuttig om de injecties ten opzichte van een welbepaalde anatomische oriëntatiepunt, zoals de lambda hechting van de schedel te maken, omdat dit zal helpen in de toekomst injecties. Het cerebellum kan worden gezien door de schedel als een dunne strook van weefsel liggen direct caudaal van de colliculus. De diepte waarop de naald moet worden ingevoegd verschilt enigszins tussen individuele dieren en stammen en kan worden gemeten door vooraf bepaalde markers op de naald, maar voor de cortex en het cerebellum zien we dat een diepte van ~ 0,5 - 1 mm van het oppervlak is meestal geschikt. De insteekdiepte voor andere sites moet experimenteel worden bepaald door de eindgebruiker.
LET OP: De naald moet gemakkelijk binnendringen in de schedel, zo niet, NIET te hard, want dit kan het dier verwonden. Plaats de naald en voorzichtig opnieuw te proberen. - Injecteer het virus oplossing. De injectie is te startened door op de START knop op de pomp of deprimerende een voetpedaal, afhankelijk van het model van de druk injector gebruikt. Bij het ontbreken van een voetpedaal is het raadzaam om een collega te helpen bij druk op de knop om onnodige handbewegingen dat de injectie van invloed kunnen minimaliseren.
- Na de geselecteerde volume is geïnjecteerd, houd de naald op zijn plaats voor een paar seconden en dan voorzichtig de naald te verwijderen door te schuiven soepel verloopt. Zorg ervoor dat de pup het hoofd van zijn plaats te houden om vreemde bewegingen te minimaliseren. Omdat de injectie-apparatuur wordt gereinigd en gesteriliseerd tussen de experimenten met ethanol en de wond is klein, het gebruik van antiseptische is overbodig.
- Leg de pup op het overdekte kookplaat met de temperatuur ingesteld op ~ 38 ° C te warm-up voor herstel, gewoonlijk 5-10 minuten. Gedurende deze tijd kunt u blijven injecteren andere pups.
- Nadat alle pups hebben zich hersteld (ze moeten roze en bewegen) nemen een deel van het huis beddengoed en voorzichtig de pups wrijf ermee. Zet de pups aan de moeder als een groep.
LET OP: Het is zeer belangrijk om ervoor te zorgen dat de pups zijn voorafgaande warm en blootgesteld aan huis beddengoed om terug te bezorgen aan de moeder en ze terug te keren als een groep. Doet u dit niet kan resulteren in de moeder, verwonden of doden van de pups.
4. Apparatuur schoonmaken
- Na de injectie is voltooid en de pups zijn teruggekeerd naar hun moeder, schoon de injectie setup door volledig laden van de spuit met aceton of 70% ethanol. Spoel de oplossing door de injectie setup meerdere malen, met verse oplossing per keer. Dit verwijdert alle resterende virus oplossing en neerslaat. De aceton of ethanol zal dan verdampen.
LET OP: Aceton is bij voorkeur voor het schoonmaken, maar als je setup gebruik maakt van een aceton-gevoelige componenten, zoals cyanoacrylaat lijmen, dan is 70% ethanol te gebruiken voor deze stappen. - Ontsmet het werkgebied met bleekmiddel en gooi afval in een geschikte biohazard container.
5. Analyse
- Offeren de dieren op de gewenste leeftijd met behulp van een IACUC goedgekeurd euthanasie methode. Perfusie fixatie wordt aanbevolen om te helpen bij latere visualisatie van geïnfecteerde neuronen, met name in volwassen dieren.
- Standaard immunokleuring procedures kunnen worden gebruikt om het fluorescerende signaal te versterken. Kortom, zijn 100 micrometer drijvende vibratome secties gepermeabiliseerd met PBS +1% Triton X-100 en geblokkeerd in PBS +1% Triton X-100 +10% normaal geit serum. Secties worden geïncubeerd in het blokkeren van oplossing met primaire antilichamen overnacht bij 4 ° C, gevolgd door extra wassen en te blokkeren. Secties worden dan geïncubeerd in het blokkeren van oplossing met secundaire antilichamen gedurende 2 uur bij kamertemperatuur, grondig gewassen, gemonteerd op dia's en afgedekt met anti-fade montage media. Vriescoupes kunnen ook worden gebruikt om het label neuronen zichtbaar te maken, maar de endogene fluorescentie kunnen verloren gaan.
