マウスモデルにおける乳腺の発達と機能の評価

Summary

このメソッドは、マウスから乳腺の発達と機能を細かく分析し、評価する方法について説明します。射乳がオキシトシンベースの筋上皮細胞の収縮アッセイを用いて評価される間に切除された乳腺を全部マウントを使用して開発の度合いを評価されています。

Abstract

人間の乳腺には、15〜20葉で構成されて乳首における分岐ダクトシステムの開口部に分泌するミルクその。これらのローブは分泌肺胞と収束ダクト¹から作られたターミナルダクト小葉単位の数で構成そのものです。マウスでは、同様のアーキテクチャは、ダクトと肺胞が結合組織の間質内に散在されている妊娠で観察される。マウス乳腺上皮は細胞の2つの層、基底膜²の範囲で示される筋上皮細胞の外側の層に囲まれた管腔細胞の内側の層から構成されるダクトのシステムのようなツリーです。出生時に、唯一のrudimental膵管ツリーには、主ダクト15〜20支店で構成される、存在しています。ホルモン^3,4,5の影響を受けて、約4週齢の思春期の開始時に枝の伸長と増幅の開始、、。 10週間で、間質のほとんどは、妊娠^2日まで各性周期に分岐し、回帰のサイクルを受けることになるダクトの複雑なシステムに侵略されている。妊娠の開始時に、開発の第2段階は、肺胞^6,7と呼ばれるブドウの形をしたミルクの分泌構造を形成する上皮の増殖と分化と、始まります。分娩に続いて、泌乳期間全体を通して、牛乳は内腔の分泌細胞で産生され、肺胞の内腔内に格納されています。仔の授乳によって誘発される神経反射によって刺激されたオキシトシン放出は、、牛乳はそれが子犬^8〜使用可能になった乳首にダクトを介して輸送されるので、肺胞の周りやダクトに沿って筋上皮細胞の同期した収縮を誘発する。乳腺の発達、分化および機能はしっかりと画策し、必要とする、間質および上皮間だけでなく、上皮^9,10,11内筋上皮および管腔細胞間の相互作用だけでなく、されています。これにより、これらの相互作用に関与する多くの遺伝子の変異は、妊娠初期、妊娠後期に分化し、授乳^12,13につながる分泌活性化の間に思春期や肺胞形成時にどちら管伸長が損なわれる可能性があります。この記事では、我々はマウス乳腺を細かく分析し、全体のマウントを使用して開発を評価する方法について説明します。我々はまた、生体外オキシトシンベースの機能アッセイを用いて筋上皮の収縮と射乳を評価する方法を示します。乳腺の発達と機能に関する遺伝子変異の効果は、このように変異体と野生型コントロールマウスではこれら2つの手法を実行することにより、 その場で決定することができる。

Protocol

1。乳腺の解剖

1. CO ₂吸入を使用して、マウスを安楽死させる。それは解剖がより困難にレンダリングする、乳腺の周りの血液の蓄積の首と、結果に大きな血管に損傷を与える可能性があるので、可能であれば、頸椎脱臼を避けてください。しかし、他の基準がそのようなオキシトシンの血中濃度として、同じマウスで評価される場合は、代替の安楽死の方法は、これはあなたのIACUCによって評価しなければならないのに、必要な場合があります。
2. ホイルに包んで、発泡スチロールに、その背中の上でマウスを配置し、四肢に広がる。しっかりと16から20ゲージの針（図1A）を使用して、すべての四肢を固定する。
3. 70％エタノールで寛大にマウスをスプレーしてください。
4. 鉗子を使用して、正中線で腹部の皮膚を引き上げ、鋭いはさみと小さな切開を行います。
5. 腹部や胸部の空洞（図1B）をパンクチャ回避しながら切開から始めて、動物の首に皮膚をカット。
6. "Yの形"（図1B）、その結果、正中切開に前足で皮膚を切り取ります。リア手足の皮膚と同じ方法（図1B）をカット。
7. 静かにマウスの側面に腹部と胸部の皮膚剥離、止血鉗子を使用する。必要に応じて、穏やかに論理積組織をカット。
8. 皮膚の下側に接続されている乳腺を公開し、16〜20ゲージの針を使用して、発泡スチロールにスキンを修正。進むと時間（図1C）で片側を完了します。
9. 鉗子を使用して、静かに動物の背骨に向かって外側から開始し、関心と腺や小さな鋭いはさみと皮膚の間のカットの乳腺を持ち上げます。あなたが慎重にカットを確認して、皮膚や筋肉のない部分が腺に残らないように。すべての乳腺（図1）はこのプロトコルを使用して削除されますが、腹部乳腺（＃4）全体のマウント用に最適ですできます。 ²番と³番目^の腺は、いくつかの櫛筋肉を持っており、それらが全体のマウントおよび組織学のために使用することができますが、それらはすべての分析に適していない可能性があります。

