Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Immunology and Infection

الجسيمات أسلوب التلصيق لتحديد فيروس شلل الأطفال

doi: 10.3791/2824 Published: April 20, 2011

Summary

يسمح للجسيمات الرواية وضعت مؤخرا تراص (السلطة الفلسطينية) مقايسة باستخدام جزيء الفيروس إلى تحديد مستقبلات سريعة وسهلة لفيروس شلل الأطفال (PV). في هذه المقالة ، سوف نعرض لإجراء فحص للسلطة الفلسطينية لتحديد الكهروضوئية.

Abstract

في المبادرة العالمية لاستئصال شلل الأطفال ، ومختبر التشخيص يلعب دورا حاسما من خلال عزل وتحديد الكهروضوئية من عينات البراز من الشلل الرخو الحاد (اف ب) الحالات. في منظمة الصحة العالمية (WHO) في الوقت الحاضر شبكة مختبرات شلل الأطفال ، والعزلة ، وتحديد الكهروضوئية التي يتم تنفيذها باستخدام خلية نظام الثقافة في الوقت الحقيقي وRT PCR ، على التوالي. في حقبة ما بعد القضاء على الكهروضوئية ، وتحديد إجراءات بسيطة وسريعة تكون مفيدة للتأكيد السريع لحالات شلل الأطفال في المختبرات الوطنية. في هذه الدراسة ، وسوف نعرض لإجراءات فحص رواية السلطة الفلسطينية وضعت لتحديد الكهروضوئية. ويستخدم هذا الاختبار للسلطة الفلسطينية من التفاعل جزيء الكهروضوئية (PVR) ومستقبلات الفيريون التي تقارب محددة وموحدة لجميع الأنماط المصلية الكهروضوئية. الإجراء بسيط (واحد من إجراء الخطوة رد فعل في لوحات) و (يمكن الحصول على نتائج في غضون 2 ساعة من رد الفعل) السريع ، ويلاحظ البصر نتيجة (مراقبة تراص جزيئات الجيلاتين).

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. إعداد المتوسطة الصيانة (MM) والنمو المتوسط ​​(GM)

MM لإعداد وجنرال موتورز ، الرجاء راجع دليل مختبرات شلل الأطفال في منظمة الصحة العالمية 1. Dulbecco المتوسطة لتعديل النسر (DMEM) تستكمل مع 2 ٪ مصل العجل الجنين (FCS) و 10 ٪ يمكن استخدامها كبدائل للFCS MM وجنرال موتورز ، على التوالي.

2. إعداد المضادة للأضداد PV

  1. إعادة المضادة للأجسام المضادة الكهروضوئية (الكهروضوئية RIVM كتابة ضدي) عن طريق إضافة المياه (0.5 مل في القارورة) إلى كل قارورة المضادة للأجسام المضادة الكهروضوئية (نوع 1 أو 2 أو 3). إضافة هذه الحلول تشكيل الأضداد (0.5 مل لكل منهما) إلى 4.5 مل من MM في أنابيب منفصلة المسمى.
    ملاحظة : يتم توفير بعض الكثير من الأجسام المضادة للPV كشكل المعاد (0.5 مل في القارورة). الكثير من هذا القبيل لمكافحة PV الأضداد ، بالإضافة إلى إعادة المياه ليست ضرورية.
  2. مزيج متساو من حجم الأجسام المضادة لمكافحة PV المعاد. لمكافحة PV1 +2 ، 2 +3 ، أو 3 +1 : مزيج 1.8 مل من كل الأجسام المضادة المعاد (1.8 مل + 1.8 مل = 3.6 مل لكل الخليط). لمكافحة PV1 +2 +3 : مزيج 1.2 مل من كل الأجسام المضادة المعاد (1.2 مل + 1.2 مل + 1.2 = 3.6 مل مل).
    ملاحظة : يمكن أن تحتوي على عينات PV خليط من الأنماط المصلية مختلفة من الكهروضوئية. لتحديد النمط المصلي واحدة من الكهروضوئية في العينات مع مزيج من المحاضر الحرفية ، وحمامات المضادة للأضداد الكهروضوئية (أي 1 +2 ، 2 +3 ، 3 +1 ، 1 +2 +3) أمر ضروري.
  3. إضافة 05/01 حجم FCS (0.72 مل) لكل PV - المضادة (1 +2 ، 2 +3 ، 3 +1 ، أو 1 +2 +3) الأضداد (3.6 مل لكل منهما) (FCS النهائية 18.2 ٪).
    ملاحظة : إضافة FCS هو من أجل الحد من تراص غير محدد من الجسيمات الجيلاتين التي تسببها الأجسام المضادة.
  4. الحفاظ على الضد في برك -20 درجة مئوية حتى استخدامها في فحص للسلطة الفلسطينية.

