Summary
החלקיקים פיתחה לאחרונה רומן התלכדות (רש"פ) assay ניצול קולטן מולקולה וירוס איפשר זיהוי מהיר וקל של poliovirus (PV). במאמר זה, אנו נראה את הליך assay הרשות לצורך זיהוי PV.
Abstract
ב גלובל פוליו חיסול היוזמה, אבחנה מעבדה משחק תפקיד קריטי ידי בידוד וזיהוי PV מן דגימות צואה של שיתוק רפה (AFP) במקרים אקוטיים. בארגון הבריאות העולמי (WHO) גלובל פוליו מעבדה רשת, PV בידוד וזיהוי כרגע מתבצע באמצעות תרבית תאים של המערכת בזמן אמת RT-PCR, בהתאמה. בעידן שלאחר מיגור של PV, הליכי זיהוי פשוטה ומהירה יהיה מועיל לאישור מהיר של מקרי פוליו במעבדות הלאומיות. במחקר הנוכחי, אנו נראה את ההליך של assay הרשות חדשנית שפותחה לצורך זיהוי PV. זה assay הרשות מנצל האינטראקציה של מולקולת PV (PVR) הקולטן virion כי הוא זיקה מסוימת ואחידה לכל קפסיד של PV. ההליך הוא פשוט (אחד הליך צעד צלחות תגובה) ומהירה (ניתן להשיג תוצאות בתוך שעות 2 של התגובה), והתוצאה היא נצפתה חזותית (תצפית של התלכדות של חלקיקי ג'לטין).
Protocol
1. הכנת בינוני אחזקה (MM) וצמיחה בינוני (GM)
להכנת MM ו-GM, ראה מדריך מעבדה פוליו של WHO 1. מדיום שונה Dulbecco של הנשר (DMEM) בתוספת 2% עוברית עגל בסרום (FCS) ו -10% FCS יכול לשמש תחליפים של MM ו-GM, בהתאמה.
2. הכנת נוגדנים נגד PV
- אנטי PV מחדש נוגדנים (PV RIVM הקלדה antiserum) על ידי הוספת מים (0.5 מ"ל בכל בקבוקון) כדי בקבוקון אחד של נוגדן אנטי PV (סוג 1, 2 או 3). הוסף פתרונות נוגדן מחדש (0.5 מ"ל כל אחת) כדי מ"ל של 4.5 מ"מ צינורות שכותרתו נפרד.
הערה: יש המון נוגדנים נגד PV ניתנים כצורה מחדש (0.5 מ"ל בכל בקבוקון). במשך הרבה כאלה של נוגדנים נגד PV, תוספת של מים הכינון מחדש לא הכרחי. - מערבבים נפח שווה של נוגדנים נגד PV מחדש. עבור אנטי PV1 2, 2 3, 1 או 3: מיקס 1.8 מ"ל של כל נוגדן מחדש (1.8 מ"ל + 1.8 מ"ל = 3.6 מ"ל של תערובת כל אחת). עבור אנטי PV1 2 3: מיקס 1.2 מ"ל של כל נוגדן מחדש (1.2 מ"ל + 1.2 מ"ל + 1.2 מ"ל = 3.6 מ"ל).
הערה: דגימות PV יכול להכיל תערובת של סרוטיפים שונים של PV. כדי לזהות סרוטיפ אחת של PV בדגימות בתערובת של PVS, בריכות נגד PV נוגדנים (כלומר 1 2, 2 3, 3 1, 1 +2 +3) הוא הכרחי. - מוסיפים 1 / 5 נפח של FCS (0.72 מ"ל) זה אנטי PV (1 2, 2 3, 3 +1, או 1 +2 +3) נוגדן (3.6 מ"ל כל אחד) (FCS 18.2% הסופי).
הערה: תוספת של FCS הוא הפחתה של התלכדות בלתי ספציפיים של החלקיקים ג'לטין הנגרמת על ידי נוגדנים. - שמור את בריכות נוגדן ב -20 ° C עד לשימוש assay הרשות.
3. הכינון של חלקיק ג'לטין רגיש
- הוסף 1.5 מ"ל של חיץ הכינון מחדש כלול בערכה על בקבוקון אחד של חלקיק ג'לטין רגיש (כאמור אבקת להקפיא מיובש).
- מערבבים היטב על ידי לחיצה עדינה
- שמור את החלקיקים רגיש מחדש ב 4 ° C. החלקיקים ג'לטין מחדש יכול להיות פעיל לפחות 2 שבועות שמר על 4 ° C, אבל צריך להיות מוכן לפני assay.