6. Representatieve resultaten:
Een succesvolle injectie procedure zal produceren robuuste infectie van neuronen in de regio van de injectieplaats met geen waarneembare weefselschade of andere nadelige effecten op het dier. Zoals geïllustreerd in figuur 1, kan de verspreiding van de infectie worden waargenomen bij Cre-reporter muizen (ROSA26R) 12 geïnjecteerd met rAAV8-Cre in verschillende anatomische sites. Injecties in specifieke regio's, zoals de cortex en een superieure colliculus, typisch het genereren van lokale infecties met minimale verspreiden naar aangrenzende regio's (Fig. 1A-B). Gebruik van hoge titer virus oplossing maakt infectie van aangrenzende gebieden, zoals de hippocampus, een grotere kans (Fig. 1A). Injectie met een lage titer virus oplossing resulteert in een schaars infectie, die meestal blijft de buurt van de plaats van injectie, zoals aangegeven in de cerebellaire injectie van rAAV8-Cre op de middellijn van ROSA26R reporter muizen (figuur 1C-D). We hebben gezien recombinatie in ROSA26R reporter muizen binnen 2 dagen na de injectie van rAAV8-Cre, wat suggereert dat infectie, recombinatie, en expressie van genen reporter allemaal kunnen komen relatief snel. Daarnaast hebben we met succes hebben deze techniek gebruikt om de effecten van de gendeletie studie aan een niet-ROSA locus met behulp van een floxed voorwaardelijke allel, zullen de resultaten van die elders worden gepubliceerd.
Het aantal geïnfecteerde cellen zou moeten correleren met de titer van de geïnjecteerde virale oplossing. Bijvoorbeeld, het injecteren van een mix van hoge titer oplossingen van twee rAAV8 virussen die verschillende fluorescerende eiwitten in de kleine hersenen infecteert vele Purkinje cellen die differentieel zijn gelabeld (Fig. 2A). Omgekeerd kan het injecteren van een lage titer virus-oplossing leidt tot spaarzame infectie te helpen bij het visualiseren van enkele cellen (Fig. 2B). Fluorescent gelabelde neuronen kan direct worden waargenomen in vers gesneden, levend weefsel (Fig. 2B) of kan worden onderworpen aan immunokleuring aan de endogene fluorescerende signalen voor latere beeldacquisitie versterken door wide-field of confocal fluorescentie microscopie (Fig. 2A, Fig. 3A-C). Ten slotte rAAV8 in staat is om te infecteren een verscheidenheid aan types neuron in de cortex met sterke kenmerken van fijne processen (Fig. 3A-C).
Figuur 1: LacZ kleuring in de hersenen van ROSA26R reporter muizen die waren met rAAV8-Cre geïnjecteerd op P0 toont Cre-activiteit en de locatie van de infectie.
- Wide-field sagittale het oog op een P14 hersenen met een hoge titer (1x10 12 GC / ml) injecties in de cortex en superieure colliculus. Het gebruik van hoge titer virus maakt het waarschijnlijker dat de aangrenzende gebieden zal ook worden besmet.
- Sagittale doorsnede van de P14 cortex geïnjecteerd met een lagere titer (1x10 11 GC / ml) virus vertoont een lokale infectie met minder verspreiden.
- Een wholemount uitzicht op een P28 cerebellum geïnjecteerd op de middenlijn met een lage titer (1x10 9 GC / ml)-virus-oplossing laat zien dat de infectie schaars is en meestal blijft de buurt van de plaats van injectie.
- Sagittale uitzicht op de middellijn van het cerebellum in C). Merk op dat over het algemeen alleen Purkinje cellen zijn geïnfecteerd door rAAV8.
Figuur 2: Cerebellaire labeling door injectie met een hoge en lage titers van rAAV8 uiten van fluorescerende eiwitten.
