Summary
Un
Abstract
Función normal del cerebro se basa no sólo en el desarrollo embrionario, cuando las principales vías neuronales se establecen, sino también sobre el desarrollo postnatal cuando los circuitos neuronales son maduros y refinados. Regulación deficiente en esta etapa puede conducir a trastornos neurológicos y psiquiátricos como el autismo y la esquizofrenia 1,2. Muchos genes han sido estudiados en el cerebro prenatal y se encontró crucial para muchos procesos de desarrollo 3.5. Sin embargo, su función en el cerebro postnatal se desconoce, en parte debido a su eliminación en ratones conduce a menudo a mortalidad durante el desarrollo neonatal, y en parte porque sus requerimientos en el desarrollo temprano dificulta el análisis post-natal. Para superar estos obstáculos, los alelos floxed de estos genes se están generando en los 6 ratones. Cuando se combina con alelos transgénicos que expresan la recombinasa Cre en tipos celulares específicos, la supresión condicional se puede lograr para estudiar la función génica en el cerebro postnatal. Sin embargo, este método requiere alelos adicionales y el tiempo extra (3-6 meses) para generar los ratones con genotipos apropiados, lo que limita la expansión del análisis genético a gran escala en el cerebro del ratón.
Aquí se demuestra un enfoque complementario que utiliza de forma viral, expresa Cre para estudiar estos alelos floxed rápida y sistemáticamente en el desarrollo cerebral postnatal. Mediante la inyección de recombinante virus adeno-asociados (rAAVs) 7,8 codificación Cre en el cerebro neonatal, que son capaces de eliminar el gen de interés en las diferentes regiones del cerebro. Al controlar el título viral y coexpressing un marcador de la proteína fluorescente, que al mismo tiempo se puede lograr la inactivación de genes mosaico y etiquetado neuronal escaso. Este método evita la necesidad de muchos genes en el desarrollo temprano, y nos permite estudiar la función de las células autónomas en muchos procesos críticos en el desarrollo cerebral postnatal, incluyendo el crecimiento axonal y dendrítico, ramas, y los azulejos, así como la formación de sinapsis y refinamiento. Este método ha sido utilizado con éxito en nuestro propio laboratorio (resultados no publicados) y otros 8,9, y se puede ampliar a otros virus, como lentivirus 9, así como a la expresión de shRNA o dominante proteínas activas 10. Por otra parte, mediante la combinación de esta técnica con la electrofisiología, así como de reciente desarrollo de herramientas de imagen óptica 11, este método ofrece una nueva estrategia para estudiar cómo las vías genéticas influyen en el desarrollo de circuitos neuronales y la función en ratones y ratas.
Protocol
1. Los virus de la preparación para la inyección
- rAAVs fueron adquiridos por el proveedor recomienda comerciales, pero también pueden ser producidos en un laboratorio de propio (véase más adelante). La solución del virus se produce normalmente a un título de 1x10 ~ 12 copias del genoma por mililitro (GC / ml) y se puede utilizar en título completo de manipular un gran número de células. Alternativamente, pueden ser diluidos para producir el nivel deseado de etiquetado escasa. La dilución apropiada debe ser determinada por el usuario, pero una dilución 1:10 se recomienda para empezar.
- Descongele los virus en el hielo inmediatamente antes del uso. La transferencia de la deseada pre-dilución de una solución de virus en un pequeño (250μl) del tubo de PCR. Diluir la solución de virus con un volumen adecuado de DPBS estériles en una campana de cultivo de tejidos. Guarde la solución virus diluido en hielo hasta que se necesite.
NOTA: El manejo de todos los virus debe llevarse a cabo de acuerdo con un protocolo de bioseguridad aprobadas por su institución
2. Jeringa de carga y montaje de equipos
- Conecte la aguja de carga a la jeringa de vidrio y elaborar la solución de virus del tubo de PCR tirando suavemente del émbolo. Tire del émbolo hasta que una burbuja muy pequeña de aire se puede ver en la jeringa, lo que indica que toda la solución está en la jeringa y no se queda en la aguja de carga. Por otra parte, una pequeña cantidad de tinte inerte se puede agregar a la solución para que sea visible.