3. إعادة تشكيل الجسيمات الجيلاتين توعيتهم

  1. إضافة 1.5 مل من العازلة إعادة إدراجها في مجموعة واحدة من الجسيمات فيال الجيلاتين توعية (على النحو المنصوص عليه مسحوق تجميد المجفف).
  2. مزيج جيد من خلال استغلال طيف
  3. الحفاظ على الجسيمات المعاد توعية في 4 درجات مئوية. ويمكن تشكيل الجسيمات الجيلاتين تكون نشطة على الأقل 2 أسابيع يحتفظ بها في 4 درجات مئوية ، ولكن ينبغي أن نكون مستعدين تماما قبل الفحص.

ملاحظة هامة :
لا تخلط الكثير من جسيمات مختلفة الجيلاتين توعيتهم ، لأن الصورة غير تراص جزيئات الجيلاتين توعيتهم يمكن أن تكون مختلفة عن الكثير من الجسيمات. لكل تجربة ، يجب استخدام الكثير واحد من الجسيمات الجيلاتين توعيتهم.

4. السلطة الفلسطينية مقايسة لتحديد PV

  1. إعداد لوحة المعايرة الدقيقة. لتحديد عينة الفيروس واحد ، نحن بحاجة إلى 5 آبار + واحد على الأقل السيطرة السلبية (الجسيمات دون وعي الفيروسات والأجسام المضادة ، كذلك # 6 في الأسفل ، وانظر أي السيطرة على الفيروس والأجسام المضادة في المثال). إجمالي عدد الآبار 5 × عينات + واحد على الأقل التحكم في مقايسة.
    ملاحظة هامة :
    يرجى اتخاذ واحد على الأقل لا تحكم الفيروسات والأجسام المضادة في مقايسة. قنينة واحدة من الجسيمات توعية تقريبا لتحديد عينات الفيروس 10.
  2. إضافة 12 ميكرولتر / جيد المضادة للأجسام المضادة أو المعدلة وراثيا PV إلى لوحة المعايرة الدقيقة. الترتيب للوحة هو كما يلي (انظر أيضا مثال أدناه). في عينات من دون الضد (وأيضا # 1 و 6) ، وإضافة 12 ميكرولتر من جنرال موتورز بدلا من الأضداد المضادة للالكهروضوئية.
    ملاحظة هامة :
    إذا كان ينبغي اختبار العديد من عينات الكهروضوئية في هذا الاختبار ، فإن ماصة الأقنية أو الموزع يكون من المفيد لهذه الخطوة.
    كذلك # 1 كذلك # 2 كذلك # 3 كذلك # 4 كذلك # 5 كذلك # 6
    جنرال موتورز مكافحة P1 +2 +3 مكافحة P1 +2 مكافحة - P2 +3 العاني - P1 +3 جنرال موتورز
  3. إضافة 12 ميكرولتر / بئر عينة الفيروس. في عينة واحدة من دون فيروس (جيد # 6) ، وإضافة 12 ميكرولتر من جنرال موتورز بدلا من حل الفيروس.
    ملاحظة : عينة الفيروس هو طاف ثقافة الخلايا المصابة والخلايا أو الخلايا عادة L20B RD.
    ملاحظة هامة :
    إذا كان ينبغي اختبار العديد من عينات الكهروضوئية في هذا الاختبار ، سيكون من المفيد ماصة الأقنية لهذه الخطوة.
    كذلك # 1 كذلك # 2 كذلك # 3 كذلك # 4 كذلك # 5 كذلك # 6
    عينة الفيروس عينة الفيروس عينة الفيروس عينة الفيروس عينة الفيروس جنرال موتورز
  4. تأخذ المعاد حل الجسيمات بحساسية من 4 درجات مئوية إلى درجة حرارة الغرفة ، والاستفادة تماما برفق لتعليق الجسيمات.
    ملاحظة هامة :
    بعد الوقف الكامل للجسيمات من خلال استغلال طيف ، ينبغي أن تضاف الجزيئات على الفور إلى لوحات قبل precipita والجسيمات العالقةالشركة المصرية للاتصالات وشكل غير متجانسة الحل.
  5. إضافة 25 ميكرولتر / جيدا الجسيمات توعية جميع الآبار.
    ملاحظة هامة :
    بعد إضافة الجسيمات توعيتهم ، ينبغي على الفور لوحة يتعرضون لوحة مزج لبدء رد فعل موحد للعينات. لذا ، ينبغي أن يؤديها إضافة الجسيمات توعيتهم باستخدام موزع لتصغير الفجوة الزمنية بين العينات في اللوحة.
  6. وضع لوحة المعايرة الدقيقة على خلاط واخلطه لوحة لوحة لمدة 30 ثانية.
  7. وضع لوحة المعايرة الدقيقة على ورق أبيض (للراحة الملاحظة البصرية) على طاولة في درجة حرارة الغرفة (15 ~ 30 درجة مئوية) لمدة 2 ساعة.
    ملاحظة هامة :
    لا تتحرك لوحة أثناء وبعد رد الفعل لرصد النتائج وأخذ الصور. وشكلت تراص غير مستقر ومضطربا بسهولة عن طريق نقل الصفائح.
  8. التقاط صور من لوحة.
    ملاحظة هامة :
    ويمكن رؤية جزئية من الصور لا تعطي معلومات كافية لفحص في وقت لاحق ، وإعادة النظر في نتائج للترجمة الشفوية. وينبغي اتخاذ عدة صور لتغطية جميع الآبار لوحات تركز على الصورة تراص من الآبار.

