Summary
Um
Abstract
Função normal do cérebro depende não só no desenvolvimento embrionário quando principais vias neuronais são estabelecidas, mas também sobre o desenvolvimento pós-natal quando os circuitos neurais são vencidas e refinado. Desregulação nesta fase pode levar a distúrbios neurológicos e psiquiátricos, como autismo e esquizofrenia 1,2. Muitos genes foram estudados no cérebro pré-natal e encontrou crucial para muitos processos de desenvolvimento 3-5. No entanto, sua função no cérebro pós-natal é em grande parte desconhecida, em parte porque sua eliminação em ratos muitas vezes leva a letalidade durante o desenvolvimento neonatal, e em parte porque sua exigência no início do desenvolvimento dificulta a análise pós-natal. Para superar esses obstáculos, os alelos floxed desses genes estão sendo gerados em camundongos 6. Quando combinado com alelos transgênicos que expressam Cre recombinase em tipos específicos de células, eliminação condicional pode ser alcançado para estudar a função do gene no cérebro pós-natal. No entanto, este método requer alelos adicionais e tempo extra (3-6 meses) para gerar os ratos com genótipos adequados, limitando assim a expansão da análise genética para grande escala no cérebro do rato.
Aqui nós demonstramos uma abordagem complementar que usa Cre virally-expresso para o estudo desses alelos floxed rápida e sistematicamente no desenvolvimento do cérebro pós-natal. Injetando recombinante vírus adeno-associado (rAAVs) 7,8 codificação Cre no cérebro neonatal, somos capazes de eliminar o gene de interesse em diferentes regiões do cérebro. Ao controlar o título viral e coexpressing um marcador da proteína fluorescente, que pode assegurar em simultâneo a inativação do gene mosaico e rotulagem neuronal esparsas. Este método ignora a exigência de muitos genes no início do desenvolvimento, e nos permite estudar a sua função de células autônomas em muitos processos críticos no desenvolvimento do cérebro pós-natal, incluindo o crescimento axonal e dendrítico, ramificação e azulejos, bem como a formação de sinapses e requinte. Este método tem sido utilizado com sucesso em nosso próprio laboratório (dados não publicados) e outros 8,9, e pode ser estendido a outros vírus, como lentivírus 9, bem como a expressão de shRNA ou dominante proteínas ativas 10. Além disso, ao combinar esta técnica com eletrofisiologia, bem como recém-desenvolvidas ferramentas de imagem óptico de 11, este método fornece uma nova estratégia para estudar como as vias genéticas influenciam o desenvolvimento do circuito neural e função em camundongos e ratos.
Protocol
1. Vírus Preparação para a injecção
- rAAVs foram comprados do fornecedor recomendado comercial, mas também podem ser produzidos em um laboratório do próprio (ver discussão abaixo). A solução vírus normalmente é produzido em um título de ~ 1x10 12 cópias do genoma por mililitro (GC / ml) e pode ser usado na titulação completa para manipular um grande número de células. Alternativamente, eles podem ser diluídas para produzir o nível desejado de rotulagem esparsas. Uma diluição adequada deve ser determinada pelo usuário, mas uma diluição de 1:10 é recomendado para começar.
- Descongelar vírus no gelo imediatamente antes da utilização. Transferir o desejado volume pré-diluição da solução de vírus em uma pequena (~ 250μl) Tubo de PCR. Diluir a solução de vírus usando um volume adequado de DPBS estéril em uma capa de cultura de tecidos. Loja vírus solução diluída no gelo até que seja necessário.
NOTA: manipulação de todos os vírus devem ser conduzidos de acordo com um protocolo de biossegurança aprovada pela sua instituição
2. Carregamento da seringa e montagem de equipamentos
- Conecte a agulha de carregamento para a seringa de vidro e elaborar o vírus solução do tubo PCR puxando o êmbolo. Puxar o êmbolo até uma bolha muito pequena de ar pode ser visto na seringa, o que indica que toda a solução está na seringa e não é deixado na agulha de carga. Alternativamente, uma pequena quantidade de corante inerte pode ser adicionado à solução para torná-lo visível.
