Summary
Недавно был разработан новый частиц агглютинации (РА) анализ использования молекулы рецептора вируса позволило быстро и легко идентификации полиовируса (PV). В этой статье мы покажем, процедура анализа ПА для идентификации PV.
Protocol
1. Подготовка обслуживания среды (ММ) и ростовой среды (ГМ)
Для приготовления ММ и ГМ см. полиомиелита руководства лабораторией ВОЗ 1. Среда Дульбекко изменение Орла (DMEM) с добавлением 2% эмбриональной телячьей сыворотки (FCS) и 10% FCS может быть использован в качестве заменителей ММ и ГМ соответственно.
2. Подготовка анти-PV антител
- Развести анти-PV антител (RIVM PV набрав сыворотки) путем добавления воды (0,5 мл на флакон) в каждый флакон с анти-PV антител (типа 1, 2 или 3). Добавить восстановленного решения антител (0,5 мл каждая) до 4,5 мл М.М. в отдельных помечены труб.
Примечание: Некоторые много анти-PV антитела поставляются в виде восстановленной форме (0,5 мл на флакон). Для таких много анти-PV антител, добавление воды для разведения не стоит. - Смешайте равные объемы восстановленных анти-PV антител. Для борьбы с PV1 +2, 2 +3 или 3 +1: смешать 1,8 мл каждый восстановленный антител (1,8 мл + 1,8 мл = 3,6 мл для каждой смеси). Для борьбы с PV1 +2 +3: смешать 1,2 мл каждого восстановленного антител (1,2 мл + 1,2 мл + 1,2 мл = 3,6 мл).
Примечание: П. В. образцы могут содержать смесь различных серотипов PV. Чтобы определить одного серотипа П. В. в образцах с примесью клипов, бассейны анти-PV антител (т.е. 1 +2, 2 +3, 3 +1, 1 +2 +3) не требуется. - Добавить 1 / 5 объема ФТС (0,72 мл) в каждый анти-PV (1 +2, 2 +3, 3 +1 или 1 +2 +3) антител (3,6 мл каждая) (окончательный 18,2% FCS).
Примечание: Добавление FCS для снижения неспецифической агглютинации частиц желатина вызваны антителами. - Держите антител бассейны при температуре -20 ° С до использования в анализе ПА.
3. Восстановление сенсибилизированных желатин частиц
- Добавить 1,5 мл разведения буфера включена в комплект один флакон сенсибилизированные частицы желатина (при условии, как лиофилизированный порошок).
- Хорошо перемешать, осторожно нажав
- Держите восстановленного сенсибилизированные частицы при 4 ° C. Восстановленный желатин частица может быть активным по крайней мере 2 недели хранить при температуре 4 ° С, но должны быть готовы как раз перед анализом.
Важное примечание:
Не смешивайте различные много сенсибилизированные частицы желатина, так как не-агглютинации образ сенсибилизированные частицы желатина могут отличаться от многих частиц. Для каждого эксперимента, единым лотом сенсибилизированных желатин частица должна быть использована.
4. PA-тест для выявления PV
- Подготовка микро-титрования пластины. Для идентификации одного образца вируса, нам нужно 5 скважин + по крайней мере одного отрицательного контроля (сенсибилизированные частицы без вирусов и антител, скважины № 6 в ниже. See No вируса и антител контроль в примере). Общее количество скважин составляет 5 х образцов + по крайней мере один элемент управления в анализе.
Важное примечание:
Пожалуйста, найдите хотя бы одного не вирус и антитела контроль в анализе. Один флакон сенсибилизированные частицы примерно для идентификации 10 образцов вируса. - Добавьте 12 мкл / лунку анти-PV антитела или ГМ микро-титрования пластины. Расположение пластин выглядит следующим образом (см. также Пример ниже). В образцах без антител (скважина № 1 и 6), добавить 12 мкл GM, а не анти-PV антител.
Важное примечание:
Если многие образцы П.В. должны быть проверены в этом анализе, пипетки или многоканальным дозатором бы полезно для этого шага.Скважина № 1 Скважина № 2 Скважина № 3 Скважина № 4 Скважина № 5 Скважина № 6 GM анти-P1 +2 +3 анти-P1 +2 анти-P2 +3 Ани-P1 +3 GM - Добавьте 12 мкл / лунку вируса образца. В одном образце без вируса (скважина № 6), добавить 12 мкл GM, а не вирус решение.
Примечание: Вирус образца супернатанта культуры инфицированных клеток, как правило, L20B клетки или клетки RD.
Важное примечание:
Если многие образцы П.В. должны быть проверены в данном анализе многоканальной пипетки бы полезно для этого шага.Скважина № 1 Скважина № 2 Скважина № 3 Скважина № 4 Скважина № 5 Скважина № 6 Вирус образца Вирус образца Вирус образца Вирус образца Вирус образца GM - Возьмите восстановленного сенсибилизированных решение частиц от 4 ° С до комнатной температуры, и мягко нажмите, чтобы полностью приостановить частиц.
Важное примечание:
После полного приостановления частиц нежный стук, частицы должны быть добавлены непосредственно на пластины перед взвешенных частиц осадковтэ и форма неоднородного решения. - Добавьте 25 мкл / лунку сенсибилизированные частицы всех скважин.
Важное примечание:
После добавления сенсибилизированные частицы, пластины должны немедленно подвергаться пластины смешивания, чтобы начать равномерный реакцию образцов. Таким образом, добавление сенсибилизированные частицы должна быть выполнена с помощью дозатора, чтобы минимизировать время задержки между образцами в своей тарелке. - Положите микро-титрования пластины на пластину смесителя и перемешайте пластины на 30 сек.
- Положите микро-титрования пластины на белой бумаге (для удобства визуального наблюдения) на столе при комнатной температуре (15 ~ 30 ° C) в течение 2 ч.
Важное примечание:
Не перемещайте пластину во время и после реакции для наблюдения за результатами и съемки фотографий. Формируется агглютинации не стабилен и легко нарушается путем перемещения плит. - Возьмите фотографии пластины.
Важное примечание:
Частичный вид на фотографии не могли дать достаточных данных для последующего анализа и рассмотрения результатов для интерпретации. Несколько фотографий должны быть приняты, чтобы охватить все скважин пластин упором на агглютинации образ скважин.
5. Интерпретация результатов
- Определение положительных и отрицательных скважин. Сравните агглютинация в пробах с этим об отсутствии вируса и антител контроля (осаждение частицы желатина, не агглютинации) (рис. 1 и 2). Изображения агглютинации, которые явно отличаются от вируса нет и нет антител контроль (без склеивания, отрицательного контроля) должны быть оценены как положительные, а также изображения агглютинации, которые похожи на отрицательного контроля должна оцениваться как негативный. Образцы, которые показывают ясно, но лишь частичное агглютинации могут рассматриваться как положительные, но запись как «Позитивный (частичная агглютинация) '.
- Определение PV. Интерпретировать результаты, основанные на положительных и отрицательных скважин с анти-PV антител для определения PV серотипов. Принцип интерпретации результат аналогичен нейтрализации испытаний в клеточной системы культуры (например, положительные на анти-P1 +2 антител указывает, что образец содержит тип 3 PV).
6. Представитель Результаты
Представитель ПА результате анализа П. В. идентификации показано на рисунке 1. Все PV штаммов образуется агглютинация сенсибилизированных частицы желатина (нет антител образцов). При наличии соответствующего анти-PV антителами, осаждение частицы желатина (без склеивания), аналогичный не вирус и не антитела контроль (отрицательный контроль) наблюдалось (например, PV1 (Сабина) в присутствии анти-P1 +2 или анти-P3 +1 антитела).
Рисунок 1. Определение PV с помощью анализа ПА. Вирус решения PV1 (Сабин), PV2 (Сабин) и PV3 (Сабин) (титр вируса 1,2 х 10 8 CCID 50 / 12 мкл, 8,2 х 10 7 CCID 50 / 12 мкл, и 3,5 х 10 7 CCID 50 / 12 мкл, соответственно) были использованы для идентификации с помощью анализа ПА. Нет вируса и нет антител контроль показал осаждения частицы желатина (без склеивания, отрицательный контроль).
Рисунок 2. Интерпретация Положительные и отрицательные скважин. Вирус решения PV1 (Сабин), PV2 (Сабин) и PV3 (Сабин) (титр вируса 2,4 х 10 8 CCID 50 / 25 мкл, 1,7 х 10 8 CCID 50 / 25 мкл, и 7,3 х 10 7 CCID 50 / 25 мкл, соответственно), разбавляли 1 / 20 до 1 / 320, а затем 25 мкл разбавленных образцов были исследованы с помощью анализа ПА без анти-PV антител.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Единственной точкой этого анализа ПА использования PVR молекулы, а не анти-PV антитела для выявления PV 2. Это позволяет специфическим взаимодействием сенсибилизированных желатин частиц с PV с равномерной близости ко всем трем серотипов П. В. 3-6. Мы использовали форму immunoadhesin из PVR (PVR-IgG2a) для сенсибилизации частицы желатина, так как мономерные формы PVR только умеренное сродство к одному сайт связывания на вириона (константа диссоциации ~ 10 -7 -8 М) 7, 8, и успешно наблюдается определенный агглютинация сенсибилизированных желатин частиц с изолирует PV. С высокой специфичностью и равномерное близость сенсибилизированные частицы, критические факторы идентификации PV в анализе П. А.: 1) титра вируса (по уважительным обнаружение П. П. анализ) и 2) интерпретации агглютинации (для правильной идентификации PV) .
Как правило, вирус титр PV изолятов в системе культуры клеток находится в диапазоне от 10 6 до 8 CCID 50 / 50 мкл. Пределы обнаружения ПА анализ (формирование полного агглютинации) для типа 1, 2 и 3 PV были 1.5x10 6 CCID 50, 5.3x10 5 CCID 50 и 9.1x10 5 CCID 50, соответственно 2. Анализ ПА правильно определил большинство PV изолирует даже в присутствии других не-PV энтеровирусов. Однако, для некоторых образцов содержали смесь различных серотипов П.В., незначительные серотипа не были обнаружены. Очистить агглютинации должна быть сформирована с достаточной титр вируса выше пределов обнаружения. В случае, если агглютинация в образце нет антител неясна или частичное, изолирует должны быть вновь усиливается в клетках RD увеличение титра 9.
Частичное агглютинация наблюдается при титра вируса был низким и чуть ниже пределов обнаружения. Очистить разница агглютинации с отрицательным контролем могут рассматриваться как положительный анализ ПА. Тем не менее, весьма тонкое различие от агглютинации оцениваются как положительные может ввести в заблуждение интерпретация результатов. Таким образом, результаты положительные (частичная агглютинация) должны использоваться в качестве вспомогательной информации для возможно вызвано незначительным серотипов изолятов. Тем не менее, эта информация будет полезна при последующем анализе (геномные последовательности изолятов PV или в режиме реального времени RT-PCR) предложили возможность того, что образец содержал смесь различных серотипов П.В., или только частичным агглютинации наблюдалось никакого образца антитела, где низкий титр вируса будет основной причиной неясными результатами.
Преимущество П. П. тест для идентификации в простоте процедуры и интерпретации результатов. Это позволило бы легко внедрение данного метода каждый лабораториях, проводящих PV изоляции с системой клеточной культуры, без предоставления специального оборудования, материалов и тренингов. Использование конкретного типа моноклональных антител может позволить развитие новый метод дифференциации PVs (дикого типа, так и вакцинного штамма, как), которые дают важную информацию о свойстве П. В. изолирует наряду с генетической дифференциации ОТ-ПЦР и геномной 10 секвенирования, 11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Souji Masujima является сотрудником Новый продукт конструкторского отдела, ООО Fujirebio
Acknowledgments
Мы благодарны Junko Вада за отличную техническую помощь. Мы благодарны профессору Акио Номото за любезно предоставленные вектор бакуловирус выражение для PVR-IgG2a. Это исследование было частично поддержана грантами-в-помощь для содействия ликвидации полиомиелита и исследованиям в области новых и вновь возникающих инфекционных заболеваний из Министерства здравоохранения, труда и социального обеспечения.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sensitized-gelatin particles | Fujirebio Inc. | Test kit | |
| Reconstitution buffer | Fujirebio Inc. | Test kit | |
| Microtitration plate | Fujirebio Inc. | Test kit | |
| Anti-PV antibody | RIVM |
References
- World Health Organization. Polio Laboratory Manual (4th edition) WHO/IVB/04.10. , 4th Edition, World Health Organization. (2004).
- Arita, M., Masujima, S., Wakita, T., Shimizu, H. Development of a particle agglutination method with soluble virus receptor for identification of poliovirus. J. Clin. Microbiol. 48, 2698-2702 (2010).
- Bibb, J. A., Witherell, G., Bernhardt, G., Wimmer, E. Interaction of poliovirus with its cell surface binding site. Virology. 201, 107-115 (1994).
- Koike, S. The poliovirus receptor protein is produced both as membrane-bound and secreted forms. Embo J. 9. , 3217-3224 (1990).
- Mendelsohn, C. Transformation of a human poliovirus receptor gene into mouse cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 83, 7845-7849 (1986).
- Mendelsohn, C. L., Wimmer, E., Racaniello, V. R. Cellular receptor for poliovirus: molecular cloning, nucleotide sequence, and expression of a new member of the immunoglobulin superfamily. Cell. 56, 855-865 (1989).
- Arita, M., Koike, S., Aoki, J., Horie, H., Nomoto, A. Interaction of poliovirus with its purified receptor and conformational alteration in the virion. J. Virol. 72, 3578-3586 (1998).
- McDermott, B. M., Rux, A. H., Eisenberg, R. J., Cohen, G. H., Racaniello, V. R. Two distinct binding affinities of poliovirus for its cellular receptor. J. Biol. Chem. 275, 23089-23096 (2000).
- Pipkin, P. A., Wood, D. J., Racaniello, V. R., Minor, P. D. Characterisation of L cells expressing the human poliovirus receptor for the specific detection of polioviruses in vitro. J. Virol. Methods. 41, 333-340 (1993).
- Avoort, H. G. vander Comparative study of five methods for intratypic differentiation of polioviruses. J. Clin. Microbiol. 33, 2562-2566 (1995).
- Kilpatrick, D. R. Rapid group-, serotype-, and vaccine strain-specific identification of poliovirus isolates by real-time reverse transcription-PCR using degenerate primers and probes containing deoxyinosine residues. J. Clin. Microbiol. 47, 1939-1941 (2009).
