Summary
En nyligen utvecklat nya partiklar agglutination (PA)-analysen använder molekyl virus receptorn får en snabb och enkel identifiering av poliovirus (PV). I denna artikel kommer vi att visa förfarandet för PA-analysen för PV identifiering.
Abstract
I det globala initiativet att utrota polio, spelar laboratoriediagnos en avgörande roll genom att isolera och identifiera PV från avföringsprov av akut slapp förlamning (AFP) fall. I Världshälsoorganisationen (WHO) Global Polio Laboratory Network, PV isolering och identifiering för närvarande genomförs med hjälp av systemet cellkultur och i realtid RT-PCR, respektive. I den post-utrotning era av PV skulle enkel och snabb identifiering förfaranden vara till hjälp för en snabb bekräftelse på poliofall på nationella laboratorier. I den aktuella studien visar vi förfarandet av nya PA-analysen utvecklats för PV identifiering. Detta PA-analysen utnyttjas samspelet mellan PV-receptorn (PVR) molekyl och virionens som är specifik och enhetlig affinitet till alla serotyper av PV. Proceduren är enkel (ett steg förfarande reaktion plattor) och snabb (resultat kan uppnås inom 2 tim reaktion), och resultatet är visuellt observerade (observation av agglutination av gelatin partiklar).
Protocol
1. Beredning av underhåll medium (MM) och tillväxt medium (GM)
För beredning av MM och GM, se en Polio laboratorium handbok som 1. Dulbecco ändrade Eagles medium (DMEM) kompletterad med 2% fetalt kalvserum (FCS) och 10% FCS kunde användas som substitut av MM och GM, respektive.
2. Beredning av anti-PV-antikroppar
- Lös anti-PV antikropp (RIVM PV skriva antiserum) genom att tillsätta vatten (0,5 ml per flaska) till varje flaska med anti-PV antikropp (typ 1, 2 eller 3). Lägg till detta färdigberedda antikropp lösningar (0,5 ml vardera) till 4,5 ml av MM i separata märkta rör.
Obs: Vissa massor av anti-PV antikroppar tillhandahålls som bereds formen (0,5 ml per flaska). För sådana massa anti-PV antikropp, är tillsats av vatten för rekonstituering inte nödvändigt. - Blanda lika stor volym av den beredda anti-PV antikropp. För anti-PV1 2, 3 2 eller 3 +1: Blanda 1,8 ml av varje rekonstituerad antikropp (1,8 ml + 1,8 ml = 3,6 ml för varje blandning). För anti-PV1 +2 +3: Blanda 1,2 ml av varje rekonstituerad antikropp (1,2 ml + 1,2 ml + 1,2 ml = 3,6 ml).
OBS: PV prov kan innehålla en blandning av olika serotyper av PV. Att identifiera enskilda serotyp PV i prover med blandning av PV är pooler av anti-PV-antikroppar (dvs 1 +2, 2 +3, 3 +1, 1 +2 +3) är nödvändigt. - Tillsätt 1 / 5-volym för FCS (0,72 ml) till varje anti-PV (1 +2, 2 +3, 3 +1 eller 1 +2 +3) antikroppar (3,6 ml vardera) (sista 18,2% FCS).
OBS: Tillägg av FCS är för minskning av icke-specifik agglutination av gelatin partikel som orsakas av antikroppar. - Håll antikroppen pooler vid -20 ° C tills den ska användas i PA-analysen.
3. Ombildning av sensibiliserade gelatin partikel
- Tillsätt 1,5 mL beredning buffert som ingår i satsen för att en flaska med sensibiliserade gelatin partikel (tillhandahålls som frystorkat pulver).
- Blanda väl genom att försiktigt packas
- Förvara den rekonstituerade sensibiliserade partikeln vid 4 ° C. Färdigberedd gelatin partikel skulle kunna vara aktiv i minst 2 veckor förvaras vid 4 ° C, men bör beredas strax före analysen.
