Summary
Een recent ontwikkelde nieuwe deeltje agglutinatie (PA) test gebruik te maken van virus-receptor molecuul toegestaan een snelle en eenvoudige identificatie van poliovirus (PV). In dit artikel zullen we de procedure show voor de PA-test voor PV-identificatie.
Abstract
In het Global Polio Eradication Initiative, laboratoriumdiagnose speelt een cruciale rol door het isoleren en het identificeren van PV uit de ontlasting monsters van acute slappe verlamming (AFP) gevallen. In de World Health Organization (WHO) Global Polio Laboratory Network, PV isolatie en identificatie worden momenteel uitgevoerd met behulp van celkweek systeem en real-time RT-PCR, respectievelijk. In het post-uitroeiing tijdperk van de PV, zou een eenvoudige en snelle identificatie procedures nuttig zijn voor een snelle bevestiging van polio gevallen bij de nationale laboratoria. In de huidige studie, zullen we laten zien van de procedure van nieuwe PA-assay ontwikkeld voor PV-identificatie. Deze test maakt gebruik van PA interactie van PV-receptor (PVR) molecuul en virion die specifiek is en uniforme affiniteit met alle serotypes van het PV. De procedure is eenvoudig (een stap procedure in reactie platen) en snelle (resultaten kunnen worden verkregen binnen 2 uur van de reactie), en het resultaat is visueel waargenomen (waarneming van de agglutinatie van gelatine deeltjes).
Protocol
1. De voorbereiding van onderhoud medium (MM) en groeimedium (GM)
Voor de voorbereiding van MM en GM, zie een Polio laboratorium handleiding van de WHO een. Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM) aangevuld met 2% foetaal kalf serum (FCS) en 10% FCS kan worden gebruikt als vervangers van MM en GM respectievelijk.
2. Voorbereiding van de anti-PV-antilichamen
- Reconstitueer anti-PV-antilichaam (RIVM PV typen antiserum) door toevoeging van water (0,5 ml per flesje) aan elk flesje van anti-PV-antilichaam (type 1, 2 of 3). Voeg deze gereconstitueerde antilichaam-oplossingen (0,5 ml per stuk) tot 4,5 ml van de MM in aparte label buizen.
Opmerking: Sommige tal van anti-PV-antilichaam worden geleverd als gereconstitueerd vorm (0,5 ml per flacon). Voor zulke veel anti-PV-antilichaam, toevoeging van water voor de reconstitutie is niet nodig. - Meng gelijke volume van de gereconstitueerde anti-PV-antilichaam. Voor de anti-PV1 +2, 2 +3 of 3 +1: Mix 1,8 ml van elk gereconstitueerd antilichaam (1,8 ml + 1,8 ml = 3,6 ml voor elk mengsel). Voor de anti-PV1 +2 +3: Mix 1,2 ml van elk gereconstitueerd antilichaam (1,2 ml + 1,2 ml + 1,2 ml = 3,6 ml).
Let op: PV monsters kan een mengsel van verschillende serotypen van PV bevatten. Om een serotype van PV te identificeren in monsters met een mengsel van PV's, zwembaden van anti-PV-antilichamen (dat wil zeggen 1 +2, 2 +3, 3 +1, 1 +2 +3) nodig is. - Voeg 1 / 5 volume van de FCS (0,72 ml) voor elke anti-PV (1 +2, 2 +3, 3 +1 of 1 +2 +3) antilichaam (3,6 ml per stuk) (laatste 18,2% FCS).
Let op: Toevoeging van FCS is voor de reductie van niet-specifieke agglutinatie van gelatine deeltjes wordt veroorzaakt door antilichamen. - Houd het antilichaam zwembaden bij -20 ° C tot gebruik in de PA-test.
3. Reconstitutie van de gesensibiliseerde gelatine deeltjes
- Voeg 1,5 mL van reconstitutie buffer opgenomen in de kit om een flacon van de gesensibiliseerde gelatine deeltjes (geleverd als gevriesdroogd poeder).
- Meng alles goed door zachtjes te tikken
- Houd de gereconstitueerde gevoelig deeltje bij 4 ° C. Gereconstitueerde gelatine deeltjes kunnen actief zijn minstens 2 weken bewaard bij 4 ° C, maar moet worden voorbereid vlak voor de test.