NOTA: Un pequeño tubo de PCR debe utilizarse como la aguja de carga no suele ser lo suficientemente largo para llegar al fondo de la mayoría de los otros tubos. - Retire la aguja de carga y coloque la jeringa en el bloque de la jeringa de una bomba de inyección, asegurando que con el retén de la jeringa.
- Introduzca suavemente un extremo del tubo conectivo en la jeringa, inserte el otro extremo en el soporte de la aguja. Insertar la aguja de inyección en el porta-agujas. El final de la aguja de inyección debe comunicarse directamente con el final de la tubería en el interior conectivo del titular de la aguja.
- Lentamente el émbolo para empujar manualmente la solución a través del tubo conectivo. Presione hasta que una pequeña gota de solución es visible en la punta de la aguja de inyección.
- Coloque con cuidado el émbolo junto al bloque de empuje y seguro en su lugar con el soporte de bloques de empuje.
- Establezca los parámetros de inyección: la tasa de inyección debe ser de aproximadamente 8μl/min (~ 130nl / s), volumen de inyección es típicamente 1-2UL, seleccionar el diámetro de la jeringa apropiada para el tamaño de la jeringa que está utilizando (consulte el manual de la bomba de jeringa para obtener consejo).
- Ajuste la placa de ~ 38 ° C y se cubre con una toalla de papel o delgada barrera para proteger a otros de los cachorros durante la fase de recuperación.
3. Inyección de procedimiento y la recuperación de las crías
- Prepare P0 o P1 crías de ratón para la inyección, sometiéndolos a la anestesia en frío después de un protocolo de IACUC aprobado. Humedezca una toalla de papel algunas con agua y colocar sobre el hielo. Coloque el número deseado de las crías (4-5) en la toalla de papel (mantenerlos bien separados) y tapa con cuidado las toallas de papel sobre las crías por lo que están cubiertos por una toalla de papel húmeda. Con cuidado, coloque una pequeña cantidad de hielo picado en la parte superior de las toallas de papel y se incuban las crías durante aproximadamente 5 minutos. Las crías pueden ser mantenidas en hielo durante 15 minutos y se recuperan bien después.
- Después de que el cachorro es lo suficientemente anestesiado, colóquelo en un bloque de montaje (se utiliza un bloque de poliestireno que normalmente tiene 15 ml tubos) y la posición de mejor acceso al sitio de la inyección. De la corteza es más fácil de acostar a la de los animales en su vientre, mientras que para el cerebelo es útil a la posición del perrito de la cabeza sobre el borde del bloque para mejorar el acceso a la parte posterior del cráneo. El cachorro se puede asegurar en su lugar con una banda de ayuda, si así lo desea.
- Sostenga la cabeza del cachorro en su lugar con una mano mientras la aguja se inserta manualmente a través del cráneo en el sitio deseado con la otra mano. Es útil para tirar de la piel tirante para evitar que se mueva durante la inyección. De la corteza es útil para que las inyecciones con respecto a un punto de referencia anatómicos bien definidos, tales como la sutura lambda del cráneo, ya que esto ayuda en forma de inyecciones en el futuro. El cerebelo se puede ver a través del cráneo con una tira delgada de tejido que se encuentra directamente al colículo caudal. La profundidad a la que se debe insertar la aguja varía ligeramente entre los distintos animales y las tensiones y se puede medir por los marcadores predeterminados en la aguja, sin embargo, por la corteza y el cerebelo nos encontramos con que una profundidad de ~ 0,5 - 1 mm de la superficie es generalmente adecuado. La profundidad de inserción de otros sitios deben ser determinados experimentalmente por el usuario final.
NOTA: La aguja debe penetrar fácilmente el cráneo, y si no, no empuje demasiado duro, ya que puede lastimar al animal. Vuelva a colocar la aguja y trate de nuevo. - Inyectar la solución de virus. La inyección es empezared pulsando el botón START en la bomba o presionando un pedal de pie, según el modelo de la presión de inyección utilizada. En ausencia de un pedal de pie, se recomienda contar con un colega ayudar con pulsar el botón para reducir al mínimo los movimientos innecesarios que pueden afectar a la mano de la inyección.
