Summary
Un
Abstract
Normali funzioni cerebrali si basa non solo sullo sviluppo embrionale in cui i principali percorsi neuronali sono stabiliti, ma anche sullo sviluppo postnatale, quando i circuiti neurali sono maturato e raffinato. Misregulation in questa fase può portare a disturbi neurologici e psichiatrici come l'autismo e la schizofrenia 1,2. Molti geni sono stati studiati nel cervello prenatale e ha trovato cruciali per molti processi di sviluppo 3-5. Tuttavia, la loro funzione nel cervello postnatale è in gran parte sconosciuto, anche perché la loro cancellazione in topi spesso conduce a mortalità durante lo sviluppo neonatale, e in parte perché la loro richiesta nel primo sviluppo ostacola l'analisi post-natale. Per superare questi ostacoli, floxed alleli di questi geni sono attualmente generati nei topi 6. Se combinato con alleli transgenici che esprimono Cre ricombinasi in tipi cellulari specifici, la cancellazione condizionale può essere raggiunto per studiare la funzione dei geni nel cervello postnatale. Tuttavia, questo metodo richiede alleli aggiuntivi e tempi supplementari (3-6 mesi) per generare i topi con genotipi del caso, limitando così l'espansione della analisi genetica di larga scala nel cervello di topo.
Qui mostriamo un approccio complementare che utilizza virale Cre-espresso per studiare questi alleli floxed rapidamente e sistematicamente nello sviluppo cerebrale postnatale. Iniettando ricombinante virus adeno-associati (rAAVs) 7,8 codifica Cre nel cervello neonatale, siamo in grado di eliminare il gene di interesse in diverse regioni del cervello. Controllando il titolo virale e coexpressing un marcatore fluorescente proteina, siamo in grado di raggiungere contemporaneamente l'inattivazione del gene mosaico e sparse etichettatura neuronale. Questo metodo evita l'esigenza di molti geni nello sviluppo iniziale, e ci permette di studiare la loro funzione autonoma delle cellule in molti processi critici nello sviluppo cerebrale postnatale, compresa la crescita assonale e dendritiche, ramificazione, e rivestimenti, come pure la formazione di sinapsi e raffinatezza. Questo metodo è stato utilizzato con successo nel nostro laboratorio proprio (risultati non pubblicati) e altri 8,9, e può essere esteso ad altri virus, come il lentivirus 9, così come l'espressione di shRNA o dominante proteine attive 10. Inoltre, combinando questa tecnica con elettrofisiologia così come recentemente sviluppato strumenti di imaging ottico 11, questo metodo fornisce una nuova strategia per studiare come i percorsi genetici influenzano lo sviluppo neurale del circuito e la funzione di topi e ratti.
Protocol
1. Virus preparazione iniettabile
- rAAVs sono stati acquistati dal produttore raccomanda commerciale, ma possono anche essere prodotta nel proprio laboratorio proprio (vedi discussione sotto). La soluzione del virus è tipicamente prodotta in un titolo di ~ 1x10 12 copie per millilitro genoma (GC / ml) e può essere utilizzato a pieno titolo a manipolare un gran numero di cellule. In alternativa, possono essere diluiti per produrre il livello desiderato di etichettatura sparse. La diluizione appropriata deve essere determinata dall'utente, ma una diluizione 1:10 si raccomanda di iniziare.
- Disgelo virus sul ghiaccio immediatamente prima dell'uso. Trasferire il desiderato pre-diluizione volume di soluzione antivirus in un piccolo (~ 250μl) tubo PCR. Diluire la soluzione antivirus con un volume adeguato di DPBS sterile in una cappa di coltura di tessuti. Conservare soluzione diluita virus sul ghiaccio fino a quando non è necessario.
NOTA: la gestione di tutti i virus devono essere svolte secondo un protocollo di biosicurezza approvati dal vostro istituto
2. Siringa di carico e attrezzature di assemblaggio
- Collegare l'ago di carico alla siringa di vetro e di elaborare la soluzione virus dal tubo di PCR tirando delicatamente lo stantuffo. Tirare lo stantuffo fino a una bolla d'aria molto piccolo può essere visto nella siringa, questo indica che tutta la soluzione è nella siringa e non è lasciata in carico l'ago. In alternativa, una piccola quantità di colorante inerte può essere aggiunto alla soluzione per renderlo visibile.