NOTA: Um tubo de PCR pequenos devem ser utilizados como a agulha de carregamento normalmente não é o suficiente para alcançar o fundo da maioria dos outros tubos. - Remova a agulha de carga e coloque a seringa no bloco de seringa de uma bomba de seringa, prendendo-o com o retentor seringa.
- Gentilmente insira uma extremidade do tubo conjuntivo para dentro da seringa; insira a outra extremidade no porta-agulha. Inserir a agulha de injeção no suporte da agulha. O fim da agulha da injecção deve contatar diretamente o final do conjuntivo dentro da tubulação do titular da agulha.
- Pressione o êmbolo lentamente manualmente de empurrar a solução através do tubo conectivo. Empurre-a até uma pequena gota de solução é visível na ponta da agulha de injeção.
- Atentamente a posição do êmbolo ao lado do bloco empurrador e segura-lo no lugar com o suporte de bloco empurrador.
- Definir os parâmetros de injeção: taxa de injeção deve ser de aproximadamente 8μl/min (~ 130nl / s), volume de injeção é normalmente 1-2ul, selecionar o diâmetro da seringa apropriada para o tamanho da seringa você está usando (consulte o manual de bomba de seringa para orientações).
- Definir a chapa para ~ 38 ° C e cubra com uma toalha de papel ou outras fina barreira para proteger os filhotes durante a fase de recuperação.
3. Procedimento de injeção e recuperação filhote
- Prepare P0 ou P1 filhotes de rato para injeção submetendo-os à anestesia fria seguir um protocolo IACUC aprovado. Umedeça um papel toalha poucos com a água e colocar no gelo. Coloque o número desejado de filhotes (4-5) sobre a toalha de papel (mantê-los bem separados) e gentilmente dobre as toalhas de papel sobre os filhotes assim que são cobertos por uma toalha de papel úmido. Delicadamente, coloque uma pequena quantidade de gelo picado por cima das toalhas de papel e incubar os filhotes por cerca de 5 minutos. Os filhotes podem ser mantidos em gelo por até 15 minutos e recuperar bem depois.
- Após o filhote está suficientemente anestesiado, colocá-lo em um bloco de montagem (usamos um bloco de isopor, que normalmente mantém tubos 15ml) e posicioná-lo para melhor acesso ao local da injeção. Para o córtex é mais fácil colocar o apartamento animal à sua barriga, enquanto que para o cerebelo é útil para posicionar o filhote de cachorro da cabeça sobre a borda do bloco para melhorar o acesso à parte traseira do crânio. O filhote pode ser fixado no local com um band-aid, se desejar.
- Segure o filhote a cabeça no lugar com uma mão enquanto a agulha é inserida manualmente através do crânio no local desejado com a outra mão. É útil para puxar a pele firmemente para evitar que se mova durante a injeção. Para o córtex é útil para fazer as injecções em relação a uma região anatômica bem definida, como a sutura lambda do crânio, pois isso ajuda em injecções futuro. O cerebelo pode ser visto através do crânio como uma fina tira de tecido que estão diretamente caudal ao colículo. A profundidade a que a agulha deve ser inserida varia ligeiramente entre animais individuais e as tensões e pode ser aferido por meio de marcadores pré-determinado na agulha, no entanto, para o córtex e cerebelo, descobrimos que uma profundidade de ~ 0,5 - 1mm da superfície é normalmente adequada. A profundidade de inserção de outros sites devem ser determinados experimentalmente pelo usuário final.
NOTA: A agulha deve penetrar facilmente o crânio; se não, NÃO forçar muito, pois isso pode ferir o animal. Reposicionar a agulha e delicadamente, tente novamente. - Injetar o vírus solução. A injeção é começared pressionando o botão START na bomba ou deprimente um pedal, dependendo do modelo de pressão injector usado. Na ausência de um pedal é recomendável ter um colega ajudar com pressionando o botão para minimizar os movimentos das mãos desnecessárias que podem afetar a injeção.
