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Immunology and Infection

Poliovirus 식별을위한 입자 응집 방법

doi: 10.3791/2824 Published: April 20, 2011

Summary

바이러스 수용체 분자를 이용한 최근에 개발된 새로운 입자 응집 (PA) 분석은 poliovirus (PV)의 신속하고 쉬운 식별을 허용했다. 이 문서에서는, 우리는 PV 식별을 위해 PA 분석을위한 절차를 표시합니다.

Abstract

세계 소아 마비 박멸 이니셔티브에서 실험실 진단 급성 이완된 마비 (AFP) 가지 경우 대변 샘플에서 PV를 분리하고 식별하여 중요한 역할을한다. 세계 보건기구 (WHO)의 글로벌 소아 마비 실험실 네트워크, PV 고립과 신원은 현재 각각 세포 배양 시스템 및 실시간 RT - PCR을 사용하여 수행되고있다. PV의 포스트 박멸의 시대에, 간단하고 신속한 식별 절차는 국가 실험실에서 소아 마비 가지 경우 신속한 확인 도움이 될 것입니다. 현재 연구에서 우리는 PV 식별용으로 개발된 새로운 PA 분석의 절차를 표시합니다. 이 PA의 분석은 PV 수용체 (PVR) 분자와 PV의 모든 serotypes에 구체적이고 균일 친화력이다 virion의 상호 작용을 활용합니다. 절차는 간단합니다 (반응 판에 한 단계 절차)와 빠른 (결과는 반응 2 H 내에서 얻을 수있다), 그리고 그 결과는 시각 (젤라틴 입자 응집의 관찰) 관찰합니다.

Protocol

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1. 유지 보수 매체의 준비 (MM) 및 성장 매체 (GM)

MM과 GM의 준비, 1 소아 마비 실험실 설명서를 참조하십시오. Dulbecco의 수정된 이글 배지 (DMEM)는 2퍼센트 소태아 혈청 (FCS)와 FCS가 각각 MM 및 GM의 대체로서 사용될 수 10 % 보충.

2. 안티 PV 항체의 준비

  1. 안티 PV 항체 (타입 1, 2, 또는 3)의 각 유리병에 물 (유리병 당 0.5 ML)를 추가하여 Reconstitute 방지 PV 항체 (RIVM PV 입력 항혈청). 별도의 표시 튜브에 MM 4.5 ML이 재구성 항체 솔루션 (0.5 ML 각)를 추가합니다.
    참고 : 안티 PV 항체 중 일부는 많은가 재구성 양식 (유리병 당 0.5 ML)로 제공됩니다. 안티 PV 항체의 같은 많은, reconstitution을위한 물 또한 필요하지 않습니다.
  2. 재구성 방지 PV 항체의 동일한 음량을 섞는다. 에 대한 안티 PV1 2, 2 3, 또는 3 +1 : 혼합 각 재구성 항체의 1.8 ML (각 조합에 대해 1.8 ML + 1.8 ML = 3.6 ML). 에 대한 안티 PV1 2 세 : 혼합 각 재구성 항체 1.2 ML (1.2 ML + 1.2 ML + 1.2 ML은 = 3.6 ML).
    참고 : PV 샘플은 PV의 다른 serotypes의 혼합물을 포함 수 있습니다. PVS의 혼합과 샘플의 PV 중 하나의 혈청형을 확인하려면 안티 PV 항체 (예 : 1 +2, 2 +3, 3 +1, 1 +2 +3)의 수영장이 필요합니다.
  3. 각 백신 PV (1 +2, 2 +3, 3 +1, 또는 1 +2 +3) 항체 (3.6 ML 각) (최종 18.2 % FCS)에 FCS (0.72 ML)의 1 / 5 볼륨을 추가합니다.
    참고 : FCS의 추가는 항체에 의한 젤라틴 입자가 아닌 구체적인 유착의 감소입니다.
  4. -20 ° C에서 PA 분석에 사용할 때까지 항체 풀을 유지.

3. sensitized 젤라틴 입자의 Reconstitution

  1. sensitized 젤라틴 입자 중 하나 유리병 (동결 건조 분말로 제공)에 키트에 포함된 reconstitution 버퍼의 1.5 ML를 추가합니다.
  2. 부드러운 감청에 의해 잘 믹스
  3. 4 재구성 sensitized 입자 ° C. 유지 재구성 젤라틴 입자는 4 ° C에 보관 적어도 이주 활성화 될 수 있지만, 단지 분석하기 전에 준비를해야합니다.