- Después de que el volumen seleccionado se ha inyectado, mantener la aguja en su lugar durante unos segundos y luego retire con cuidado la aguja deslizándola a cabo sin problemas. Asegúrese de sostener la cabeza del cachorro en su lugar para reducir al mínimo los movimientos extraños. Desde el equipo de inyección se limpia y esteriliza entre los experimentos con etanol y la herida es pequeña, el uso de antisépticos no es necesario.
- Colocar al cachorro sobre la placa cubierta con el conjunto de la temperatura a ~ 38 ° C para que se caliente para la recuperación, normalmente, un 5-10 minutos. Durante este tiempo usted podrá seguir inyectando otros cachorros.
- Después de que todos los cachorros se han recuperado (deben ser de color rosa y en movimiento) tomar una parte de la ropa de cama de su casa y frote suavemente a los cachorros de la misma. Volver a los cachorros a la madre como un grupo.
NOTA: Es muy importante asegurarse de que los cachorros son cálidos y expuestos a la ropa de cama de su casa antes de devolverlos a la madre y su devolución como un grupo. El no hacerlo puede dar lugar a la madre hiriendo o matando a los cachorros.
4. Equipo de limpieza
- Después de la inyección se ha completado y los cachorros han sido devueltos a su madre, limpia la configuración de la inyección mediante la plena carga de la jeringa con acetona o etanol al 70%. Enjuague la solución a través de los tiempos de inyección de configuración de varios, con una solución fresca cada vez. Esto quitará cualquier solución de virus restantes y se precipita. La acetona o etanol luego se evapora.
NOTA: La acetona es preferido para la limpieza, pero si utiliza la configuración de los componentes de acetona-sensibles, tales como los adhesivos de cianoacrilato, a continuación, utilizar etanol al 70% de estos pasos. - Desinfectar el área de trabajo con los residuos de lejía y deseche en un contenedor de riesgo biológico correspondiente.
5. Análisis
- Sacrificio de los animales a la edad deseada usando un método aprobado IACUC la eutanasia. Fijación por perfusión se recomienda para ayudar en la visualización posterior de las neuronas infectadas, en particular en los animales adultos.
- Procedimientos estándar de tinción puede ser usado para amplificar la señal fluorescente. En pocas palabras, 100 micras flotante secciones vibratome se permeabilized con PBS 1% Triton X-100 y se bloquean en PBS 1% Triton X-100 en suero normal de cabra 10%. Las secciones se incuban en solución de bloqueo con anticuerpos primarios noche a 4 ° C, seguido por lavado y bloqueo adicional. Las secciones se incuban en solución de bloqueo con anticuerpos secundarios durante 2 horas a temperatura ambiente, se lavan a fondo, montados en portaobjetos y cubreobjetos con anti-fade medios de montaje. Cryosections también se puede utilizar para visualizar neuronas marcadas, sin embargo, la fluorescencia endógena podría perderse.
6. Los resultados representativos:
Un procedimiento de inyección se produce con éxito la infección robusta de las neuronas en la región del sitio de la inyección, sin dañar el tejido observables u otros efectos dañinos sobre el animal. Como se ilustra en la Figura 1, la propagación de la infección puede ser observado en ratones Cre-periodista (ROSA26R) 12 inyectados con rAAV8-Cre en sitios anatómicos diferentes. Las inyecciones en regiones específicas, tales como la corteza y el colículo superior, por lo general generan infecciones locales con la extensión mínima de las regiones adyacentes (Fig. 1A-B). El uso de solución de alto título de virus hace que la infección de las áreas adyacentes, como el hipocampo, lo más probable (Fig. 1A). Inyección con resultados bajos títulos del virus en la solución de la infección escaso, que normalmente permanece cerca del sitio de la inyección, como se muestra en la inyección del cerebelo de rAAV8-Cre en la línea media de los ratones reportero ROSA26R (fig. 1C-D). Hemos observado la recombinación en los ratones reportero ROSA26R dentro de 2 días después de la inyección de rAAV8-Cre, lo que sugiere que la infección, la recombinación y la expresión de genes reportero todo puede ocurrir relativamente rápido. Además, se han utilizado con éxito esta técnica para estudiar los efectos de la deleción del gen en un locus no ROSA con un alelo condicional floxed, cuyos resultados serán publicados en otros lugares.