הערה חשובה:
אל תערבב הרבה שונים של חלקיקים ג'לטין רגיש, כי התמונה התלכדות של חלקיקים שאינם רגישים ג'לטין יכול להיות שונה על ידי הרבה של החלקיקים. עבור כל ניסוי, הרבה אחת של חלקיק ג'לטין רגיש אמור לשמש.
4. הרשות assay עבור PV זיהוי
- הכינו צלחת מיקרו טיטרציה. לצורך זיהוי של דגימה אחת וירוס, אנחנו צריכים 5 + בארות אחד לפחות שליטה שלילי (חלקיק רגיש ללא וירוסים נוגדנים, גם # 6 ב להלן. ראה שום שליטה וירוס נוגדנים בדוגמה). סה"כ מספר בארות הוא 5 + x דגימות לפחות שליטה assay.
הערה חשובה:
נא לקחת לפחות אחד לא לשלוט וירוס הנוגדן assay. בקבוקון אחד של החלקיקים הוא כ רגיש לזיהוי של 10 דגימות נגיף. - הוסף 12 μL / היטב אנטי PV נוגדן או GM לצלחת מיקרו טיטרציה. סידור הצלחת הוא כדלקמן (ראה גם דוגמה בהמשך). בדגימות ללא נוגדנים (טוב # 1 ו - 6), להוסיף 12 μL של GM במקום אנטי PV נוגדן.
הערה חשובה:
אם רבים דגימות PV צריך להיבדק אצל assay זה, פיפטה רב או מנפק יהיה מועיל עבור שלב זה.ובכן # 1 ובכן # 2 ובכן # 3 ובכן # 4 ובכן # 5 ובכן # 6 ג'נרל מוטורס אנטי P1 2 3 אנטי P1 2 אנטי P2 3 ani-P1 3 ג'נרל מוטורס - הוסף 12 μL / היטב מדגם וירוס. במדגם אחד ללא וירוס (טוב # 6), להוסיף 12 μL של GM במקום פתרון וירוס.
הערה: מדגם וירוס הוא supernatant התרבות של תאים נגועים, תאים L20B בדרך כלל או תאים RD.
הערה חשובה:
אם רבים דגימות PV צריך להיבדק אצל assay זה, פיפטה רב יהיה מועיל עבור שלב זה.ובכן # 1 ובכן # 2 ובכן # 3 ובכן # 4 ובכן # 5 ובכן # 6 וירוס מדגם וירוס מדגם וירוס מדגם וירוס מדגם וירוס מדגם ג'נרל מוטורס - קח חלקיק מחדש פתרון רגיש מתוך 4 ° C לטמפרטורת החדר, לטפוח בעדינות לחלוטין להשעות את החלקיקים.
הערה חשובה:
לאחר השעיה מלאה של החלקיקים על ידי הקשה עדינים, חלקיקים יש להוסיף מיד את הצלחות לפני החלקיקים המרחפים precipitaטה והצורה הלא הומוגנית פתרון. - הוסף 25 μL / טוב של חלקיק רגיש לכל הבארות.
הערה חשובה:
לאחר תוספת של חלקיקים רגישים, הצלחת לאלתר להיות כפופים להם לצלחת ערבוב להתחיל תגובה אחידה של הדגימות. לפיכך, תוספת של חלקיק רגיש צריך להתבצע באמצעות מתקן לצמצם פער הזמן בין דגימות הצלחת. - שים את צלחת מיקרו טיטרציה על צלחת מיקסר מערבבים את הצלחת למשך 30 שניות.
- שים את צלחת מיקרו טיטרציה על נייר לבן (מטעמי נוחות של תצפית ויזואלית) על השולחן בטמפרטורת החדר (15 ~ 30 ° C) עבור 2 ח
הערה חשובה:
אל תזיז את הצלחת במהלך ואחרי התגובה להסתכלות התוצאות והתמונות לוקח. התלכדות שנוצר אינו יציב מופרעת בקלות על ידי הזזת צלחות. - צלמו תמונות של הצלחת.
הערה חשובה:
נוף חלקי של התמונות לא יכול לתת מספיק נתונים לבדיקה ביקורת מאוחר יותר של תוצאות לפרשנות. כמה תמונות יש לנקוט כדי לכסות את כל הבארות של הצלחות התמקדות התמונה התלכדות של בארות.