- Een sagittale doorsnede van P21cerebellum besmet zijn met een mix van twee virussen te drukken EGFP (groen) en DsRed (rood). Een hoge titer mix van virussen werd gebruikt om een groot aantal van Purkinje cellen te infecteren.
- Een Purkinje cel in levende P14 cerebellum van zeer lage titer virale infectie afgebeeld onmiddellijk na dissectie.
Figuur 3: Corticale etikettering door rAAV8-DsRed.
Voorbeelden van de verscheidenheid van de corticale neuron types in het coronale delen van een P21 cortex die werd besmet door rAAV8-DsRed bij P0.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De neonatale virale injectiemethode hier wordt gepresenteerd biedt een eenvoudige en snelle manier voor het genereren van in vivo mozaïeken voor de studie van postnatale ontwikkeling van de hersenen. De methode maakt gebruik van floxed allelen die momenteel beschikbaar zijn en als die worden gedaan via de High Throughput Gene Targeting project 6. In vergelijking met het gebruik van transgene expressie van Cre, deze methode biedt een snelle manier om genfunctie in verschillende celtypen te testen, als muizen het dragen van de floxed allelen kan direct worden gebruikt voor experimenten, en het hele virus injectie procedure van begin tot eind te kunnen bereikt in minder dan een uur. Daarnaast kan het aantal geïnfecteerde cellen eenvoudig worden gecontroleerd door het veranderen van de titer van het virus, die spaarzaam etikettering van individuele neuronen mogelijk maakt. Hoewel we alleen beschreven de neuronale morfologie in het monster beelden, kan de analyse van geïnfecteerde neuronen worden uitgebreid tot vele belangrijke ontwikkelingsprocessen, zoals axonale en dendritische groei, vertakking en tegels, maar ook synaptische ontwikkeling, zoals rug morfogenese.
De drie meest kritische onderdelen van de procedure zijn de juistheid van richten op de injectieplaats, de betrouwbaarheid van de injectie-apparatuur, en de overleving van de pups. Het eerste aspect - nauwkeurigheid - het beste leren door ervaring. De betrouwbaarheid van de injectiemateriaal verwijst naar het feit dat men moet zorgen dat er geen klompen, lekken, of andere problemen met de apparatuur voorafgaand aan de injectie. Ten slotte is de overleving van de pups is meestal geen probleem als de tips genoemd in stap 3.7 worden gevolgd.
Een voor de hand liggende aanpassing van deze procedure is het gebruik van een mix van virussen die verschillende genen. Zo kan bijvoorbeeld een mengsel van twee virussen, rAAV-Cre-GFP en rAAV-RFP, worden geïnjecteerd met een mozaïek van dun gelabeld knockout (groen) en controle (rode) cellen in een enkel dier te produceren. Dit levert een duidelijk voordeel ten opzichte van traditionele gen knock-outs voor de analyse van enkele cellen, waardoor het vooral handig voor morfologische analyse van de neuronen met wild type of mutant allelen in dezelfde hersenen van muizen. Dit kan ook een beperking, maar als men wil gedragsstudies, waarin het nodig kan zijn om een groot aantal neuronen te manipuleren om een waarneembaar effect te voeren. Wij vinden dat we in het algemeen kunnen injecties uit te voeren tot postnatale leeftijd van 3 (P3), maar vanaf de leeftijd van P4 en op de schedel is vaak te dik om gemakkelijk te doorprikken met de injectienaald. De dikte van de schedel op een bepaalde leeftijd kan variëren van dier tot dier, echter, dus dit probleem moet worden beoordeeld door de experimentator.
Naast het gebruik van fluorescerende eiwitten tot expressie gebracht van het Cre-expressie virus, veel tl-reporter muizen met het loxP-STOP-loxP allelen zijn gegenereerd 13 en kan worden opgenomen met de floxed allel. Hoewel inclusief de nieuwe allel voegt de tijd die nodig is voor het verkrijgen van de muizen met de juiste genotypen, kunnen deze reporter muizen gelijktijdig te volgen Cre-activiteit en label individuele neuronen.
