Summary
Une particule récemment développé une agglutination roman (PA) de dosage utilisant molécule réceptrice du virus a permis une identification rapide et facile de poliovirus (PV). Dans cet article, nous allons montrer la procédure pour le dosage de PA pour l'identification PV.
Abstract
Dans le Global Polio Eradication Initiative, le diagnostic de laboratoire joue un rôle crucial en isolant et en identifiant PV à partir des échantillons de selles de paralysie flasque aiguë (PFA). À l'Organisation mondiale de la Santé (OMS) Global Polio Laboratory Network PV isolement et l'identification sont actuellement effectuées en utilisant le système de culture cellulaire et en temps réel de RT-PCR, respectivement. Dans l'ère post-éradication de la PV, les procédures d'identification simple et rapide serait utile pour la confirmation rapide des cas de polio dans les laboratoires nationaux. Dans la présente étude, nous allons montrer la procédure du roman de PA test développé pour l'identification PV. Ce test utilise PA interaction du PV du récepteur numérique (PVR) et la molécule de virion qui est une affinité spécifique et uniforme pour tous les sérotypes de PV. La procédure est simple (une procédure étape en plaques de réaction) et rapide (les résultats peuvent être obtenus dans les 2 h de réaction), et le résultat est visuellement observé (observation de l'agglutination des particules de gélatine).
Protocol
1. Moyennes Préparation du milieu de maintenance (MM) et la croissance (GM)
Pour la préparation de MM et GM, s'il vous plaît consulter un manuel de laboratoire de la poliomyélite de l'OMS 1. Milieu de Dulbecco modifié Eagle (DMEM) supplémenté avec 2% sérum de veau foetal (FCS) et 10% de FCS pourrait être utilisés comme substituts de MM et GM, respectivement.
2. Préparation des anticorps anti-PV
- Reconstituer des anticorps anti-PV (RIVM PV tapant antisérum) par adjonction d'eau (0,5 ml par flacon) pour chaque flacon d'anti-PV anticorps (de type 1, 2 ou 3). Ajouter cette solutions d'anticorps reconstitué (0,5 ml chacun) de 4,5 mL de MM dans des tubes étiquetés séparément.
Remarque: Certains lots de l'anti-PV anticorps sont fournis en tant que forme reconstituée (0,5 ml par flacon). Pour ce lot d'anti-PV anticorps, ajout d'eau pour la reconstitution n'est pas nécessaire. - Mélanger un volume égal de reconstituer anti-PV anticorps. Pour les anti-PV1 2, 2 3, 1 ou 3: Mélanger 1,8 ml de chaque anticorps reconstitué (1,8 ml + 1,8 ml = 3,6 ml pour chaque mélange). Pour les anti-PV1 2 3: Mélanger 1,2 ml de chaque anticorps reconstitué (1,2 ml + 1,2 ml + 1,2 ml = 3,6 ml).
Remarque: Les échantillons de PV pourraient contenir un mélange de différents sérotypes de PV. Pour identifier seul sérotype de PV dans les échantillons avec un mélange de PV, les piscines de l'anti-PV anticorps (c'est à dire 1 +2, 2 +3, 3 +1, 1 +2 +3) est nécessaire. - Ajouter le volume 1 / 5 de FCS (0,72 ml) à chaque anti-PV (1 +2, 2 +3, 3 +1, ou 1 +2 +3) d'anticorps (3,6 ml chacune) (dernière 18,2% de FCS).
Remarque: Ajout de FCS est pour la réduction de la non-spécifiques agglutination de particules de gélatine causée par des anticorps. - Gardez les piscines d'anticorps à -20 ° C jusqu'à leur utilisation dans le dosage de l'AP.
3. Reconstitution de particules de gélatine sensibilisées
- Ajouter 1,5 mL de tampon de reconstitution inclus dans le kit d'un flacon de particules de gélatine sensibilisées (à condition que poudre lyophilisée).
- Mélangez bien en tapotant légèrement
- Gardez la particule reconstituée sensibilisés à 4 ° C. Reconstitué particules de gélatine pourrait être actif au moins 2 semaines conservés à 4 ° C, mais doit être préparé juste avant le dosage.
Note importante:
Ne mélangez pas beaucoup différents de particules de gélatine sensibilisées, car l'image non-agglutination de particules de gélatine sensibilisées peuvent être différents par le nombre de particules. Pour chaque expérience, un seul lot de particules de gélatine sensibilisées doivent être utilisés.
4. PA test d'identification pour le PV
- Préparer une plaque de micro-titrage. Pour l'identification d'un échantillon de virus, nous avons besoin de 5 puits + au moins un contrôle négatif (particule sensibilisée sans virus et les anticorps, ainsi n ° 6 ci-dessous. See No de contrôle des virus et des anticorps dans l'exemple). Nombre total de puits est de 5 échantillons x + au moins un contrôle dans le dosage.