NOTA: Un piccolo tubo PCR dovrebbe essere usato come l'ago di carico non è in genere abbastanza a lungo per raggiungere il fondo della maggior parte degli altri tubi. - Rimuovere l'ago di carico e posizionare la siringa sul blocco siringa di una pompa a siringa, fissandolo con il fermo della siringa.
- Inserire delicatamente un'estremità del tubo connettivo nella siringa, inserire l'altra estremità nella porta aghi. Inserire l'ago per l'iniezione nel supporto ago. La fine dell'ago iniezione deve rivolgersi direttamente alla fine della parte interna tubi connettivo del titolare ago.
- Premere lentamente lo stantuffo per spingere manualmente la soluzione attraverso il tubo connettivo. Spingere fino a quando una piccola goccia di soluzione è visibile sulla punta dell'ago iniezione.
- Con attenzione la posizione del pistone accanto al blocco spintore e fissarlo in posizione con la staffa blocco spintore.
- Impostare i parametri di iniezione: velocità di iniezione deve essere di circa 8μl/min (~ 130nl / s), volume di iniezione è di solito 1-2ul, selezionare il diametro appropriata siringa per le dimensioni della siringa in uso (vedi il manuale di pompa a siringa per le linee guida).
- Impostare il piano di cottura a ~ 38 ° C e coprire con un tovagliolo di carta o altro sottile barriera per proteggere i cuccioli durante la fase di recupero.
3. Procedura di iniezione e il recupero dei cuccioli
- Preparare P0 e P1 cuccioli di topo per iniezione sottoponendoli a freddo anestesia da un protocollo IACUC approvato. Inumidire un paio di asciugamani di carta con acqua e posto sul ghiaccio. Mettere il numero desiderato di cuccioli (4-5) sul tovagliolo di carta (tenerli ben separati) e delicatamente piegare i tovaglioli di carta sopra i cuccioli in modo che siano coperti da un tovagliolo di carta umido. Posizionare delicatamente una piccola quantità di ghiaccio tritato in cima alla tovaglioli di carta e incubare i cuccioli per circa 5 minuti. I cuccioli possono essere tenuti in ghiaccio per un massimo di 15 minuti e recuperare bene dopo.
- Dopo che il cucciolo è sufficientemente anestetizzati, è posto su un blocco di montaggio (si usa un blocco di polistirolo che normalmente contiene 15ml tubi) e la posizione che per i migliori l'accesso al sito di iniezione. Per la corteccia è più facile gettare le piatta animale sul ventre, mentre per il cervelletto è utile per posizionare il cucciolo la testa oltre il bordo del blocco di fornire un migliore accesso alla parte posteriore del cranio. Il cucciolo può essere fissato in posizione con un cerotto, se lo si desidera.
- Tenere il cucciolo la testa in posizione con una mano mentre l'ago viene inserito manualmente attraverso il cranio al sito desiderato con l'altra mano. E 'utile per tirare la pelle tesa per evitare che si sposti durante l'iniezione. Per la corteccia è utile per fare le iniezioni rispetto a un ben definito punto di riferimento anatomico, come ad esempio la sutura lambda del cranio, in quanto questo sarà di aiuto nella iniezioni futuro. Il cervelletto può essere visto attraverso il cranio, come una sottile striscia di tessuto che si trova direttamente al collicolo caudale. La profondità a cui l'ago deve essere inserito varia leggermente tra i singoli animali e le tensioni e può essere misurata con indicatori predeterminati sul ferro, ma per la corteccia e il cervelletto troviamo che una profondità di circa 0,5 - 1 mm dalla superficie sono generalmente sufficienti. La profondità di inserimento anche per altri siti devono essere determinati sperimentalmente da parte dell'utente finale.
NOTA: L'ago deve facilmente penetrare il cranio, se non, non spingere troppo duro come questo può ferire l'animale. Riposizionare l'ago e delicatamente riprovare. - Iniettare la soluzione di virus. L'iniezione è iniziare aed premendo il pulsante START sulla pompa o deprimente un pedale, a seconda del modello di pressione iniettore utilizzato. In assenza di un pedale si raccomanda di avere un collega assistere premendo il pulsante per minimizzare i movimenti della mano inutili che possono influenzare l'iniezione.