Door de selectieve tropisme van recombinant rAAVs, kunnen verschillende neuronale celtypes worden geëtiketteerd in anatomische regio's door te kiezen voor een bepaalde rAAV serotype (figuur 1D). De specificiteit kan ook worden bereikt door het gebruik van verschillende promotors. Daarnaast kunnen andere virussen, zoals lentivirus, worden gebruikt om de neuronen 10 infecteren. Het voordeel hiervan is dat deze virussen kunnen grotere DNA-inserts te voeren om niet alleen Cre, maar ook andere genetische materialen, zoals shRNA en dominant actieve genen uit te drukken. Bovendien kan de methode ook worden gebruikt in de nieuw ontwikkelde transgene ratten 14, waar voorwaardelijk uitgedrukt Cre lijnen niet goed vastgesteld. Ten slotte, wanneer deze techniek is gevestigd in het lab, kan het verder worden gecombineerd met andere analyse-instrumenten, zoals de in vivo twee-foton imaging 11 en / of electrofysiologie, om de functie van elk gen in neurale circuit ontwikkeling en functie te bestuderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk wordt ondersteund door een RO1 subsidie van NIH (NINDS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| rAAV8-Cre, -GFP, -DsRed, | Vector Biolabs | #7060, #7061, custom order | http://www.vectorbiolabs.com |
| Harvard Pump 11 Plus | Harvard Apparatus | #702208 | (No foot pedal port) |
| Retinal Pigment Epithelium Injection Kit | World Precision Instruments, Inc. | RPE-KIT | Contains connective tubing, injection needles (36G), and needle holder |
| NanoFil Syringe, 100μl | World Precision Instruments, Inc. | NANOFIL-100 | Includes reusable loading needle |
| D-PBS | Invitrogen | 14040-117 | |
| GFP antibody | Aves | GFP-1020 | |
| DsRed antibody | Clontech Laboratories | 632496 | |
| Heating Block | VWR international | 97042-610 | |
| ROSA26R mouse | Jackson Laboratory | 003309 |
References
- Geschwind, D. H., Levitt, P. Autism spectrum disorders: developmental disconnection syndromes. Curr Opin Neurobiol. 17, 103-111 (2007).
- Giedd, J. N., Rapoport, J. L. Structural MRI of pediatric brain development: what have we learned and where are we going? Neuron. 67, 728-734 (2010).
- Chedotal, A., Richards, L. J. Wiring the brain: the biology of neuronal guidance. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2, (2010).
- Shen, K., Cowan, C. W. Guidance molecules in synapse formation and plasticity. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2, (2010).
- Chen, S. Y., Cheng, H. J. Functions of axon guidance molecules in synapse formation. Curr Opin Neurobiol. 19, 471-478 (2009).
- Guan, C., Ye, C., Yang, X., Gao, J. A review of current large-scale mouse knockout efforts. Genesis. 48, 73-85 (2010).
- Tenenbaum, L. Recombinant AAV-mediated gene delivery to the central nervous system. J Gene Med. 6, 212-222 (2004).
- Broekman, M. L., Comer, L. A., Hyman, B. T., Sena-Esteves, M. Adeno-associated virus vectors serotyped with AAV8 capsid are more efficient than AAV-1 or -2 serotypes for widespread gene delivery to the neonatal mouse brain. Neuroscience. 138, 501-510 (2006).
- Pilpel, N., Landeck, N., Klugmann, M., Seeburg, P. H., Schwarz, M. K. Rapid reproducible transduction of select forebrain regions by targeted recombinant virus injection into the neonatal mouse brain. J Neurosci Methods. 182, 55-63 (2009).
- Szulc, J., Aebischer, P. Conditional gene expression and knockdown using lentivirus vectors encoding shRNA. Methods Mol Biol. 434, 291-309 (2008).
- Pan, F., Gan, W. B. Two-photon imaging of dendritic spine development in the mouse cortex. Dev Neurobiol. 68, 771-778 (2008).
- Soriano, P. Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain. Nat Genet. 21, 70-701 (1999).
- Madisen, L. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nat Neurosci. 13, 133-1340 (2010).
- Tong, C., Li, P., Wu, N. L., Yan, Y., Ying, Q. L. Production of p53 gene knockout rats by homologous recombination in embryonic stem cells. Nature. 467, 211-213 (2010).