Note importante:
S'il vous plaît prenez au moins un virus et pas de contrôle d'anticorps dans le dosage. Un flacon de particule sensibilisée est d'environ 10 pour l'identification des échantillons de virus. - Ajouter 12 ul / puits d'anticorps anti-PV d'anticorps ou de GM à la plaque de titration de micro-. L'agencement de la plaque est comme suit (Voir aussi l'exemple ci-dessous). Dans les échantillons sans anticorps (puits # 1 et 6), ajouter 12 ul de GM au lieu de l'anti-PV anticorps.
Note importante:
Si de nombreux échantillons PV doivent être testés dans cet essai, pipette multicanaux ou un distributeur serait utile pour cette étape.Eh bien # 1 Eh bien # 2 Eh bien # 3 Eh bien # 4 Eh bien # 5 Eh bien # 6 GM anti-P1 +2 +3 anti-P1 2 anti-P2 3 Ani-P1 3 GM - Ajouter 12 ul / puits d'échantillon du virus. Dans un échantillon sans virus (puits # 6), ajouter 12 ul de GM au lieu d'une solution de virus.
Remarque: l'échantillon de virus est surnageant de culture de cellules infectées, les cellules ou les cellules L20B généralement RD.
Note importante:
Si de nombreux échantillons PV doivent être testés dans cet essai, pipette multicanaux serait utile pour cette étape.Eh bien # 1 Eh bien # 2 Eh bien # 3 Eh bien # 4 Eh bien # 5 Eh bien # 6 échantillon de virus échantillon de virus échantillon de virus échantillon de virus échantillon de virus GM - Prenez la solution reconstituée particule sensibilisée à partir de 4 ° C à la température ambiante, et tapotez doucement à suspendre totalement les particules.
Note importante:
Après la suspension complète des particules en tapotant légèrement, les particules doivent être ajoutés immédiatement aux plaques avant la précipitation des particules en suspensionte et la forme non homogène solution. - Ajouter 25 ul / puits de particule sensibilisée à tous les puits.
Note importante:
Après l'ajout de particules sensibilisées, la plaque doit être immédiatement soumis à la plaque de mélange pour démarrer la réaction uniforme des échantillons. Par conséquent, l'ajout de particules sensibilisées doit être effectuée en utilisant distributeur de minimiser un décalage entre les échantillons de la plaque. - Mettez la plaque de titration de micro-sur une plaque de mélangeur et mélanger la plaque pendant 30 sec.
- Mettez la plaque de titration de micro-sur papier blanc (pour la commodité de l'observation visuelle) sur une table à la température ambiante (15 ~ 30 ° C) pendant 2 h.
Note importante:
Ne pas déplacer la plaque pendant et après la réaction pour l'observation des résultats et de prendre des photos. L'agglutination formé n'est pas stable et facilement perturbé par le déplacement des plaques. - Prenez des photos de la plaque.
Note importante:
Vue partielle des photos ne pouvait pas donner suffisamment de données pour examen ultérieur et l'examen des résultats d'interprétation. Plusieurs photos doivent être prises pour couvrir tous les puits des plaques en se concentrant sur l'image d'agglutination des puits.
5. Interprétation des résultats
- Identification des puits positifs et négatifs. Comparez l'agglutination dans les échantillons avec celle du Pas de contrôle du virus et d'anticorps (précipitation de particules de gélatine, non-agglutination) (figure 1 et 2). Images d'agglutination qui sont clairement distingués des Pas de virus et pas de contrôle d'anticorps (non-agglutination, témoin négatif) doit être considéré comme positif, et les images d'agglutination qui sont similaires au témoin négatif devrait être jugé comme négatif. Les échantillons qui montrent clairement l'agglutination, mais seulement partiel pouvait être qualifié de positif, mais le bilan comme «positive (agglutination partielle).
- Identification des PV. Interpréter les résultats basés sur des puits positifs et négatifs avec des anti-PV anticorps pour identifier les sérotypes PV. Principe de l'interprétation du résultat est similaire à celle du test de neutralisation du système de culture cellulaire (par exemple, positifs pour l'anti-P1 deux anticorps indique que l'échantillon contient de type 3 PV).
6. Les résultats représentatifs
Résultat représentatif de PA test d'identification PV est montré dans la figure 1. Toutes les souches PV formé agglutination de particules sensibilisées gélatine (Aucun anticorps des échantillons). En présence de correspondants anti-PV anticorps, les précipitations de particules de gélatine (non-agglutination) semblable à aucun virus et aucun contrôle des anticorps (témoin négatif) a été observée (par exemple, PV1 (Sabin) dans la présence d'anticorps anti-P1 +2 ou anti-P3 1 anticorps).
Figure 1. Virus solutions d'identification par analyse de PV PA. De PV1 (Sabin), PV2 (Sabin) et PV3 (Sabin) (titres de virus de 1,2 x 10 8 CCID 50 / 12 uL, 8,2 x 10 7 CCID 50 / 12 uL, et 3,5 x 10 7 CCID 50 / 12 uL, respectivement) ont été utilisés pour l'identification par test PA. Pas de virus et aucun contrôle des anticorps a montré la précipitation de particules de gélatine (non-agglutination, témoin négatif).
Figure 2. Interprétation des puits positifs et négatifs. Virus des solutions de PV1 (Sabin), PV2 (Sabin) et PV3 (Sabin) (titres de virus de 2,4 x 10 8 CCID 50 / 25 uL, 1,7 x 10 8 CCID 50 / 25 uL, et 7,3 x 10 7 CCID 50 / 25 uL, respectivement) ont été dilués 1 / 20-1 / 320, puis 25 uL d'échantillons dilués ont été examinés par un dosage PA sans anti-PV anticorps.
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Discussion
L'unique point de ce test PA est l'utilisation de la molécule au lieu PVR de l'anti-PV anticorps pour la détection de PV 2. Ceci permet une interaction spécifique des particules de gélatine sensibilisées avec PV avec une affinité uniforme à tous les trois sérotypes du PV 3-6. Nous avons utilisé une forme immunoadhésine de PVR (PVR-IgG2a) pour la sensibilisation des particules de gélatine, car les formes monomères de PVR ont seulement des affinités modérées au site de liaison unique sur le virion (constante de dissociation de 10 -7 -8 ~ M) 7, 8, et réussi à observer l'agglutination spécifique des particules de gélatine sensibilisées avec des isolats PV. Avec la haute spécificité et affinité uniforme des particules sensibilisées, les facteurs critiques de l'identification PV dans le dosage de PA sont: 1) le virus de titre (valables pour la détection de PV par PA dosage) et 2) l'interprétation de l'agglutination (pour l'identification correcte du PV) .
Généralement, le virus de titre de PV isole dans le système de culture cellulaire est dans une gamme de 6 à 8 octobre CCID 50 / 50 uL. Les limites de détection du dosage PA (formant une agglutination complète) de type 1, 2 et 3 PV ont été 1.5x10 6 CCID 50, 5.3x10 5 CCID 50, et 9.1x10 5 CCID 50, respectivement 2. Le test PA correctement identifié la plupart des PV isole, même en présence d'autres non-PV entérovirus. Cependant, pour certains échantillons contenaient un mélange de différents sérotypes de PV, le sérotype mineures n'ont pas pu être détecté. D'agglutination claires devraient être formés avec titre du virus suffisante au-dessus des limites de détection. Dans le cas où l'agglutination dans aucun échantillon anticorps n'était pas claire ou partielle, les isolats devraient être ré-amplifié dans les cellules de RD pour augmenter le titre 9.
Agglutination partielle a été observée lorsque le titre du virus est faible et juste en dessous des limites de détection. Nette différence d'agglutination du contrôle négatif pourrait être jugé comme positif dans le test PA. Toutefois, la différence très subtile de l'agglutination jugé comme positif susceptible de tromper l'interprétation des résultats. Par conséquent, les résultats de positive (agglutination partielle) devrait être utilisé comme information pour aider les possiblement causées par les sérotypes des isolats mineures. Toutefois, cette information serait utile lorsque l'analyse suivante (séquençage génomique des isolats PV ou en temps réel de RT-PCR) a suggéré une possibilité que l'échantillon contenait un mélange de différents sérotypes de PV, ou seulement d'agglutination partielle a été observée pour les anticorps Aucun échantillon où les le titre du virus faible serait la principale cause des résultats peu claire.
L'avantage de dosage de PA pour le PV d'identification est dans la simplicité de l'interprétation la procédure et le résultat. Cela permettrait une introduction facile de l'essai à chaque laboratoires qui effectuent l'isolement PV avec le système de culture cellulaire, sans fournir des équipements spéciaux, les matériaux, et des formations. L'utilisation des anticorps spécifiques monoclonaux pourraient permettre le développement de la nouvelle méthode pour la différenciation des PVs (type sauvage ou un vaccin, comme les souches) qui fournissent des informations importantes sur la propriété du PV isole avec différenciation génétique par RT-PCR et de la génomique séquençage 10, 11.
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Disclosures
Souji Masujima est un employé d'un nouveau produit de conception Département, Fujirebio Inc
Acknowledgments
Nous sommes reconnaissants à Junko Wada pour son excellente assistance technique. Nous sommes reconnaissants au Prof Akio Nomoto d'avoir bien voulu fournir un vecteur d'expression baculovirus pour le PVR-IgG2a. Cette étude a été financée en partie par des subventions en aide à la promotion de l'éradication de la poliomyélite et de la recherche sur les maladies émergentes et ré-émergentes Maladies infectieuses du ministère de la Santé, du Travail et des Affaires sociales.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sensitized-gelatin particles | Fujirebio Inc. | Test kit | |
| Reconstitution buffer | Fujirebio Inc. | Test kit | |
| Microtitration plate | Fujirebio Inc. | Test kit | |
| Anti-PV antibody | RIVM |
References
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- Arita, M., Masujima, S., Wakita, T., Shimizu, H. Development of a particle agglutination method with soluble virus receptor for identification of poliovirus. J. Clin. Microbiol. 48, 2698-2702 (2010).
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