- Dopo il volume selezionato è stato iniettato, tenere l'ago in posizione per qualche secondo e poi rimuovere delicatamente l'ago facendolo scorrere fuori senza problemi. Accertarsi di tenere il cucciolo la testa in atto per minimizzare i movimenti estranei. Dal momento che le attrezzature di iniezione viene pulito e sterilizzato tra esperimenti con etanolo e la ferita è piccola, l'uso di antisettici non è necessaria.
- Collocare il cucciolo sulla piastra coperta con la temperatura impostata a ~ 38 ° C per scaldarlo per il recupero, minuti al 5-10. Durante questo periodo si può continuare l'iniezione altri cuccioli.
- Dopo che tutti i cuccioli hanno recuperato (dovrebbero essere rosa e in movimento) prendere una parte della biancheria da letto a casa e strofinare delicatamente i cuccioli con esso. Ritorno i cuccioli con la madre come un gruppo.
NOTA: E 'molto importante assicurarsi che i cuccioli sono caldi e esposti a letto a casa prima del loro ritorno alla madre e di ritornare come gruppo. In caso contrario si potrebbero causare nella madre ferire o uccidere i cuccioli.
4. Attrezzature per la pulizia
- Dopo l'iniezione è completa e cuccioli sono stati restituiti alla loro madre, pulire il setup iniezione pienamente carico la siringa con acetone o etanolo al 70%. Lavare la soluzione attraverso l'iniezione tempi di setup diversi, usando la soluzione fresca ogni volta. Questo rimuoverà qualsiasi soluzione rimanente virus e precipita. L'acetone o etanolo poi evaporare.
NOTA: L'acetone è preferito per la pulizia, ma se la vostra installazione utilizza qualsiasi acetone componenti sensibili, come adesivi cianoacrilati, quindi utilizzare etanolo al 70% per questi passaggi. - Disinfettare l'area di lavoro con i rifiuti candeggina ed eliminare in un apposito contenitore a rischio biologico.
5. Analisi
- Sacrificare gli animali all'età desiderato utilizzando un metodo IACUC eutanasia approvato. Fissazione perfusione è consigliato per aiutare nella visualizzazione dopo di neuroni infetti, soprattutto negli animali adulti.
- Procedure di immunoistochimica standard può essere utilizzato per amplificare il segnale fluorescente. In breve, 100 micron galleggianti sezioni vibratome sono permeabilizzate con PBS +1% Triton X-100 e bloccato in PBS +1% Triton X-100 +10% siero di capra normale. Le sezioni sono incubate nel bloccare la soluzione con gli anticorpi primari notte a 4 ° C, seguita da ulteriori lavaggio e di blocco. Le sezioni sono poi incubate nel bloccare la soluzione con anticorpi secondari per 2 ore a temperatura ambiente, lavate accuratamente, montato su guide e coperti con mezzi di montaggio anti-sbiadimento. Criosezioni può essere utilizzato anche per visualizzare neuroni marcati, tuttavia la fluorescenza endogena potrebbero andare perse.
6. Rappresentante dei risultati:
Una procedura di iniezione di successo produrrà infezione robusto dei neuroni nella regione del sito d'iniezione, senza danni ai tessuti osservabili o altri effetti nocivi sull'animale. Come illustrato nella figura 1, la diffusione della infezione può essere osservata in Cre-reporter topi (ROSA26R) 12 iniettata con rAAV8-Cre in siti anatomici diversi. Iniezioni in regioni specifiche, come la corteccia e collicolo superiore, tipicamente generano infezioni locali con diffusione minima nelle regioni adiacenti (Fig. 1A-B). Uso di una soluzione ad alta virus titolo rende l'infezione delle aree adiacenti, come l'ippocampo, più probabile (Fig. 1A). Iniezione con risultati soluzione a basso titolo nelle infezioni da virus sparse, che rimane di solito in prossimità del sito di iniezione, come mostrato nella iniezione cerebellare di rAAV8-Cre sulla linea mediana del topo giornalista ROSA26R (figura 1C-D). Abbiamo osservato nei topi ricombinazione giornalista ROSA26R entro 2 giorni dopo l'iniezione di rAAV8-Cre, suggerendo che l'infezione, ricombinazione, ed espressione di geni reporter possono verificarsi in modo relativamente rapido. Inoltre, abbiamo utilizzato con successo questa tecnica per studiare gli effetti della delezione del gene in un non-ROSA locus utilizzando un allele floxed condizionale, i cui risultati verranno pubblicati altrove.