Belangrijke opmerking:
Meng geen ander lot van de gesensibiliseerde gelatine deeltjes, omdat de niet-agglutinatie imago van de gesensibiliseerde gelatine deeltjes kunnen verschillend zijn door het lot van de deeltjes. Voor elk experiment moet een enkele partij van de gesensibiliseerde gelatine deeltjes worden gebruikt.
4. PA test voor PV-identificatie
- Bereid een micro-titratie plaat. Voor de identificatie van een virus monster, moeten we vijf waterputten + ten minste een negatieve controle (gesensibiliseerde deeltjes zonder virus en antilichamen, goed # 6 in hieronder. See No-virus en antilichamen controle in voorbeeld). Totaal aantal putten is 5 x monsters + ten minste een controle in de test.
Belangrijke opmerking:
Neem ten minste een No-virus en antilichamen controle in de test. Een flacon van de gesensibiliseerde deeltje is ongeveer voor de identificatie van 10 virusmonsters. - Voeg 12 ul / putje van de anti-PV-antilichaam of GM om de micro-titratie plaat. De plaatsing van de plaat is als volgt (zie ook voorbeeld hieronder). In monsters zonder antilichaam (zowel # 1 en 6), voeg 12 ul van GM in plaats van anti-PV-antilichaam.
Belangrijke opmerking:
Als er veel PV-monsters moeten worden getest in deze test, zou multichannel pipet of dispenser nuttig zijn voor deze stap.Goed # 1 Goed # 2 Goed # 3 Goed # 4 Goed # 5 Goed # 6 GM anti-P1 +2 +3 anti-P1 +2 anti-P2 +3 ani-P1 +3 GM - Voeg 12 ul / putje van het virus monster. In een monster zonder virus (ook # 6), voeg 12 ul van GM in plaats van het virus oplossing.
Let op: Virus monster is kweeksupernatant van geïnfecteerde cellen, meestal L20B cellen of RD-cellen.
Belangrijke opmerking:
Als er veel PV-monsters moeten worden getest in deze test, zou meerkanaalspipet nuttig zijn voor deze stap.Goed # 1 Goed # 2 Goed # 3 Goed # 4 Goed # 5 Goed # 6 virus monster virus monster virus monster virus monster virus monster GM - Neem gereconstitueerde gesensibiliseerde deeltjes oplossing van 4 ° C tot kamertemperatuur, en tik om volledig te schorsen van de deeltjes.
Belangrijke opmerking:
Na volledige schorsing van de deeltjes door zachtjes te tikken, moet de deeltjes onmiddellijk toegevoegd worden aan de platen voor de zwevende deeltjes neerslagte vormen en niet-homogene oplossing. - Voeg 25 ul / putje van de gesensibiliseerde deeltjes om alle putten.
Belangrijke opmerking:
Na toevoeging van de gesensibiliseerde deeltjes, moet de plaat onmiddellijk worden onderworpen aan bord mengen om een uniforme reactie van de monsters te beginnen. Daarom moet toevoeging van de gesensibiliseerde deeltjes worden uitgevoerd door gebruik te maken dispenser met een tijdsverschil tussen de monsters in de plaat te minimaliseren. - Doe de micro-titratie plaat op een bord mixer en meng de plaat gedurende 30 sec.
- Doe de micro-titratie plaat op wit papier (voor het gemak van de visuele waarneming) op een tafel bij kamertemperatuur (15 ~ 30 ° C) gedurende 2 uur
Belangrijke opmerking:
Beweeg niet de plaat tijdens en na de reactie voor het observeren van de resultaten en het nemen van foto's. De gevormde agglutinatie is niet stabiel en makkelijk verstoord door het bewegen van de platen. - Maak foto's van de plaat.
Belangrijke opmerking:
Gedeeltelijke weergave van de foto's niet konden geven voldoende gegevens voor later onderzoek en evaluatie van de resultaten voor interpretatie. Meerdere foto's moeten worden genomen om alle putjes van de platen zich richt op de agglutinatie beeld van de putten te dekken.
5. Interpretatie van de resultaten
- Identificatie van positieve en negatieve putten. Vergelijk de agglutinatie in de monsters met die van No virus en antilichamen controle (neerslag van gelatine deeltjes, niet-agglutinatie) (figuur 1 en 2). Beelden van agglutinatie die duidelijk onderscheiden van No virus en geen antilichamen controle (niet-agglutinatie, negatieve controle) moet worden beoordeeld als positief, en de beelden van agglutinatie die vergelijkbaar zijn met de negatieve controle moet worden beoordeeld als negatief. Monsters die duidelijk, maar slechts gedeeltelijke agglutinatie vertonen kan worden beoordeeld als positief, maar opnemen als 'Positive (gedeeltelijke agglutinatie)'.