5. تفسير النتائج

  1. تحديد الآبار الإيجابية والسلبية. مقارنة تراص في العينات مع عدم وجود مراقبة الفيروس والأجسام المضادة (ترسب جزيئات الجيلاتين ، وعدم تراص) (الشكل 1 و 2). يجب أن يحكم من تراص الصور التي يتم تمييزها بوضوح من أي فيروس وليس السيطرة الأضداد (غير تراص ، ومراقبة سلبية) بأنها إيجابية ، ويجب أن يحكم من تراص الصور التي تشبه إلى سيطرة السلبية والسلبية. ويمكن الحكم على العينات التي تظهر تراص واضحة ولكن جزئيا فقط بأنها إيجابية ، ولكن السجل ك "الإيجابية (تراص جزئي).
  2. تحديد الكهروضوئية. تفسير النتائج اعتمادا على الآبار الإيجابية والسلبية المضادة للأضداد الكهروضوئية لتحديد الأنماط المصلية الكهروضوئية. مبدأ تفسير النتيجة هي مماثلة لتلك التي في تحييد نظام اختبار ثقافة خلية (على سبيل المثال إيجابية لمكافحة الأجسام المضادة +2 P1 يشير إلى أن العينة تحتوي على نوع 3 PV).

6. ممثل النتائج

ويظهر نتيجة ممثل السلطة الفلسطينية تحديد مقايسة الكهروضوئية في الشكل 1. جميع سلالات PV شكلت تراص جزيئات الجيلاتين توعيتهم (أي عينات الأضداد). في وجود أضداد PV المقابلة ، وترسب جزيئات الجيلاتين (غير تراص) مماثلة لفيروس لا توجد رقابة والأضداد (مراقبة سلبية) وحظ (على سبيل المثال ، PV1 (سابين) في حضور P1 مكافحة +2 أو P3 المضادة للأضداد +1).

الشكل 1
الشكل 1. حلول التعرف على الفيروسات التي PV مقايسة السلطة الفلسطينية. PV1 من (سابين) ، PV2 (سابين) ، وPV3 (سابين) (التتر الفيروس من 1.2 X CCID 8 10 50 / 12 ميكرولتر ، 8.2 × 10 7 CCID 50/12 ميكرولتر ، و واستخدمت 3.5 × 10 7 CCID 50/12 ميكرولتر ، على التوالي) لتحديد الهوية من جانب السلطة الفلسطينية مقايسة. لم يظهر أي فيروس وليس السيطرة الأضداد ترسب جزيئات الجيلاتين (غير تراص ، ومراقبة سلبية).