Il numero di cellule infette dovrebbero correlazione con il titolo della soluzione iniettata virale. Per esempio, l'iniezione di un mix di soluzioni di alto titolo di due rAAV8 virus che esprimono diverse proteine fluorescenti nel cervelletto infetta molte cellule di Purkinje che sono etichettati in modo differenziale (Fig. 2A). Al contrario, iniettando una soluzione a basso titolo virus possono causare infezioni sparse per aiutare a visualizzare singole cellule (Fig. 2B). Neuroni fluorescente può essere osservata direttamente nel taglio fresco, tessuto vivo (Fig. 2B) o può essere sottoposto a immunostaining per migliorare i segnali endogeni fluorescenti per l'acquisizione di immagini più tardi da grande campo o confocal microscopia a fluorescenza (Fig. 2A, fig. 3A-C). Infine, rAAV8 è in grado di infettare una grande varietà di tipi di neuroni della corteccia con l'etichettatura dei processi di forte multa (Fig. 3A-C).
Figura 1: colorazione LacZ nel cervello di topi giornalista ROSA26R che sono stati iniettati con rAAV8 Cre-a P0 dimostra attività Cre e la posizione di infezione.
- Ampio campo di vista sagittale del cervello di un P14 che mostra alto titolo (1x10 12 GC / ml) iniezioni di corteccia e nel collicolo superiore. L'uso di virus ad alto titolo rende più probabile che le aree adiacenti saranno infettati.
- Sezione sagittale del P14 corteccia iniettati con basso titolo (1x10 11 GC / ml) dimostra una infezione da virus locale con minore diffusione.
- Una vista wholemount di un cervelletto P28 iniettato sulla linea mediana, con basso titolo (1x10 9 GC / ml) soluzione del virus indica che l'infezione è scarsa e rimane di solito in prossimità del sito di iniezione.
- Sagittale della linea mediana del cervelletto in C). Si noti che le cellule di Purkinje in genere solo sono infettati da rAAV8.
Figura 2: etichettatura cerebellare mediante iniezione con titoli ad alta e bassa di rAAV8 esprimono proteine fluorescenti.
- Una sezione sagittale del P21cerebellum infettato con un mix di due virus che esprimono EGFP (verde) e DsRed (rosso). Un mix alto titolo di virus è stato utilizzato per infettare un gran numero di cellule di Purkinje.
- Una cellula di Purkinje nel cervelletto vivere P14 titolo da infezione virale molto bassa ripreso immediatamente dopo la dissezione.
Figura 3: etichettatura corticale da rAAV8-DsRed.
Esempi della varietà di tipi di neuroni corticali in sezioni coronali di una corteccia P21 che è stato infettato da rAAV8-DsRed a P0.
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Discussion
Il metodo neonatale iniezione virale qui presentata fornisce un modo semplice e rapido per generare mosaici in vivo per lo studio dello sviluppo cerebrale postnatale. Il metodo si avvale di alleli floxed che sono attualmente disponibili e quelle che vengono effettuate tramite il gene targeting High Throughput progetto 6. Rispetto all'uso di espressione transgenica di Cre, questo metodo fornisce un modo rapido per testare la funzione del gene in vari tipi di cellule, come topi portatori degli alleli floxed può essere utilizzato direttamente per gli esperimenti, e l'intera procedura di iniezione del virus dall'inizio alla fine può essere realizzato in meno di un'ora. Inoltre, il numero di cellule infette può essere facilmente controllato modificando il titolo del virus, che permette l'etichettatura sparse dei singoli neuroni. Anche se abbiamo solo descritto la morfologia neuronale nelle immagini di esempio, l'analisi dei neuroni infetti può essere esteso a molti importanti processi di sviluppo, tra cui la crescita assonale e dendritiche, ramificazione e rivestimenti, nonché lo sviluppo sinaptico come la morfogenesi della colonna vertebrale.