El número de células infectadas debe correlacionarse con el título de la solución viral inyectada. Por ejemplo, la inyección de una mezcla de soluciones de alto título de dos rAAV8 virus expresando diferentes proteínas fluorescentes en el cerebelo infecta a muchas células de Purkinje que son diferencialmente etiquetados (Fig. 2A). Por el contrario, la inyección de una solución de bajo título de virus puede ocasionar infección escasa para ayudar en la visualización de las células individuales (Fig. 2B). Neuronas marcados con fluorescencia se puede observar directamente en el nuevo corte, tejido vivo (Fig. 2B), o pueden ser objeto de inmunotinción para mejorar las señales endógenas fluorescentes para la adquisición de la imagen más tarde por todo el campo o co-microscopía fluorescente nfocal (Fig. 2A, la figura. 3A-C). Por último, rAAV8 es capaz de infectar una gran variedad de tipos de neuronas en la corteza con el etiquetado de los procesos de fuerte multa (Fig. 3A-C).
Figura 1: tinción LacZ en el cerebro de los ratones reportero ROSA26R que fueron inyectados con rAAV8 Cre-P0 demuestra en la actividad Cre y la localización de la infección.
- Amplio campo de visión sagital del cerebro de un P14 que muestra título elevado (1x10 12 GC / ml) inyecciones en la corteza y el colículo superior. El uso de virus de alto título, es más probable que las áreas adyacentes también estarán infectados.
- Corte sagital de la corteza P14 inyectados con menor título (1x10 11 GC / ml) del virus demuestra una infección local con menos difusión.
- Un punto de vista de un cerebelo wholemount P28 inyecta en la línea media con título bajo (1x10 9 GC / ml) del virus muestra que la infección es escasa y por lo general se mantiene cerca del punto de inyección.
- Sagital de la línea media del cerebelo en la C). Tenga en cuenta que las células de Purkinje en general, sólo están infectadas por rAAV8.
Figura 2: etiquetado cerebelosa por inyección con títulos altos y bajos de rAAV8 expresan proteínas fluorescentes.
- Un corte sagital de P21cerebellum infectadas con una mezcla de dos virus que expresan EGFP (verde) y DsRed (rojo). Una mezcla de alto título de virus se utilizó para infectar un gran número de células de Purkinje.
- Una célula de Purkinje del cerebelo en vivo P14 de la infección viral muy baja título imágenes inmediatamente después de la disección.
Figura 3: etiquetado cortical por rAAV8-DsRed.
Ejemplos de la variedad de tipos de neuronas corticales en las secciones coronal de una corteza P21 que estaba infectada por rAAV8-DsRed en P0.
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Discussion
El método de inyección neonatal viral que aquí se presenta ofrece una forma sencilla y rápida para generar mosaicos en vivo para el estudio del desarrollo del cerebro postnatal. El método tiene la ventaja de los alelos floxed que están actualmente disponibles, así como aquellos que se están realizando a través de los genes de alto rendimiento focalización del proyecto 6. En comparación con el uso de la expresión transgénica de la CRE, este método proporciona una forma rápida para probar la función de genes en diversos tipos celulares, como ratones portadores de los alelos floxed se puede utilizar directamente para los experimentos, y el procedimiento de inyección de virus entero de principio a fin se puede a cabo en menos de una hora. Además, el número de células infectadas pueden ser fácilmente controladas mediante la alteración del título del virus, lo que permite el etiquetado escaso de neuronas individuales. A pesar de que sólo se describe la morfología neuronal en las imágenes de muestra, el análisis de las neuronas infectadas se puede ampliar a muchos procesos importantes de desarrollo, incluyendo el crecimiento axonal y dendrítico, ramas y suelo de baldosas, así como el desarrollo sináptico como la morfogénesis de la columna vertebral.