- Depois de o volume selecionado foi injetado, manter a agulha no lugar por alguns segundos e depois remova cuidadosamente a agulha, deslizando-o para fora sem problemas. Não esqueça de segurar o filhote a cabeça no lugar para minimizar os movimentos estranhos. Desde o equipamento de injeção é limpo e esterilizado entre experimentos com etanol ea ferida é pequena, o uso de anti-séptico é desnecessário.
- Coloque o filhote no fogão coberto com o ajuste de temperatura a ~ 38 ° C para aquecê-la para a recuperação, minutos tipicamente 5-10. Durante este tempo você pode continuar injetando outros filhotes.
- Depois de todos os filhotes tenham recuperado (eles devem ser rosa e em movimento) tomar uma parte da cama em casa e esfregar suavemente os filhotes com ele. Devolver os filhotes para a mãe como um grupo.
NOTA: É muito importante certificar-se os filhotes são quentes e expostos a cama em casa antes de devolvê-los para a mãe e para devolvê-los como um grupo. Não fazer isso pode resultar na mãe ferir ou matar os filhotes.
4. Limpeza de equipamentos
- Após a injeção é completa e os filhotes foram devolvidos para a mãe, limpa a configuração de injeção a plena carga a seringa com acetona ou etanol 70%. Lavar a solução com os tempos de injeção de configuração várias, utilizando solução nova a cada vez. Isto irá remover qualquer vírus solução restante e precipitados. A acetona ou etanol, então evaporar.
NOTA: A acetona é o preferido para a limpeza, mas se a sua instalação usa acetona quaisquer componentes sensíveis, como adesivos de cianoacrilato, em seguida, usar álcool 70% para essas etapas. - Desinfetar a área de trabalho com os resíduos de lixívia e descarte em um recipiente adequado de risco biológico.
5. Análise
- Sacrifício dos animais na idade desejada utilizando um método de eutanásia IACUC aprovado. Fixação de perfusão é recomendada para auxiliar na posterior visualização dos neurônios infectados, principalmente em animais adultos.
- Procedimentos de imunomarcação padrão pode ser usado para amplificar o sinal fluorescente. Resumidamente, 100 mm flutuante seções vibratome são permeabilizadas com PBS 1% Triton X-100 e bloqueada em PBS 1% Triton X-100 soro de cabra 10% normal. Seções são incubados em solução de bloqueio com anticorpos primários overnight a 4 ° C, seguido de lavagem e adicionais de bloqueio. As seções são então incubadas em solução de bloqueio com anticorpos secundários por 2 horas em temperatura ambiente, lavados, montados em lâminas e lamínulas com anti-fade meios de montagem. Criosecções também pode ser usado para visualizar os neurônios rotuladas, porém a fluorescência endógena pode ser perdida.
6. Resultados representativos:
Um procedimento de injeção de sucesso irá produzir infecção robusta de neurônios na região do local de injecção, sem danos aos tecidos observáveis ou outros efeitos nocivos sobre o animal. Como ilustrado na figura 1, a disseminação da infecção pode ser observado na Cre-repórter camundongos (ROSA26R) 12 injetados com rAAV8-Cre em vários sítios anatômicos. Injeções em regiões específicas, como córtex e colículo superior, normalmente geram infecções locais com spread mínimo para regiões adjacentes (Fig. 1A-B). Uso de solução de alta titulação do vírus torna a infecção de áreas adjacentes, tais como o hipocampo, o mais provável (Fig. 1A). Injeção com baixo título resultados vírus solução em infecção esparsos, que normalmente permanece perto do local da injeção, como mostrado na injeção cerebelar de rAAV8-Cre na linha média de ratos repórter ROSA26R (Figura 1C-D). Temos observado em camundongos recombinação repórter ROSA26R dentro de 2 dias após a injeção de rAAV8-Cre, sugerindo que a infecção, recombinação e expressão de genes repórter podem ocorrer de forma relativamente rápida. Além disso, temos utilizado com sucesso esta técnica para estudar os efeitos da deleção do gene em um locus não-ROSA usando um alelo floxed condicional, cujos resultados serão publicados em outros lugares.