Le tre parti più critiche della procedura sono la precisione di targeting sito di iniezione, l'affidabilità degli impianti di iniezione, e la sopravvivenza dei cuccioli. Il primo aspetto - la precisione - è meglio appreso attraverso l'esperienza. L'affidabilità degli impianti di iniezione si riferisce al fatto che si deve verificare che non ci siano impedimenti, perdite o altri problemi con le attrezzature prima dell'iniezione. Infine, la sopravvivenza dei cuccioli in genere non è un problema se i suggerimenti di cui al punto 3,7 sono seguiti.
Una modificazione evidente di questa procedura è quello di utilizzare una miscela di virus che esprimono geni diversi. Ad esempio, una miscela di due virus, rAAV-Cre-GFP e RFP-rAAV, può essere iniettata per produrre un mosaico di eliminazione diretta scarsamente etichettati (verde) e controllo (rosso), le cellule in un singolo animale. Ciò fornisce un netto vantaggio rispetto fori gene tradizionali per l'analisi delle singole cellule, il che rende particolarmente utile per l'analisi morfologica dei neuroni di tipo selvaggio o alleli mutanti nel cervello del mouse stesso. Questo può anche essere una limitazione, tuttavia, se si vuole eseguire studi comportamentali, in cui può essere necessario manipolare un gran numero di neuroni a produrre un effetto osservabile. Troviamo che siamo in grado di effettuare iniezioni in genere fino all'età postnatale 3 (P3), però da anni P4 e sul cranio è spesso troppo denso per facilità puntura con l'ago di iniezione. Lo spessore del cranio di una particolare età può variare da animale ad animale, tuttavia, in modo tale questione deve essere valutata dallo sperimentatore.
Oltre a utilizzare le proteine fluorescenti espresse dal Cre-esprimono virus, molti topi giornalista fluorescenti ad loxP-STOP-loxP alleli sono stati generati 13 e possono essere integrati con l'allele floxed. Sebbene l'inclusione del nuovo allele aggiunge il tempo necessario per ottenere i topi con genotipo del caso, questi topi reporter può contemporaneamente controllare l'attività Cre e singoli neuroni etichetta.
A causa del tropismo selettivo di rAAVs ricombinante, diversi tipi di cellule neuronali possono essere etichettati in regioni anatomiche scegliendo un sierotipo particolare rAAV (Figura 1D). La specificità può essere raggiunto anche tramite promotori differenti. Inoltre, altri virus, come il lentivirus, può essere usato per infettare i neuroni 10. Il vantaggio è che questi virus possono portare grandi inserti di DNA di esprimere non solo Cre ma anche altri materiali genetici, come shRNA e dominante geni attivi. Inoltre, il metodo può essere utilizzato anche nei ratti di nuova concezione transgenici 14, dove condizionatamente espressa linee Cre non sono ben stabiliti. Infine, una volta che questa tecnica è stabilito in laboratorio, può essere ulteriormente raggruppati con altri strumenti analitici, come in vivo due fotoni di imaging 11 e / o di elettrofisiologia, per studiare la funzione di ogni gene in sviluppo del circuito neurale e funzione.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Questo lavoro è finanziato da una sovvenzione RO1 dal NIH (NINDS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| rAAV8-Cre, -GFP, -DsRed, | Vector Biolabs | #7060, #7061, custom order | http://www.vectorbiolabs.com |
| Harvard Pump 11 Plus | Harvard Apparatus | #702208 | (No foot pedal port) |
| Retinal Pigment Epithelium Injection Kit | World Precision Instruments, Inc. | RPE-KIT | Contains connective tubing, injection needles (36G), and needle holder |
| NanoFil Syringe, 100μl | World Precision Instruments, Inc. | NANOFIL-100 | Includes reusable loading needle |
| D-PBS | Invitrogen | 14040-117 | |
| GFP antibody | Aves | GFP-1020 | |
| DsRed antibody | Clontech Laboratories | 632496 | |
| Heating Block | VWR international | 97042-610 | |
| ROSA26R mouse | Jackson Laboratory | 003309 |
References
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