5. פרשנות של התוצאות
- זיהוי בארות חיוביים ושליליים. השווה את התלכדות בדגימות עם זה של שליטה וירוס נוגדנים לא (משקעים של חלקיקים ג'לטין, התלכדות לא) (איור 1 ו - 2). תמונות של התלכדות כי יש להבחין בבירור מן הנגיף לא ולא לשלוט נוגדן (לא התלכדות, שליטה שלילי) יש לשפוט חיובית, ותמונות של התלכדות דומים שליטה שלילי צריך להישפט כמו שלילית. דוגמאות שמראות התלכדות ברורה אך חלקית בלבד יכול להישפט חיובית, אבל שיא כמו 'חיובי (התלכדות חלקית) ".
- זיהוי של PV. לפרש את תוצאות המבוססות על בארות חיוביות ושליליות עם אנטי PV הנוגדנים לזהות קפסיד PV. עקרון הפרשנות של התוצאה היא דומה לזו של בדיקת נטרול במערכת תרבית תאים (לדוגמה חיובית עבור נוגדן אנטי-P1 2 עולה כי המדגם מכיל 3 סוג PV).
6. נציג תוצאות
התוצאה נציג הרשות assay PV זיהוי מוצג באיור 1. כל זני PV נוצר התלכדות של חלקיקים רגישים ג'לטין (אין נוגדנים דגימות). בנוכחות נוגדנים המתאימים אנטי PV, משקעים של חלקיקים ג'לטין (התלכדות לא) דומה וירוס לא ולא לשלוט נוגדנים (שליטה שלילי) נצפתה (למשל, PV1 (סבין) בנוכחות אנטי P1 או 2 אנטי P3 1 נוגדנים).
באיור 1. וירוס פתרונות זיהוי PV ידי assay הרשות. PV1 של (סבין), PV2 (סבין), ו PV3 (סבין) (titers וירוס של 1.2 x 10 8 CCID 50 / 12 μL, 8.2 x 10 7 CCID 50 / 12 μL, ו 3.5 x 10 7 CCID 50 / 12 μL, בהתאמה) שימשו לזיהוי על ידי assay הרשות. אין וירוסים אין שליטה נוגדנים הראתה משקעים של חלקיקים ג'לטין (לא התלכדות, שליטה שלילי).
איור 2. פרשנות בארות חיוביים ושליליים. פתרונות וירוס של PV1 (סבין), PV2 (סבין), ו PV3 (סבין) (titers וירוס של 2.4 x 10 μL 8 50/25 CCID, 1.7 x 10 8 CCID 50 / 25 μL, ו 7.3 x 10 7 CCID 50 / 25 μL, בהתאמה) היו מדוללים 1 / 20 עד 1 / 320, ולאחר מכן 25 μL של דגימות בדילול נבחנו על ידי הרשות assay ללא אנטי PV נוגדנים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הנקודה הייחודית של assay זו הרשות היא ניצול של המולקולה PVR במקום אנטי PV נוגדנים לצורך זיהוי של PV 2. זה מאפשר אינטראקציה ספציפית של חלקיקי ג'לטין רגיש עם PV עם זיקה אחיד לכל שלושת קפסיד של PV 3-6. השתמשנו צורה immunoadhesin של PVR (PVR-IgG2a) עבור סנסיטיזציה של חלקיקי ג'לטין, כי צורות monomeric של PVR יש רק זיקות מתונה לאתר קישור יחיד על virion (ניתוק קבוע של 10 ~ -7 -8 M) 7, 8, וצפו בהצלחה התלכדות מסוימת של חלקיקי ג'לטין רגיש עם מבודד PV. עם סגוליות גבוהה זיקה אחיד של חלקיקים רגישים, הגורמים הקריטיים של הזדהות PV ב assay הרשות הם 1) כייל הנגיף (זיהוי תקף של PV על ידי הרשות assay) ו 2) הפרשנות של התלכדות (לצורך זיהוי נכון של PV) .
באופן כללי, וירוס titer של PV מבודד במערכת התרבות התאים היא בטווח של 06-8 אוקטובר CCID 50 / 50 μL. גבולות assay זיהוי של הרשות הפלסטינית (להרכיב התלכדות מלאה) עבור סוג 1, 2, 3 ו-PV היו 1.5x10 6 CCID 50, 5.3x10 5 CCID 50, 9.1x10 5 CCID 50, בהתאמה 2. Assay הרשות זיהתה נכונה את רוב PV מבודד אפילו בנוכחות enteroviruses אחרים שאינם PV. עם זאת, דגימות כמה הכילו תערובת של סרוטיפים שונים של PV, סרוטיפ קטין לא להתגלות. התלכדות נקה צריך להיווצר עם כייל וירוס מספיק מעל מגבלות זיהוי. במקרה התלכדות במדגם נוגדנים לא היה ברור או חלקית, מבודד את צריכה להיות מחדש מוגבר בתאי RD להגדיל את titer 9.