중요 사항 :
sensitized 젤라틴 입자의 응집이 아닌 이미지는 입자의 많은에 의해 다를 수 수 있기 때문에, sensitized 젤라틴 입자의 다른 많은 혼합하지 마십시오. 각 실험, sensitized 젤라틴 입자의 단일 많이 사용해야합니다.

4. PV 식별 PA 분석

  1. 마이크로 적정 플레이트를 준비합니다. 한 바이러스 샘플의 식별을 위해, 우리는 5 웰스 필요 + 적어도 하나의 대조군 (아래에 바이러스 및 항체없이 sensitized 입자 잘 # 6. 예에 대한 바이러스 및 항체 컨트롤을 참조하지 않음). 웰스의 총수는 분석에 + 하나 이상의 컨트롤 5 X 샘플입니다.
    중요 사항 :
    분석에 적어도 하나의 어떤 바이러스 및 항체 제어권을하시기 바랍니다. sensitized 입자 중 하나 유리병 10 바이러스 샘플을 식별 약입니다.
  2. 마이크로 적정 플레이트 12 μL / 음 방지 PV 항체이나 GM의을 추가합니다. (아래 예제 참조) 다음과 같이 접시의 배열입니다. 항체 (물론 # 1 6)없이 샘플에서, 12 GM의 μL 대신 방지 PV 항체를 추가합니다.
    중요 사항 :
    많은 PV 샘플이 분석에서 테스트해야하는 경우, 멀티채널 피펫 또는 디스펜서이 단계에 대한 도움이 될 것입니다.
    웰 # 1 웰 # 2 그럼 # 3 웰 # 4 웰 # 5 웰 # 6
    GM 안티 P1 2 3 안티 - P1이 안티 P2 3 애니 - P1의 세 GM
  3. 12 μL / 웰의 바이러스 샘플을 추가합니다. 바이러스없이 한 샘플 (물론 # 6)에서, 12 GM의 μL 대신 바이러스 솔루션을 추가합니다.
    참고 : 바이러스 샘플 감염된 세포, 보통 L20B 셀 또는 RD 세포의 문화 뜨는입니다.
    중요 사항 :
    많은 PV 샘플이 분석에서 테스트해야하는 경우, 멀티채널 피펫이 단계에 대한 도움이 될 것입니다.
    웰 # 1 웰 # 2 그럼 # 3 웰 # 4 웰 # 5 웰 # 6
    바이러스 샘플 바이러스 샘플 바이러스 샘플 바이러스 샘플 바이러스 샘플 GM
  4. 실내 온도 ° C 4에서 재구성 sensitized 입자 솔루션을 가지고, 천천히 완전히 입자를 중지 누릅니다.
    중요 사항 :
    부드러운 감청에 의한 입자의 완전한 정지 후, 입자가 정지 입자 precipita 전에 접시에 즉시 추가되어야테와 형식이 아닌 단일 솔루션입니다.
  5. 25 μL / 음의 모든 우물에 sensitized 입자를 추가합니다.
    중요 사항 :
    sensitized 입자를 추가 후, 접시는 즉시 샘플 균일한 반응을 시작하는 혼합 플레이트를 받게됩니다. 따라서, sensitized 입자의 추가는 접시에있는 샘플 간의 시간 지연을 최소화하기 위해 디스펜서를 사용하여 수행되어야합니다.
  6. 접시 믹서에 마이크로 적정 판을 넣어 30 초에 대한 번호판을 섞는다.
  7. 상온에서 테이블에 흰 종이에 마이크로 적정 플레이트를 (시각 관찰 편의를 위해) 올려 (15 ~ 30 ° C) 2 H.
    중요 사항 :
    결과 관찰하고 복용 사진에 대한 반응 중 후 접시를 이동하지 마십시오. 형성 응집이 안정되지 않으며 쉽게 접시를 이동하여 방해.
  8. 접시의 사진을 찍어.
    중요 사항 :
    사진의 부분을 볼 해석에 대한 결과를 나중에 심사 및 검토를위한 충분한 데이터를 얻을 수 없습니다. 여러 사진이 우물의 응집 이미지에 초점을 접시의 모든 우물을 커버로 이동해야합니다.

5. 결과의 해석

  1. 긍정적이고 부정적인 우물의 식별. 아니오 바이러스 및 항체 제어 (젤라틴 입자가 아닌 응집의 강수량) (그림 1 및 2)의로 샘플의 응집을 비교합니다. 분명하게 노 바이러스없이 항체 제어 (비 응집, 대조군)에서 구별 아르 응집의 이미지는 긍정적인 판단되어야하고, 대조군과 유사한 유착의 이미지는 부정적으로 판단해야합니다. 분명하지만 일부 분만 응집을 보여 샘플은 '긍정적인 (일부 응집)'로 긍정하지만, 기록으로 판단 될 수 있습니다.
  2. PV의 식별. PV의 serotypes를 식별하는 안티 - PV 항체와 긍정적이고 부정적인 우물에 따라 결과를 해석한다. 결과의 해석 원리는 세포 배양 시스템에서 중화 시험 (예 : 긍정적인 안티 - P1이 항체에 대한 샘플 타입 3 PV가 포함되어 있음을 나타냅니다)의 유사합니다.