O número de células infectadas devem correlacionar com o título da solução injetada viral. Por exemplo, injetando uma mistura de soluções de alto título de dois rAAV8 vírus expressar diferentes proteínas fluorescentes para o cerebelo infecta muitas células de Purkinje que são diferencialmente marcada (Fig. 2A). Por outro lado, a injeção de uma solução de baixo título vírus pode resultar em infecção escassa para ajudar na visualização de uma única célula (Fig. 2B). Neurônios fluorescente etiquetado pode ser observada diretamente no corte fresco, o tecido vivo (Fig. 2B) ou pode ser submetido à imunocoloração para melhorar os sinais endógenos fluorescentes para aquisição de imagem mais tarde por campo-grande ou comicroscopia fluorescente nfocal (Fig. 2A, fig. 3A-C). Por último, rAAV8 é capaz de infectar uma variedade de tipos de neurônios no córtex com forte rotulagem dos processos fina (Fig. 3A-C).
Figura 1: LacZ coloração no cérebro de ratos repórter ROSA26R que foram injetados com rAAV8-Cre Cre em P0 demonstra a atividade eo local de infecção.
- Grande campo de visão sagital de um cérebro P14 mostrando alto título (1x10 12 GC / ml) injeções no córtex e colículo superior. O uso de vírus alto título torna mais provável que as áreas adjacentes também serão infectados.
- Corte sagital da P14 córtex injetado com baixo título (1x10 11 GC / ml) de vírus demonstra uma infecção local com menos divulgação.
- Uma visão wholemount de um cerebelo P28 injetado na linha média com título baixo (1x10 9 GC / ml) solução vírus mostra que a infecção é escasso e, normalmente, permanece perto do local da injeção.
- Corte sagital da linha média do cerebelo em C). Note-se que geralmente apenas células de Purkinje são infectadas por rAAV8.
Figura 2: rotulagem cerebelar por injeção com títulos altos e baixos de rAAV8 expressando proteínas fluorescentes.
- Uma seção sagital da P21cerebellum infectado com uma mistura de dois vírus expressando EGFP (verde) e DsRed (vermelho). Uma mistura de vírus de alto título foi usado para infectar um grande número de células Purkinje.
- Uma célula de Purkinje no cerebelo P14 ao vivo de uma infecção viral muito baixa título imaged imediatamente após a dissecção.
Figura 3: rotulagem Cortical por rAAV8-DsRed.
Exemplos da variedade de tipos de neurônios corticais em cortes coronais de um córtex P21 que foi infectado por rAAV8-DsRed em P0.
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Discussion
O método de injeção neonatal viral apresentado aqui fornece uma maneira simples e rápida de gerar em mosaicos vivo para o estudo do desenvolvimento do cérebro pós-natal. O método aproveita floxed alelos que estão atualmente disponíveis, bem como aqueles que estão sendo feitas através do Gene High Throughput Segmentação do projeto 6. Comparado ao uso da expressão transgênica de Cre, este método fornece uma maneira rápida de testar a função do gene em vários tipos celulares, como ratos portadores do alelo floxed podem ser usados diretamente para experiências, e todo o procedimento de injeção de vírus do começo ao fim pode ser realizado em menos de uma hora. Além disso, o número de células infectadas pode ser facilmente controlado alterando o título do vírus, o que permite rotulagem esparsos de neurônios individuais. Embora nós só descreveu a morfologia neuronal nas imagens da amostra, a análise de neurônios infectados pode ser expandida para muitos importantes processos de desenvolvimento, incluindo o crescimento axonal e dendrítico, ramificação e azulejos, bem como o desenvolvimento sináptico como morfogênese espinha.