Las tres partes más importantes de este procedimiento son la precisión de la focalización del punto de inyección, la fiabilidad de los equipos de inyección, y la supervivencia de las crías. El primer aspecto - precisión - se aprende mejor a través de la experiencia. La fiabilidad de los equipos de inyección se refiere al hecho de que uno debe asegurarse de que no existen obstrucciones, fugas u otros problemas con el equipo antes de la inyección. Por último, la supervivencia de las crías no suele ser un problema si los consejos mencionados en el Paso 3.7 se siguen.
Una modificación evidente de este procedimiento consiste en utilizar una mezcla de virus de la expresión de genes diferentes. Por ejemplo, una mezcla de dos virus, rAAV-Cre-GFP y rAAV RFP, se pueden inyectar para producir un mosaico de octavos de final poco marcado (verde) y control de las células (en rojo) en un solo animal. Esto proporciona una clara ventaja sobre los knock-outs genéticos tradicionales para el análisis de células individuales, lo que es especialmente útil para el análisis morfológico de las neuronas con el tipo salvaje o alelos mutantes en el cerebro mismo ratón. Esto también puede ser una limitación, sin embargo, si se quiere llevar a cabo estudios de comportamiento, en la que puede ser necesario para manipular un gran número de neuronas para producir un efecto observable. Nos encontramos con que en general pueden realizar inyecciones hasta la edad postnatal 3 (P3), sin embargo a partir de los P-4 y en el cráneo es con frecuencia demasiado espeso para facilidad de la punción con la aguja de inyección. El grosor del cráneo en una edad en particular puede variar de un animal a otro, sin embargo, por lo que este tema debe ser evaluado por el experimentador.
Además de utilizar las proteínas fluorescentes expresa a partir de la expresión de Cre-virus, muchos ratones reportero fluorescente con los alelos loxP-STOP-loxP se han generado 13 y se pueden incorporar con el alelo floxed. Si bien la inclusión del nuevo alelo añade el tiempo necesario para la obtención de los ratones con genotipos apropiados, estos ratones reportero al mismo tiempo puede supervisar la actividad de las neuronas y Cre etiqueta individual.
Debido al tropismo selectivo de rAAVs recombinante, diferentes tipos de células neuronales pueden ser etiquetados en las regiones anatómicas de la elección de un determinado serotipo rAAV (Figura 1D). La especificidad también se puede lograr mediante el uso de diferentes promotores. Además, otros virus, como lentivirus, puede ser usado para infectar a las neuronas 10. La ventaja aquí es que estos virus pueden llevar a grandes inserciones de ADN para expresar no sólo Cre sino también otros materiales genéticos, como siRNA y dominante genes activos. Además, el método puede ser utilizado también en las ratas recién desarrollado transgénicos 14, donde condicional expresa Cre líneas no están bien establecidos. Finalmente, una vez que esta técnica se establece en el laboratorio, que puede combinarse con otras herramientas de análisis, tales como in vivo de dos fotones de imágenes 11 y / o de electrofisiología, para estudiar la función de cada gen en el desarrollo de circuitos neuronales y la función.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Este trabajo es apoyado por una subvención del NIH RO1 (NINDS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| rAAV8-Cre, -GFP, -DsRed, | Vector Biolabs | #7060, #7061, custom order | http://www.vectorbiolabs.com |
| Harvard Pump 11 Plus | Harvard Apparatus | #702208 | (No foot pedal port) |
| Retinal Pigment Epithelium Injection Kit | World Precision Instruments, Inc. | RPE-KIT | Contains connective tubing, injection needles (36G), and needle holder |
| NanoFil Syringe, 100μl | World Precision Instruments, Inc. | NANOFIL-100 | Includes reusable loading needle |
| D-PBS | Invitrogen | 14040-117 | |
| GFP antibody | Aves | GFP-1020 | |
| DsRed antibody | Clontech Laboratories | 632496 | |
| Heating Block | VWR international | 97042-610 | |
| ROSA26R mouse | Jackson Laboratory | 003309 |
References
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