- Identificatie van de PV. Interpreteer de resultaten op basis van positieve en negatieve putten met anti-PV-antilichamen tegen PV-serotypen te identificeren. Principe van de interpretatie van het resultaat is vergelijkbaar met die van de neutralisatie test in celkweek systeem (bijvoorbeeld positief voor anti-P1 +2 antilichaam geeft aan dat het monster type 3 PV bevat).
6. Representatieve resultaten
Representatief resultaat van PA-test PV identificatie is weergegeven in figuur 1. Alle PV-stammen gevormd agglutinatie van de gesensibiliseerde gelatine deeltjes (geen antilichamen monsters). In aanwezigheid van overeenkomstige anti-PV-antilichamen, neerslag van gelatine deeltjes (niet-agglutinatie), vergelijkbaar met No virus en geen antistoffen controle (negatieve controle) werd waargenomen (bijv., PV1 (Sabin) in de aanwezigheid van anti-P1 +2 of anti-P3 +1 antilichamen).
Figuur 1. Identificatie van de PV door de PA-test. Virus oplossingen van PV1 (Sabin), PV2 (Sabin), en PV3 (Sabin) (virus titers van 1,2 x 10 8 CCID 50/12 uL, 8,2 x 10 7 CCID 50/12 uL, en 3,5 x 10 7 CCID 50/12 uL, respectievelijk) werden gebruikt voor de identificatie door PA-test. Geen virus en geen antistoffen controle toonde aan neerslag van gelatine deeltjes (niet-agglutinatie, negatieve controle).
Figuur 2. Interpretatie van de positieve en negatieve putten. Virus oplossingen van PV1 (Sabin), PV2 (Sabin), en PV3 (Sabin) (virus titers van 2,4 x 10 8 CCID 50/25 uL, 1,7 x 10 8 CCID 50/25 uL, en 7,3 x 10 7 CCID 50/25 uL, respectievelijk) werden verdund 1 / 20 tot 1 / 320, en daarna 25 il van verdunde monsters werden onderzocht door PA-test zonder anti-PV-antilichamen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het unieke punt van deze PA test is het gebruik van de PVR molecuul in plaats van anti-PV-antilichamen voor de detectie van PV-2. Dit maakt een specifieke interactie van de gesensibiliseerde gelatine deeltjes met PV met een uniforme affiniteit voor alle drie serotypen van PV 3-6. We gebruikten een immunoadhesine vorm van PVR (PVR-IgG2a) voor de sensibilisering van gelatine deeltjes, omdat de monomere vormen van PVR slechts matig affiniteiten aan de interne bindingsplaats op het virion (dissociatie constante van 10 -7 ~ -8 M) 7, 8, en met succes waargenomen specifieke agglutinatie van de gesensibiliseerde gelatine deeltjes met PV-isolaten. Met de hoge specificiteit en uniforme affiniteit van de gevoelige deeltjes, de kritische factoren van de PV-identificatie in de PA-test zijn: 1) virus titer (voor geldige detectie van PV door PA-test) en 2) de interpretatie van agglutinatie (voor correcte identificatie van de PV) .
In het algemeen, virus titer van PV isoleert in de celkweek systeem is in een reeks van 6 tot 8 oktober CCID 50/50 ul. De detectiegrenzen van PA-test (vormen compleet agglutinatie) voor type 1, 2 en 3 PV werden 1.5x10 6 CCID 50, 5.3x10 5 CCID 50 en 9.1x10 5 CCID 50, respectievelijk 2. De PA-assay correct geïdentificeerd grootste deel van de PV-isoleert, zelfs in de aanwezigheid van andere niet-PV enterovirussen. Echter, voor sommige monsters een mengsel van verschillende serotypen van PV bevatte, kleine serotype niet worden gedetecteerd. Duidelijke agglutinatie moeten worden gevormd met voldoende virus titer boven de detectiegrenzen. In het geval dat de agglutinatie in geen antistoffen monster was onduidelijk of gedeeltelijk, moet de isolaten opnieuw worden versterkt in het RD cellen om de titer 9 te verhogen.