6. 대표 결과

PA 분석 PV 식별 대표 결과는 그림 1에 표시됩니다. 모든 PV의 변종이 sensitized 젤라틴 입자 (노 항체 샘플)의 응집을 형성. 해당 안티 PV 항체, 아니 바이러스와 유사한 젤라틴 입자 (비 응집)의 강수량없이 항체 제어 (대조군)의 면전에서 (예를 들어, PV1 (사빈) 안티 - P1이의 존재 또는 관찰되었다 안티 P3 1 항체).

그림 1
그림 1. PV1 (사빈)의 PA 분석하여 PV의 식별. 바이러스 솔루션, PV2 (사빈) 및 PV3 (사빈) (1.2 X 10 8 CCID 12분의 50 μL, 8.2 X 10 7 CCID 12분의 50 μL의 바이러스 titers, 그리고 3.5 X 10 7 CCID 12분의 50 각각 μL가) PA 분석하여 식별을 위해 사용되었습니다. 대한 바이러스없이 항체 제어 젤라틴 입자 (비 응집, 대조군)의 강수량을 보여 않습니다.

그림 2
그림 2. 긍정적이고 부정적인 우물의 해석. PV1 (사빈)의 바이러스 솔루션, PV2 (사빈) 및 PV3 (사빈) (2.4 X 10 8 CCID 25분의 50 μL의 바이러스 titers, 1.7 X 10 8 CCID 25분의 50 μL와 각각 7.3 X 10 7 CCID 25분의 50 μL가) 320분의 1 to 20분의 1 희석되었고, 다음 희석 시료 25 μL는 안티 - PV 항체없이 PA 분석을 면밀히 검토했다.

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Discussion

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이 PA의 분석의 독특한 점은 PV 2의 검출을위한 안티 - PV 항체 대신 PVR 분자의 활용이다. 이것은 PV 3-6의 세 serotypes에 균일 친화력과 PV와 sensitized 젤라틴 입자의 구체적인 상호 작용을 허용합니다. PVR의 monomeric 형태 virion에서 단일 바인딩 사이트에만 중간 동질성 (~ -8 M 10 -7의 해리 상수) 7을 가지고 있기 때문에 우리는, 젤라틴 입자의 sensitization에 대한 PVR의 immunoadhesin 양식을 (PVR - IgG2a) 사용 8, 성공적으로 PV의 격리와 sensitized 젤라틴 입자의 특정 응집을 관찰했다. 높은 특이성과 sensitized 입자의 균일 친화력으로 PA 분석의 PV 식별의 중요한 요인은 바이러스 titer (PA 분석하여 PV의 유효 감지)과 2) 응집의 해석 (PV의 정확한 식별을위한)) 일아르 .

일반적으로, PV의 바이러스 titer는 세포 배양 시스템에서 격리하는 것은 10월 6일부터 8일까지 CCID 50분의 50 μL의 범위에 있습니다. 유형 1, 2, 3 PV에 대한 PA 분석 (전체 응집을 형성)의 검출 한계는 1.5x10 6 CCID 50, 5.3x10 5 CCID 50, 각각 9.1x10 5 CCID 50, 2있었습니다. PA 분석 올바르게 PV의 대부분을 확인도 다른 비 PV의 enteroviruses의 존재에서 분리합니다. 그러나, 몇 가지 샘플 PV 다른 serotypes의 혼합물을 포함, 마이너 혈청형은 감지에 실패했습니다. 지우기 응집은 검출 한계 이상의 충분한 바이러스 titer와 함께 구성해야합니다. 없음 항체 샘플의 응집이 명확 또는 일부습니다 경우에는 분리가 titer 9 높이기 위해 R & D 세포에서 다시 증폭됩니다.