الشكل 2
الشكل 2. تفسير الآبار الإيجابية والسلبية. حلول الفيروسات من PV1 (سابين) ، PV2 (سابين) ، وPV3 (سابين) (التتر الفيروس من 2.4 × 10 8 ميكرولتر 50/25 CCID ، 1.7 × 10 8 CCID ميكرولتر 50/25 ، و وكانت مخففة 7.3 × 10 7 CCID 50/25 ميكرولتر ، على التوالي) 1 / 20-320 / 1 ، ومن ثم تم فحص عينات من 25 ميكرولتر المخففة التي مقايسة السلطة الفلسطينية من دون المضادة للPV الأضداد.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

في نقطة وحيدة من هذا الاختبار هو السلطة الفلسطينية الاستفادة من جزيء PVR بدلا من مكافحة PV الأضداد للكشف عن الكهروضوئية 2. هذا يسمح للتفاعل معينة من الجسيمات الجيلاتين مع توعية الكهروضوئية مع تقارب موحد لجميع الأنماط المصلية الثلاثة 3-6 الكهروضوئية. استخدمنا نموذج immunoadhesin من PVR (PVR - IgG2a) للتوعية جزيئات الجيلاتين ، وذلك لأن من أشكال موحودي PVR والانتماءات فقط معتدلة إلى موقع واحد ملزم على الفيريون (التفكك المستمر لل10 -7 -8 ~ M) 7 8 ، ولاحظ بنجاح تراص محددة من جزيئات الجيلاتين توعية مع العزلات الكهروضوئية. مع خصوصية عالية وموحدة للتقارب الجزيئات توعيتهم ، والعوامل الحاسمة لتحديد هوية الكهروضوئية في مقايسة السلطة الفلسطينية هي 1) فيروس عيار (للكشف صالح الكهروضوئية التي مقايسة السلطة الفلسطينية) و 2) تفسير تراص (على سبيل التحديد الصحيح للPV) .

عموما ، عيار فيروس PV يعزل في خلية نظام الثقافة في مجموعة من CCID 6-8 أكتوبر 50 / 50 ميكرولتر. وكانت حدود الكشف عن مقايسة السلطة الفلسطينية (تشكيل تراص كاملة) لنوع 1 ، 2 ، 3 و PV 1.5x10 6 CCID 50 ، 5.3x10 5 CCID 50 ، و 9.1x10 5 CCID 50 ، على التوالي 2. على السلطة الفلسطينية التي تم تحديدها بشكل صحيح مقايسة معظم PV يعزل حتى في وجود الفيروس المعوي غير PV الأخرى. فشل التعديلات المصلي لكن ، بالنسبة لبعض العينات تحتوي على خليط من الأنماط المصلية مختلفة من الكهروضوئية ، ليتم الكشف. وينبغي تشكيل تراص واضح مع ما يكفي من عيار الفيروس فوق حدود الاكتشاف. في حالة تراص في أي عينة الأضداد لم يكن واضحا أو جزئية ، ينبغي أن يعزل إعادة تتضخم في الخلايا RD لزيادة عيار 9.

ولوحظ تراص جزئية عندما عيار الفيروس منخفضة وأقل بقليل من حدود الاكتشاف. ويمكن الحكم على اختلاف واضح في تراص من السيطرة السلبية كما الايجابية في تجربة السلطة الفلسطينية. ومع ذلك ، فرق دقيق جدا من تراص يحكم بأنها إيجابية يمكن تضليل تفسير النتائج. ولذلك ، ينبغي استخدام نتائج الإيجابية (تراص الجزئي) على معلومات داعمة لربما نجم عن الأنماط المصلية طفيفة من العزلات. ومع ذلك ، فإن هذه المعلومات قد تكون مفيدة عند التحليل التالي (التسلسل الجيني لعزلات PV أو في الوقت الحقيقي RT PCR) واقترح إمكانية أن العينة تحتوي على خليط من الأنماط المصلية مختلفة من الكهروضوئية ، أو لوحظ تراص جزئية فقط لعينة لا أضداد حيث فإن عيار الفيروس منخفضة يكون سببا رئيسيا للنتائج غير واضحة.