Gedeeltelijke agglutinatie werd waargenomen wanneer het virus titer was laag en net onder de detectiegrenzen. Duidelijk verschil van agglutinatie van de negatieve controle kan worden beoordeeld als positief PA-test. Echter, heel subtiel verschil van de agglutinatie beoordeeld als positief zou kunnen misleidend zijn voor de interpretatie van de resultaten. Daarom moeten de resultaten van Positive (gedeeltelijke agglutinatie) worden gebruikt als ondersteunende informatie voor mogelijk veroorzaakt door kleine serotypen van de isolaten. Dit zou echter informatie nuttig zijn bij het volgen van analyse (genomic sequencing van PV-isolaten of real-time RT-PCR) stelde een mogelijkheid dat het monster een mengsel van verschillende serotypen van PV bevatte, of slechts gedeeltelijk agglutinatie werd waargenomen voor geen antilichamen monster waarin de lage virus titer zou de belangrijkste oorzaak van het onduidelijke resultaten.
Het voordeel van PA-test voor PV-identificatie is in de eenvoud van de procedure en het resultaat interpretatie. Dit zou gemakkelijk de invoering van de test voor elke laboratoria die PV-isolatie met de celkweek systeem, zonder dat er speciale apparatuur, materialen en trainingen. Gebruik van type-specifieke monoklonale antilichamen staat zou kunnen stellen voor de ontwikkeling van de nieuwe werkwijze voor de differentiatie van PV's (wild type of vaccin-achtige stammen) dat belangrijke informatie van de eigendom van de PV zou isolaten samen met de genetische differentiatie door RT-PCR en genomische sequencing 10, 11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Souji Masujima is een medewerker van New Product Design Department, Fujirebio Inc
Acknowledgments
We zijn dankbaar Junko Wada voor haar uitstekende technische bijstand. We zijn dankbaar aan Prof Akio Nomoto zo vriendelijk het verstrekken van een baculovirus expressie vector voor PVR-IgG2a. Dit onderzoek werd mede ondersteund door subsidies-in-Steun voor de bevordering van de bestrijding van polio en onderzoek voor nieuwe en opnieuw optredende infectieziekten van het ministerie van Volksgezondheid, Arbeid en Welzijn.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sensitized-gelatin particles | Fujirebio Inc. | Test kit | |
| Reconstitution buffer | Fujirebio Inc. | Test kit | |
| Microtitration plate | Fujirebio Inc. | Test kit | |
| Anti-PV antibody | RIVM |
References
- World Health Organization. Polio Laboratory Manual (4th edition) WHO/IVB/04.10. , 4th Edition, World Health Organization. (2004).
- Arita, M., Masujima, S., Wakita, T., Shimizu, H. Development of a particle agglutination method with soluble virus receptor for identification of poliovirus. J. Clin. Microbiol. 48, 2698-2702 (2010).
- Bibb, J. A., Witherell, G., Bernhardt, G., Wimmer, E. Interaction of poliovirus with its cell surface binding site. Virology. 201, 107-115 (1994).
- Koike, S. The poliovirus receptor protein is produced both as membrane-bound and secreted forms. Embo J. 9. , 3217-3224 (1990).
- Mendelsohn, C. Transformation of a human poliovirus receptor gene into mouse cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 83, 7845-7849 (1986).
- Mendelsohn, C. L., Wimmer, E., Racaniello, V. R. Cellular receptor for poliovirus: molecular cloning, nucleotide sequence, and expression of a new member of the immunoglobulin superfamily. Cell. 56, 855-865 (1989).
- Arita, M., Koike, S., Aoki, J., Horie, H., Nomoto, A. Interaction of poliovirus with its purified receptor and conformational alteration in the virion. J. Virol. 72, 3578-3586 (1998).
- McDermott, B. M., Rux, A. H., Eisenberg, R. J., Cohen, G. H., Racaniello, V. R. Two distinct binding affinities of poliovirus for its cellular receptor. J. Biol. Chem. 275, 23089-23096 (2000).
- Pipkin, P. A., Wood, D. J., Racaniello, V. R., Minor, P. D. Characterisation of L cells expressing the human poliovirus receptor for the specific detection of polioviruses in vitro. J. Virol. Methods. 41, 333-340 (1993).
- Avoort, H. G. vander Comparative study of five methods for intratypic differentiation of polioviruses. J. Clin. Microbiol. 33, 2562-2566 (1995).
- Kilpatrick, D. R. Rapid group-, serotype-, and vaccine strain-specific identification of poliovirus isolates by real-time reverse transcription-PCR using degenerate primers and probes containing deoxyinosine residues. J. Clin. Microbiol. 47, 1939-1941 (2009).