바이러스 titer 그냥 검출 한계 이하 낮은 때 부분 응집이 관찰되었다. 대조군에서 응집 명백한 차이는 PA 분석에서 긍정으로 판단 될 수 있습니다. 그러나, 응집 상당히 미묘한 차이는 긍정적인 오해는 결과의 해석 수로 판단. 따라서, 긍정적 (부분 응집)의 결과는 가능한 분리의 사소한 serotypes로 인한에 대한 지원 정보를 사용해야합니다. 다음과 같은 분석 (PV의 격리 또는 실시간 RT - PCR의 게놈 시퀀싱)이 예제는 PV의 다른 serotypes의 혼합물을 포함하거나, 일부 분만 응집이 더 항체 샘플 관찰되었다는 가능성을 제안하면 그러나,이 정보가 도움이 될 어디에 낮은 바이러스 titer는 불분명 결과의 주요 원인이됩니다.

PV 식별 PA 분석의 장점은 절차 및 결과 해석의 단순에 있습니다. 이것은 특별한 장비, 자료 및 교육을 제공하지 않고, 세포 배양 시스템 PV 절연을 실시 모든 실험실에 분석을 쉽게 도입을 허용합니다. 유형 특정 단클론 항체의 이용은 PV의 재산의 중요한 정보를 제공할 것이다 PVS의 분화 (야생 입력하거나 종자 백신 같은)에 대한 새로운 방법의 개발은 RT - PCR과 게놈의 유전자 차별과 함께 분리 수 있습니다 순서 10, 11.

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Disclosures

Souji Masujima 새​​로운 제품 디자인학과, Fujirebio 주식 회사의 직원입니다

Acknowledgments

우리는 그녀의 뛰어난 기술 지원을 준코 와다에게 감사하고 있습니다. 우리는 친절 PVR - IgG2a위한 baculovirus 발현 벡터를 제공하는 교수 아키오 노모토에게 감사하고 있습니다. 이 연구에 의해 부분적으로 지원되었다 기금 - - 에이드의 소아 마비 박멸의 추진 및 후생 노동 장관의 전염병을 신흥 다시 새로운 연구하십시오.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sensitized-gelatin particles Fujirebio Inc. Test kit
Reconstitution buffer Fujirebio Inc. Test kit
Microtitration plate Fujirebio Inc. Test kit
Anti-PV antibody RIVM

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References

  1. World Health Organization. Polio Laboratory Manual (4th edition) WHO/IVB/04.10. 4th Edition, World Health Organization. (2004).
  2. Arita, M., Masujima, S., Wakita, T., Shimizu, H. Development of a particle agglutination method with soluble virus receptor for identification of poliovirus. J. Clin. Microbiol. 48, 2698-2702 (2010).
  3. Bibb, J. A., Witherell, G., Bernhardt, G., Wimmer, E. Interaction of poliovirus with its cell surface binding site. Virology. 201, 107-115 (1994).
  4. Koike, S. The poliovirus receptor protein is produced both as membrane-bound and secreted forms. Embo J. 9. 3217-3224 (1990).
  5. Mendelsohn, C. Transformation of a human poliovirus receptor gene into mouse cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 83, 7845-7849 (1986).
  6. Mendelsohn, C. L., Wimmer, E., Racaniello, V. R. Cellular receptor for poliovirus: molecular cloning, nucleotide sequence, and expression of a new member of the immunoglobulin superfamily. Cell. 56, 855-865 (1989).
  7. Arita, M., Koike, S., Aoki, J., Horie, H., Nomoto, A. Interaction of poliovirus with its purified receptor and conformational alteration in the virion. J. Virol. 72, 3578-3586 (1998).
  8. McDermott, B. M., Rux, A. H., Eisenberg, R. J., Cohen, G. H., Racaniello, V. R. Two distinct binding affinities of poliovirus for its cellular receptor. J. Biol. Chem. 275, 23089-23096 (2000).
  9. Pipkin, P. A., Wood, D. J., Racaniello, V. R., Minor, P. D. Characterisation of L cells expressing the human poliovirus receptor for the specific detection of polioviruses in vitro. J. Virol. Methods. 41, 333-340 (1993).
  10. Avoort, H. G. vander Comparative study of five methods for intratypic differentiation of polioviruses. J. Clin. Microbiol. 33, 2562-2566 (1995).
  11. Kilpatrick, D. R. Rapid group-, serotype-, and vaccine strain-specific identification of poliovirus isolates by real-time reverse transcription-PCR using degenerate primers and probes containing deoxyinosine residues. J. Clin. Microbiol. 47, 1939-1941 (2009).
Poliovirus 식별을위한 입자 응집 방법
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Arita, M., Masujima, S., Wakita, T., Shimizu, H. Particle Agglutination Method for Poliovirus Identification. J. Vis. Exp. (50), e2824, doi:10.3791/2824 (2011).More

Arita, M., Masujima, S., Wakita, T., Shimizu, H. Particle Agglutination Method for Poliovirus Identification. J. Vis. Exp. (50), e2824, doi:10.3791/2824 (2011).

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