As três partes mais críticas do processo são a precisão da segmentação local da injeção, a confiabilidade do equipamento de injecção, e para a sobrevivência dos filhotes. O primeiro aspecto - Precisão - é melhor aprendida através da experiência. A confiabilidade do equipamento de injeção refere-se ao fato de que é preciso se certificar que não há obstruções, vazamentos ou outros problemas com o equipamento antes da injeção. Por fim, a sobrevivência dos filhotes normalmente não é um problema se as dicas mencionadas no Passo 3,7 são seguidas.
Uma modificação óbvia deste procedimento é a utilização de uma mistura de vírus de expressar genes diferentes. Por exemplo, uma mistura de dois vírus, rAAV-Cre-GFP e rAAV-RFP, pode ser injetado para produzir um mosaico de knockout escassamente rotulada (verde) e (vermelho) controle de células em um único animal. Isto proporciona uma vantagem distinta sobre gene knockouts tradicionais para a análise de uma única célula, tornando-se particularmente útil para análise morfológica de neurônios do tipo selvagem ou alelos mutantes no cérebro do rato mesmo. Isso também pode ser uma limitação, no entanto, se se deseja realizar estudos de comportamento, em que pode ser necessário para manipular um grande número de neurônios para produzir um efeito observável. Nós achamos que podemos realizar injeções em geral até a idade pós-natal 3 (P3), porém de idade P4 e no crânio é muitas vezes demasiado grosso para facilmente furar com a agulha de injeção. A espessura do crânio em uma determinada idade pode variar de animal para animal, no entanto, assim que esta questão deve ser avaliada pelo experimentador.
Além de usar as proteínas fluorescentes expressa da Cre-expressando vírus, muitos ratos repórter fluorescente com os alelos loxP-STOP-loxP foram gerados 13 e podem ser incorporados com o alelo floxed. Embora incluindo o novo alelo acrescenta o tempo necessário para a obtenção dos camundongos com genótipos apropriados, estes ratos repórter pode monitorar simultaneamente Cre atividade e neurônios individuais rótulo.
Por causa do tropismo seletivo de rAAVs recombinante, diferentes tipos de células neuronais podem ser rotulados em regiões anatômicas, escolhendo um sorotipo rAAV particular (Figura 1D). A especificidade também pode ser conseguido através de diferentes promotores. Além disso, outros vírus, como lentivírus, pode ser usado para infectar neurônios 10. A vantagem aqui é que esses vírus podem levar pastilhas maiores DNA para expressar não só Cre mas também outros materiais genéticos, como genes dominantes shRNA e ativo. Além disso, o método pode ser usado também nos ratos recém-desenvolvido transgênicos 14, onde as linhas condicionalmente expressa Cre não estão bem estabelecidos. Finalmente, uma vez que esta técnica é estabelecido no laboratório, ele pode ser combinado com outras ferramentas analíticas, tais como in vivo de dois fótons de imagens 11 e / ou eletrofisiologia, para estudar a função de cada gene no desenvolvimento do circuito neural e função.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este trabalho é apoiado por uma bolsa de RO1 NIH (NINDS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| rAAV8-Cre, -GFP, -DsRed, | Vector Biolabs | #7060, #7061, custom order | http://www.vectorbiolabs.com |
| Harvard Pump 11 Plus | Harvard Apparatus | #702208 | (No foot pedal port) |
| Retinal Pigment Epithelium Injection Kit | World Precision Instruments, Inc. | RPE-KIT | Contains connective tubing, injection needles (36G), and needle holder |
| NanoFil Syringe, 100μl | World Precision Instruments, Inc. | NANOFIL-100 | Includes reusable loading needle |
| D-PBS | Invitrogen | 14040-117 | |
| GFP antibody | Aves | GFP-1020 | |
| DsRed antibody | Clontech Laboratories | 632496 | |
| Heating Block | VWR international | 97042-610 | |
| ROSA26R mouse | Jackson Laboratory | 003309 |
References
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