Viktigt att notera:
Blanda inte olika mycket sensibiliserade gelatin partiklar, eftersom de icke-agglutination bild av sensibiliserade gelatin partiklar skulle kunna vara annorlunda med många av partiklar. För varje försök bör en hel del sensibiliserade gelatin partikel användas.
4. PA-analysen för PV identifiering
- Förbered en mikro-titrering plåt. För identifiering av ett virus prov, behöver vi 5 brunnar + minst en negativ kontroll (sensibiliserade partikel utan virus och antikroppar, väl # 6 i nedan. See No virus och antikroppar kontroll Exempel). Totalt antal brunnar är 5 x prover + minst en kontroll i analysen.
Viktigt att notera:
Ta minst en Inga virus och antikroppar kontroll i analysen. En injektionsflaska med sensibiliserade partikel är ungefär för identifiering av 10-virus prov. - Tillsätt 12 mikroliter / brunn av anti-PV antikropp eller GM till mikro-titrering plåt. Arrangemanget av plattan är som följer (se även exempel nedan). I prover utan antikroppar (brunn # 1 och 6), lägg till 12 mikroliter av GM istället för anti-PV antikropp.
Viktigt att notera:
Om många PV prover skall testas i denna analys skulle flerkanalspipett eller dispenser vara till hjälp för detta steg.Tja # 1 Tja # 2 Tja # 3 Tja # 4 Well # 5 Tja # 6 GM anti-P1 +2 +3 anti-P1 2 anti-P2 3 Ani-P1 3 GM - Tillsätt 12 mikroliter / brunn av virus prov. I ett prov utan virus (och # 6), lägg till 12 mikroliter av GM istället för virus lösning.
Notera: Virus provet supernatant av infekterade celler, vanligen L20B celler eller celler RD.
Viktigt att notera:
Om många PV prover skall testas i denna analys skulle flerkanalspipett vara till hjälp för detta steg.Tja # 1 Tja # 2 Tja # 3 Tja # 4 Well # 5 Tja # 6 virusexempel virusexempel virusexempel virusexempel virusexempel GM - Ta färdigberedda sensibiliserade partikel lösningen från 4 ° C till rumstemperatur och knacka försiktigt att helt avbryta partiklar.
Viktigt att notera:
Efter fullständig suspension av partiklar genom att försiktigt knacka bör partiklarna läggas direkt på plattorna innan suspenderade partiklar nedfallTe och bildar icke-homogen lösning. - Tillsätt 25 ml / brunn sensibiliserade partikel till alla brunnar.
Viktigt att notera:
Efter tillsats av sensibiliserade partikel, bör plattan omedelbart utsättas för plåt blandning för att starta en enhetlig reaktion av proverna. Därför bör tillägg av sensibiliserade partikel utföras med dispenser för att minimera en tidsförskjutning mellan proverna i plattan. - Sätt mikro-titrering tallrik på en tallrik mixer och blanda plattan i 30 sek.
- Sätt mikro-titrering platta på vitt papper (för att underlätta visuell observation) på ett bord vid rumstemperatur (15 ~ 30 ° C) i 2 h.
Viktigt att notera:
Flytta inte plattan under och efter reaktionen för observation av resultaten och ta foton. Den bildade agglutination är inte stabil och lätt störd av att flytta plattorna. - Ta foton av plattan.
Viktigt att notera:
Ofullständig bild av bilderna kunde inte ge tillräckligt med uppgifter för senare granskning och genomgång av resultaten för tolkning. Flera bilder ska tas för att täcka alla de brunnar av plattorna med fokus på agglutination bilden av brunnarna.
5. Tolkning av resultaten
- Identifikation av positiva och negativa brunnar. Jämför agglutination i proverna med det av Inga virus och antikroppar kontroll (utfällning av gelatin partiklar, icke-agglutination) (Figur 1 och 2). Bilder av agglutination som tydligt skiljer sig från No virus och inga antikroppar kontroll (icke-agglutination, negativ kontroll) bör bedömas som positiv, och bilder av agglutination som liknar den negativa kontrollen bör bedömas som negativa. Prover som visar tydliga men bara delvis agglutination kan bedömas som positivt, men spela in som "Positiv (partiell agglutination)".
- Identifiering av PV. Tolka resultaten baserat på positiva och negativa brunnar med anti-PV antikroppar för att identifiera PV serotyper. Principen om tolkningen av resultatet är liknande den för neutraliseringstest på cellodlingssystem (t.ex. positiv för anti-P1 två antikroppar indikerar att provet innehåller typ 3 PV).
6. Representativa resultat
Representativt resultat av PA-analysen PV identifiering visas i figur 1. Alla PV-stammar som bildas agglutination av sensibiliserade gelatin partiklar (Inga antikroppar prover). I närvaro av motsvarande anti-PV antikroppar, utfällning av gelatin partiklar (icke-agglutination) liknar Inga virus och inga antikroppar kontroll (negativ kontroll) observerades (t ex PV1 (Sabin) i närvaro av anti-P1 +2 eller anti-P3 1 antikroppar).
Figur 1. Identifiering av PV av PA-analysen. Virus lösningar av PV1 (Sabin), PV2 (Sabin) och PV3 (Sabin) (virus titer på 1,2 x 10 8 CCID 50 / 12 mikroliter, 8,2 x 10 7 CCID 50 / 12 mikroliter och 3,5 x 10 7 CCID 50 / 12 mikroliter, respektive) har använts för identifiering av PA-analysen. Inga virus och inga antikroppar kontroll visade utfällning av gelatin partiklar (icke-agglutination, negativ kontroll).
Figur 2. Tolkning av positiva och negativa brunnar. Virus-lösningar av PV1 (Sabin), PV2 (Sabin) och PV3 (Sabin) (virus titrar på 2,4 x 10 8 CCID 50 / 25 mikroliter, 1,7 x 10 8 CCID 50 / 25 mikroliter och 7,3 x 10 7 CCID 50 / 25 mikroliter, respektive) var utspädd 1 / 20 till 1 / 320, och sedan 25 mikroliter av spädda prover undersöktes av PA-analysen utan anti-PV antikroppar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den unika Poängen med denna PA-analysen är utnyttjandet av PVR molekyl i stället för att anti-PV antikroppar för detektion av PV-2. Detta möjliggör en viss interaktion mellan de sensibiliserade gelatin partiklar med PV med en enhetlig affinitet till alla tre serotyper av PV 3-6. Vi använde en immunoadhesin form av PVR (PVR-IgG2a) för sensibilisering av gelatin partiklar, eftersom monomera former av PVR har endast måttlig affinitet till den gemensamma bindningsställe på virionens (dissociationskonstanten av 10 -7 ~ -8 Mkr) 7, 8, och framgångsrikt observerade specifika agglutination av de sensibiliserade gelatin partiklar med PV isolat. Med hög specificitet och enhetlig affinitet av sensibiliserade partiklar, de kritiska faktorerna för PV identifiering i PA-analysen är 1) virus titer (för giltiga upptäckt av PV av PA-analys) och 2) tolkning av agglutination (för korrekt identifiering av PV) .
Generellt isolerar virus titer av PV i cellodling är i en rad 06 till 8 oktober CCID 50 / 50 mikroliter. De detektionsgränser PA analys (som bildar kompletta agglutination) för typ 1, 2 och 3 PV var 1.5x10 6 CCID 50, 5.3x10 5 CCID 50 och 9.1x10 5 CCID 50 respektive 2. PA-analysen korrekt identifierade flesta PV isolerar även i närvaro av andra icke-PV enteroviruses. Men för vissa prover innehöll en blandning av olika serotyper av PV, inte mindre serotyp att upptäcka. Tydliga agglutination ska bildas tillräckligt med virus titer över detektionsgränser. Om det agglutination i Inga antikroppar prov var oklart eller delvis, bör isolaten åter förstärkas i RD celler för att öka titer 9.
Partiell agglutination observerades när viruset titer var låg och precis under detektionsgränser. Klar skillnad på agglutination från negativa kontrollen kan bedömas som positiv i PA-analysen. Men ganska subtil skillnad i agglutination bedöms som positivt kan vilseleda tolkningen av resultaten. Därför bör resultaten av positiva (partiell agglutination) användas som stödjande information för eventuellt orsakas av mindre serotyper av isolaten. Men skulle denna information vara till hjälp vid följande analys (genomisk sekvensering av PV-isolat eller realtids-RT-PCR) föreslog en möjlighet att provet innehöll en blandning av olika serotyper av PV, eller endast delvis agglutination observerades för Inga antikroppar urval där den låga virus titer skulle vara den största orsaken till det oklara resultat.
Fördelen med PA-analysen för PV identifiering är enkelheten i förfarandet och resultatet tolkning. Detta skulle möjliggöra ett enkelt införande av analysen till alla laboratorier som utför PV isolering med cellodling systemet, utan att ge särskild utrustning, material och utbildningar. Utnyttjande av typspecifika monoklonala antikroppar kan tillåta utveckling av nya metoder för differentiering av PV (vildtyp eller vaccin-liknande stammar) som skulle ge viktig information om egendom PV isolerar tillsammans med genetisk differentiering med RT-PCR och genomisk sekvensering 10, 11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Souji Masujima är anställd av nya produkter designavdelning, Fujirebio Inc.
Acknowledgments
Vi är tacksamma för att Junko Wada för hennes utmärkta tekniskt bistånd. Vi är tacksamma för Prof. Akio Nomoto för snällt att ge en vektor baculovirus uttryck för PVR-IgG2a. Denna studie har delvis stöd i Grants-i-Stöd för främjande av att utrota polio och forskning om nya och återkommande infektionssjukdomar från ministeriet för hälsa, arbete och välfärd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sensitized-gelatin particles | Fujirebio Inc. | Test kit | |
| Reconstitution buffer | Fujirebio Inc. | Test kit | |
| Microtitration plate | Fujirebio Inc. | Test kit | |
| Anti-PV antibody | RIVM |
References
- World Health Organization. Polio Laboratory Manual (4th edition) WHO/IVB/04.10. , 4th Edition, World Health Organization. (2004).
- Arita, M., Masujima, S., Wakita, T., Shimizu, H. Development of a particle agglutination method with soluble virus receptor for identification of poliovirus. J. Clin. Microbiol. 48, 2698-2702 (2010).
- Bibb, J. A., Witherell, G., Bernhardt, G., Wimmer, E. Interaction of poliovirus with its cell surface binding site. Virology. 201, 107-115 (1994).
- Koike, S. The poliovirus receptor protein is produced both as membrane-bound and secreted forms. Embo J. 9. , 3217-3224 (1990).
- Mendelsohn, C. Transformation of a human poliovirus receptor gene into mouse cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 83, 7845-7849 (1986).
- Mendelsohn, C. L., Wimmer, E., Racaniello, V. R. Cellular receptor for poliovirus: molecular cloning, nucleotide sequence, and expression of a new member of the immunoglobulin superfamily. Cell. 56, 855-865 (1989).
- Arita, M., Koike, S., Aoki, J., Horie, H., Nomoto, A. Interaction of poliovirus with its purified receptor and conformational alteration in the virion. J. Virol. 72, 3578-3586 (1998).
- McDermott, B. M., Rux, A. H., Eisenberg, R. J., Cohen, G. H., Racaniello, V. R. Two distinct binding affinities of poliovirus for its cellular receptor. J. Biol. Chem. 275, 23089-23096 (2000).
- Pipkin, P. A., Wood, D. J., Racaniello, V. R., Minor, P. D. Characterisation of L cells expressing the human poliovirus receptor for the specific detection of polioviruses in vitro. J. Virol. Methods. 41, 333-340 (1993).
- Avoort, H. G. vander Comparative study of five methods for intratypic differentiation of polioviruses. J. Clin. Microbiol. 33, 2562-2566 (1995).
- Kilpatrick, D. R. Rapid group-, serotype-, and vaccine strain-specific identification of poliovirus isolates by real-time reverse transcription-PCR using degenerate primers and probes containing deoxyinosine residues. J. Clin. Microbiol. 47, 1939-1941 (2009).