התלכדות חלקית נצפתה כאשר titer וירוס היה נמוך מעט מתחת לתחום הגילוי. הבדל ברור של התלכדות משליטת שלילי יכול להישפט כפי חיובי assay הרשות. עם זאת, הבדל דק מאוד של התלכדות לשפוט חיובית יכולה להטעות את הפרשנות של התוצאות. לפיכך, התוצאות של חיובי (התלכדות חלקית) צריך לשמש מידע תומכת שנגרמו כנראה על ידי קפסיד של קטין מבודד. עם זאת, מידע זה יהיה מועיל כאשר לניתוח הבא (רצף הגנומי של PV או מבודד בזמן אמת RT-PCR) הציע אפשרות כי המדגם הכילו תערובת של סרוטיפים שונים של PV, או רק התלכדות חלקית נצפתה למדגם נוגדנים אין שם titer וירוס נמוך יהיה הגורם העיקרי לתוצאות ברורות.
היתרון של assay הרשות עבור PV הזיהוי הוא הפשטות של הליך פרשנות והתוצאה. יכולת זו תאפשר הקדמה קלה של assay לכל מנהלת מעבדות בידוד PV עם מערכת תרבית תאים, מבלי לספק ציוד מיוחד, חומרים האימונים. ניצול סוג ספציפי נוגדנים חד שבטיים עשוי לאפשר פיתוח של שיטה חדשה בידול של PVS (סוג בר או חיסון, כמו זנים) כי תספק מידע חשוב רכוש של PV מבודד יחד עם בידול גנטי על ידי RT-PCR ו גנומית רצף 10, 11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Souji Masujima הוא עובד של מוצר חדש מחלקת עיצוב, Fujirebio בע"מ
Acknowledgments
אנו מודים Junko ואדה לקבלת סיוע טכני מעולה שלה. אנו מודים לפרופ 'אקיו Nomoto עבור באדיבות מתן וקטור ביטוי baculovirus עבור PVR-IgG2a. מחקר זה נתמך בחלקו על ידי מענקי-in-Aid לקידום פוליו חיסול ומחקר על מתעוררים מחדש המתעוררים מחלות זיהומיות של משרד העבודה הבריאות, והרווחה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sensitized-gelatin particles | Fujirebio Inc. | Test kit | |
| Reconstitution buffer | Fujirebio Inc. | Test kit | |
| Microtitration plate | Fujirebio Inc. | Test kit | |
| Anti-PV antibody | RIVM |
References
- World Health Organization. Polio Laboratory Manual (4th edition) WHO/IVB/04.10. , 4th Edition, World Health Organization. (2004).
- Arita, M., Masujima, S., Wakita, T., Shimizu, H. Development of a particle agglutination method with soluble virus receptor for identification of poliovirus. J. Clin. Microbiol. 48, 2698-2702 (2010).
- Bibb, J. A., Witherell, G., Bernhardt, G., Wimmer, E. Interaction of poliovirus with its cell surface binding site. Virology. 201, 107-115 (1994).
- Koike, S. The poliovirus receptor protein is produced both as membrane-bound and secreted forms. Embo J. 9. , 3217-3224 (1990).
- Mendelsohn, C. Transformation of a human poliovirus receptor gene into mouse cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 83, 7845-7849 (1986).
- Mendelsohn, C. L., Wimmer, E., Racaniello, V. R. Cellular receptor for poliovirus: molecular cloning, nucleotide sequence, and expression of a new member of the immunoglobulin superfamily. Cell. 56, 855-865 (1989).
- Arita, M., Koike, S., Aoki, J., Horie, H., Nomoto, A. Interaction of poliovirus with its purified receptor and conformational alteration in the virion. J. Virol. 72, 3578-3586 (1998).
- McDermott, B. M., Rux, A. H., Eisenberg, R. J., Cohen, G. H., Racaniello, V. R. Two distinct binding affinities of poliovirus for its cellular receptor. J. Biol. Chem. 275, 23089-23096 (2000).
- Pipkin, P. A., Wood, D. J., Racaniello, V. R., Minor, P. D. Characterisation of L cells expressing the human poliovirus receptor for the specific detection of polioviruses in vitro. J. Virol. Methods. 41, 333-340 (1993).
- Avoort, H. G. vander Comparative study of five methods for intratypic differentiation of polioviruses. J. Clin. Microbiol. 33, 2562-2566 (1995).
- Kilpatrick, D. R. Rapid group-, serotype-, and vaccine strain-specific identification of poliovirus isolates by real-time reverse transcription-PCR using degenerate primers and probes containing deoxyinosine residues. J. Clin. Microbiol. 47, 1939-1941 (2009).