الاستفادة من تجربة السلطة الفلسطينية لتحديد PV هو في بساطة تفسير الداخلي والنتيجة. هذا من شأنه أن يسمح بإدخال سهلة للمقايسة على كل المختبرات إجراء PV العزلة مع خلية نظام الثقافة ، ودون توفير معدات خاصة ، والمواد ، والتدريب. ربما استخدام نوع محدد الاجسام المضادة يسمح بتطوير طريقة جديدة للتمايز المحاضر الحرفية (نوع البرية او لقاح مثل سلالات) من شأنه أن يوفر معلومات هامة للممتلكات PV يعزل مع تمايز الوراثية RT - PCR والجينومية التسلسل 10 و 11.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Souji Masujima هو موظف من المنتجات الجديدة قسم التصميم ، شركة Fujirebio

Acknowledgments

ونحن ممتنون لادا جونكو لمساعدتها التقنية الممتازة. ونحن ممتنون للبروفيسور أكيو Nomoto لتوفير تتكرم متجه التعبير عن الفيروسة العصوية PVR - IgG2a. وأيد هذه الدراسة في جزء من المنح التي تقدم للمساعدة في الترويج للقضاء على شلل الأطفال وبحوث الناشئة والمستجدة من الأمراض المعدية في وزارة الصحة والعمل والرعاية الاجتماعية.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sensitized-gelatin particles Fujirebio Inc. Test kit
Reconstitution buffer Fujirebio Inc. Test kit
Microtitration plate Fujirebio Inc. Test kit
Anti-PV antibody RIVM

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. World Health Organization. Polio Laboratory Manual (4th edition) WHO/IVB/04.10. 4th Edition, World Health Organization. (2004).
  2. Arita, M., Masujima, S., Wakita, T., Shimizu, H. Development of a particle agglutination method with soluble virus receptor for identification of poliovirus. J. Clin. Microbiol. 48, 2698-2702 (2010).
  3. Bibb, J. A., Witherell, G., Bernhardt, G., Wimmer, E. Interaction of poliovirus with its cell surface binding site. Virology. 201, 107-115 (1994).
  4. Koike, S. The poliovirus receptor protein is produced both as membrane-bound and secreted forms. Embo J. 9. 3217-3224 (1990).
  5. Mendelsohn, C. Transformation of a human poliovirus receptor gene into mouse cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 83, 7845-7849 (1986).
  6. Mendelsohn, C. L., Wimmer, E., Racaniello, V. R. Cellular receptor for poliovirus: molecular cloning, nucleotide sequence, and expression of a new member of the immunoglobulin superfamily. Cell. 56, 855-865 (1989).
  7. Arita, M., Koike, S., Aoki, J., Horie, H., Nomoto, A. Interaction of poliovirus with its purified receptor and conformational alteration in the virion. J. Virol. 72, 3578-3586 (1998).
  8. McDermott, B. M., Rux, A. H., Eisenberg, R. J., Cohen, G. H., Racaniello, V. R. Two distinct binding affinities of poliovirus for its cellular receptor. J. Biol. Chem. 275, 23089-23096 (2000).
  9. Pipkin, P. A., Wood, D. J., Racaniello, V. R., Minor, P. D. Characterisation of L cells expressing the human poliovirus receptor for the specific detection of polioviruses in vitro. J. Virol. Methods. 41, 333-340 (1993).
  10. Avoort, H. G. vander Comparative study of five methods for intratypic differentiation of polioviruses. J. Clin. Microbiol. 33, 2562-2566 (1995).
  11. Kilpatrick, D. R. Rapid group-, serotype-, and vaccine strain-specific identification of poliovirus isolates by real-time reverse transcription-PCR using degenerate primers and probes containing deoxyinosine residues. J. Clin. Microbiol. 47, 1939-1941 (2009).
الجسيمات أسلوب التلصيق لتحديد فيروس شلل الأطفال
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Arita, M., Masujima, S., Wakita, T., Shimizu, H. Particle Agglutination Method for Poliovirus Identification. J. Vis. Exp. (50), e2824, doi:10.3791/2824 (2011).More

Arita, M., Masujima, S., Wakita, T., Shimizu, H. Particle Agglutination Method for Poliovirus Identification. J. Vis. Exp. (50), e2824, doi:10.3791/2824 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter