Summary
最近开发的新颖的颗粒凝集法（PA）的测定利用病毒的受体分子，允许快速和容易识别的脊髓灰质炎病毒（PV）。在这篇文章中，我们将显示为光伏识别PA检测的过程。
Abstract
在全球根除脊髓灰质炎行动，从急性弛缓性麻痹（AFP）病例粪便标本中分离鉴定光伏实验室诊断起着至关重要的作用。在世界卫生组织（WHO）的全球脊髓灰质炎实验室网络，光电隔离和鉴定，目前正在通过细胞培养系统和实时RT - PCR检测，分别进行。在光伏根除后时期，简单和快速识别程序，将有利于快速确认在国家实验室的脊髓灰质炎病例。在本研究中，我们将展示的新型PA检测程序开发光伏鉴定。该PA检测采用光伏受体（PVR）的分子和病毒，是具体的和统一的光伏所有血清型的亲和力的互动。程序很简单（一个反应板的步骤程序）和反应2小时内可以得到快速的（结果），结果是直观地观察（观察明胶颗粒凝集）。
Protocol
1。维持液（MM）的制备和生长介质（GM）
对于MM和通用汽车公司的准备，请看到世界卫生组织 1脊髓灰质炎实验室手册。贝科改良Eagle培养基（DMEM），辅以2％胎牛血清（FCS）和10％FCS可以用作替代品的MM和通用分别。
2。反PV抗体的制备
- 重组反光伏的抗体（RIVM光伏输入抗血清），加入水（0.5％毫升小瓶），每小瓶抗PV抗体（1型，2或3）。将此重组抗体的解决方案（0.5毫升）4.5毫升的MM单独标记的试管。
注：反光伏抗体有些地段作为重组的形式，每小瓶（0.5毫升）提供。反光伏抗体等很多，除了用于重组的水是没有必要的。 - 混合同等体积的重组反光伏抗体。对于反的PV1 2，2 3，或3 +1：将每个重组抗体1.8毫升（1.8 ML + 1.8毫升= 3.6毫升为每个混合）。对于反的PV1 2 3：将每个重组抗体1.2毫升（1.2毫升+ 1.2毫升+ 1.2毫升= 3.6毫升）。
注：光伏样品可能包含的不同血清型的光伏的混合物。要确定单一血清型光伏PV的混合物样品，反PV抗体（即1 +2，2 +3 3 1 1 2 3）池是必要的。 - 每个反PV（1 2 2 3 3 +1或1 +2 +3）的抗体（3.6毫升）（最终18.2％FCS）FCS（0.72毫升）的1 / 5体积。
注：此外，为减少非特异性抗体引起的明胶颗粒凝集的FCS。 - 保持在-20 ° C，直到在PA的检测中使用的抗体池。
3。重组致敏明胶颗粒
- 加入1.5 mL的重组缓冲区套件中包括一小瓶致敏明胶颗粒（冻干粉）。
- 充分混匀，温柔攻
- 保持重组敏颗粒4 ° C。复原明胶颗粒可以活跃在4 ° C保存至少2周，但应检测前的准备。
重要注意事项：
不要混合使用不同致敏的明胶颗粒很多，因为非致敏明胶颗粒凝集的图像可以由很多的颗粒不同。对于每一个实验中，一个单一地段致敏明胶颗粒应该被使用。
4。 PA检测为光伏识别
- 准备一个微滴定板。识别一个病毒样本，我们需要5口井+，至少有一个阴性对照组（在下面没有病毒和抗体致敏粒子，以及＃6。看不到例病毒和抗体控制）。井总数是5 ×样品+中至少有一个控制检测。
重要注意事项：
请至少有一个无病毒的检测和抗体控制。一小瓶敏颗粒约10个病毒样本的鉴定。 - 加入12μL/孔反PV抗体或GM微滴定板。该板块的安排如下（见下面的例子）。无抗体（以及＃1和6）的样品，加入12μL的GM，而不是反光伏抗体。
重要注意事项：
如果许多光伏样品应在本实验测试，多道移液器或分配器将有助于这一步。那么＃1 好＃2 那么＃3 那么＃4 好＃5 那么＃6 通用汽车公司 抗- P1 2 3 抗- P1的2 抗- P2的3 ANI - P1的3 通用汽车公司 - 添加12μL/孔的病毒样本。在一个没有病毒样本（以及＃6），加12μL转基因，而不是病毒解决方案。
注：病毒样本是文化感染的细胞，通常L20B细胞或RD细胞上清。
重要注意事项：
如果许多光伏样品应在本实验测试，多道移液器将有助于这一步。那么＃1 好＃2 那么＃3 那么＃4 好＃5 那么＃6 病毒样本 病毒样本 病毒样本 病毒样本 病毒样本 通用汽车公司 - 从4℃重组敏颗粒解决方案，室温，轻轻拍打完全暂停粒子。
重要注意事项：
完成悬浮颗粒的温柔攻后，应立即添加颗粒板前的悬浮颗粒沉淀TE和形式的非均质的解决方案。 - 添加25μL/孔的井敏颗粒。
重要注意事项：
此外敏颗粒后，应立即受到板到板混合开始对样品的均匀反应。因此，除了敏颗粒应使用饮水机，以尽量减少板样品之间的时间滞后。 - 摆上一盘混频器的微滴定板和混合30秒板。
- 置于室温白纸上的微滴定板（为了方便目视观察）表（15〜30℃）2小时。
重要注意事项：
不要板块移动，期间和之后的结果进行观察和拍照的反应。形成凝集并不稳定，很容易通过移动板不安。 - 拿板的照片。
重要注意事项：
照片的部分观点不能给予足够的数据以供日后检查和解释的结果进行审查。应采取多张照片，涵盖所有板块的井，重点井的凝集形象。
5。结果的解释
- 正面和负面的井鉴定。比较样本中没有病毒和抗体控制（明胶颗粒，非凝集沉淀）（图1和2）的凝集。应判断为阳性凝集，显然是没有病毒，没有抗体控制（非凝集，阴性对照）杰出的图像，并凝集阴性对照，类似的图像，应判断为阴性。样本，显示清晰，但只是局部的凝集，可判断为阳性，但记录阳性（部分凝集）“。
- 确定的光伏。解释与反PV抗体的正面和负面的水井，以确定光伏血清型为基础的结果。结果的解释原理是相似的细胞培养体系中和试验（如抗- P1的2抗体阳性表明，样品中含有3光伏型）的。
6。代表性的成果
代表PA检测光伏鉴定结果如图1所示，所有的光伏株形成敏（无抗体样品）明胶颗粒凝集。在存在相应的反光伏抗体，没有病毒类似的明胶颗粒（非凝集）的降水和没有抗体控制（阴性对照）观察（例如，PV1（萨宾）中存在抗- P1的2反P3 1抗体）。
图1。由PA检测鉴定的PV1（萨宾）PV的病毒解决方案，PV2（萨宾）和PV3（萨宾）（1.2 × 10 8赛迪顾问50 / 12μL，8.2 × 10 7赛迪顾问50 / 12μL的病毒滴度，并3.5 × 10 7赛迪顾问50 / 12μL，分别）是用于识别由PA检测。没有病毒，没有抗体控制显示（非凝集，阴性对照）明胶颗粒沉淀。
图2。病毒解决方案的PV1（萨宾），PV2（萨宾）和PV3（萨宾）（病毒滴度为2.4 × 10 8赛迪顾问50 / 25μL，1.7 × 10 8赛迪顾问50 / 25μL，和释义的正面和负面的井 。 7.3 × 10 7赛迪顾问50 / 25μL，分别）稀释1 / 20到1 / 320，和25μL稀释的样本，然后由PA检测没有反光伏抗体检查。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
这个PA检测的独特之处是利用反光伏抗体，而不是2光伏检测PVR的分子。这允许特定的相互作用的一个统一的亲和力，所有三个血清型光伏3-6致敏的明胶颗粒与光伏。我们用于致敏的明胶颗粒immunoadhesin形式的PVR（PVR - IgG2a），因为单体形式的PVR只有适度的亲和力，以单一的结合位点上的病毒粒子（解离常数10 -7〜-8中号） 7， 8，成功地观察到具体的光伏株致敏明胶颗粒凝集。随着光伏鉴定的高特异性和高敏颗粒均匀亲和力，在PA检测的关键因素是：1）病毒滴度（有效的光伏检测法由PA）和2）凝集的解释（光伏正确识别） 。
一般而言，病毒滴度的光伏株在细胞培养系统是在10 6日至8赛迪顾问50 / 50μL的范围。 PA检测1型，2，3光伏（形成完整的凝集）的检出限分别为1.5x10 6赛迪顾问50 5.3x10 5赛迪顾问50和9.1x10 5赛迪顾问50，分别为2。正确识别大部分的光伏分离PA的检测，即使在其他非光伏肠道病毒的存在。然而，对于一些样品中的不同血清型的光伏的混合物，未成年人的血清型失败，被检测到。应清除凝集形成足够的病毒滴度的检测限以上。情况下，在没有抗体样本凝集不清或部分菌株应重新在RD细胞扩增增加滴度9。
部分凝集观察时，病毒滴度低，只是在检测限以下。凝集阴性对照明显的差异，可判断在PA检测阳性。然而，相当微妙的凝集差异来判断，作为积极的结果可能会误导解释。因此，结果阳性（局部凝集），应使用可能造成轻微的血清型的菌株的支持信息。然而，这些信息将帮助时，下面的分析（光伏分离或实时RT - PCR基因组测序）提出了一个可能性，样品中的不同血清型的光伏的混合物，或只有部分凝集没有抗体样本观察低的病毒滴度，将不清楚结果的重要原因。
PA光伏鉴定检测的优点是简单的程序和结果的解释。这将允许对每一个实验室进行细胞培养系统的光电隔离的检测的简单介绍，不提供特殊的设备，材料和培训。利用特定类型的单克隆抗体，可能允许分化的PV（野生型或疫苗株），将提供重要的光伏财产的信息的新方法的发展以及通过RT - PCR和基因组与遗传分化隔离排序10，11。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
搜集Masujima是新产品设计部，Fujirebio公司雇员
Acknowledgments
我们感谢为她出色的技术援助，以顺子和田。我们非常感谢昭雄野本教授请提供PVR - IgG2a杆状病毒表达载体。这项研究是通过资助部分支持，援助促进根除脊髓灰质炎和新出现和重新出现的传染病，卫生，劳工和福利部的研究。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sensitized-gelatin particles | Fujirebio Inc. | Test kit | |
| Reconstitution buffer | Fujirebio Inc. | Test kit | |
| Microtitration plate | Fujirebio Inc. | Test kit | |
| Anti-PV antibody | RIVM |
References
- World Health Organization. Polio Laboratory Manual (4th edition) WHO/IVB/04.10. , 4th Edition, World Health Organization. (2004).
- Arita, M., Masujima, S., Wakita, T., Shimizu, H. Development of a particle agglutination method with soluble virus receptor for identification of poliovirus. J. Clin. Microbiol. 48, 2698-2702 (2010).
- Bibb, J. A., Witherell, G., Bernhardt, G., Wimmer, E. Interaction of poliovirus with its cell surface binding site. Virology. 201, 107-115 (1994).
- Koike, S. The poliovirus receptor protein is produced both as membrane-bound and secreted forms. Embo J. 9. , 3217-3224 (1990).
- Mendelsohn, C. Transformation of a human poliovirus receptor gene into mouse cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 83, 7845-7849 (1986).
- Mendelsohn, C. L., Wimmer, E., Racaniello, V. R. Cellular receptor for poliovirus: molecular cloning, nucleotide sequence, and expression of a new member of the immunoglobulin superfamily. Cell. 56, 855-865 (1989).
- Arita, M., Koike, S., Aoki, J., Horie, H., Nomoto, A. Interaction of poliovirus with its purified receptor and conformational alteration in the virion. J. Virol. 72, 3578-3586 (1998).
- McDermott, B. M., Rux, A. H., Eisenberg, R. J., Cohen, G. H., Racaniello, V. R. Two distinct binding affinities of poliovirus for its cellular receptor. J. Biol. Chem. 275, 23089-23096 (2000).
- Pipkin, P. A., Wood, D. J., Racaniello, V. R., Minor, P. D. Characterisation of L cells expressing the human poliovirus receptor for the specific detection of polioviruses in vitro. J. Virol. Methods. 41, 333-340 (1993).
- Avoort, H. G. vander Comparative study of five methods for intratypic differentiation of polioviruses. J. Clin. Microbiol. 33, 2562-2566 (1995).
- Kilpatrick, D. R. Rapid group-, serotype-, and vaccine strain-specific identification of poliovirus isolates by real-time reverse transcription-PCR using degenerate primers and probes containing deoxyinosine residues. J. Clin. Microbiol. 47, 1939-1941 (2009).