2。全体のマウント

1. 解剖前に少なくとも一日は、1リットルの三角フラスコ中で20分間蒸留水と沸騰の500mlのアルミニウム硫酸カリウムのカルミンおよび2.5Gの1gを溶解することによってカルミンのミョウバン溶液を調製。水で500 mlに最終的な音量を調整します。ワットマン濾紙を通して濾過し、防腐剤としてチモールの少量（数粒）を追加します。冷蔵。染色した後、カルミンのミョウバンのソリューションは、株式のボトルに戻って注ぎ、数週間にわたって何度も再利用することができます。色が薄くなると新鮮な溶液を作る。
2. マウス（ステップ1）から乳腺を切除した後、スライドガラス上に直接それを広げる。 その場の形で元のを維持し、可能な限りそれを平らにしてみてください。適切にストレッチするときに腺がうまくスライド上に残ることでしょう。
3. jar内の室温ではドラフト内で4時間、カルノア固定液（6時03分01秒100パーセントエタノール、クロロホルム、氷酢酸）で、スライドで、それを浸漬することによって腺を修正。他の人が十分であると思われる2時間を使用していることに注意してください。また、腺はまた、4℃で一晩固定することができます。
4. 15分間70％エタノールで洗う。その後、瓶からエタノール溶液の半分を除去してのddH ₂ Oで置き換えることによってそれを水に徐々に再水和する5分間インキュベートする。 3回繰り返します。各5分間、エタノールと水の風呂 - 、 - 35％ - 15％あるいは、70％を使用してください。
5. 5分間蒸留水ですすいでください。
6. 室温で一晩カルミンのミョウバンで染色。それは染色は腺の厚さに応じて時間がかかる可能性があることに留意すべきである。
7. 、再利用と徐々にキシレンに5分ごとにと明確なために、またはそのようなヒストグラムをクリアのような非毒性の代替のシリアルエタノール浴（50％、70％、95％、100％）によって染色した組織を脱水して染色カーミンのミョウバンを削除します。一晩。脱水とクリアどちらも厚い試料でより長いインキュベーションが必要になる場合があります。
8. サリチル酸メチルの乳腺を浸し。画像が撮影できるようになるまで乳腺はドラフト内でサリチル酸メチルに保管することができます。
9. 画像はライトテーブルの上にスライドを配置することにより、（可能な場合は、"マクロ"機能を使用）三脚上に位置する通常のデジタルカメラでドラフト内で撮影することができます。高倍率のための解剖顕微鏡を使用してください。また、乳腺は、画像が十分に薄いマウントを提供する任意のイメージングプラットフォームで化学ドラフト外で撮影することを可能にする（ステップ2.7の後）などPermountなどのメディアに取り付けることができます。
10. 全体のマウントを使用して乳腺の発達を定量化するために、このようなダクトの部分に沿って分枝の数（またはサイド支店）などの測定、主ダクトの長さ、または脂肪組織の領域への上皮の比率を評価することができます。最後に、写真の説明書の後にtation、乳腺の全体のマウントは、切片と、従来の組織染色用パラフィンに埋め込むことができます。

3。オキシトシン誘発の射乳

1. それらが供給された直後にダムから子犬を区切ります。アッセイを実行する前に1時間を待つ。
2. 動物からそれらを削除せずに、母を犠牲にし、前に説明したように乳腺を公開する（ステップ1.1から1.8）。
3. トランスファーピペットを使用して、均等に直接興味の乳腺にPBSまたはオキシトシンのソリューションのいずれかをドロップすることでアッセイを開始します。用量の大きいスペクトルを使用することができます。〜8 pg / mlの（生理的用量は）一般的に使用されます。しかし、高い非生理的な投与量は（最大1 mg / ml）を遺伝子組み換えマウスモデルにおける応答がないことを保証するために使用することができます。この手順では、それは射乳（オキシトシンの露出）をテストするコントロール（PBSにさらされる）と反対側のように片側を使用して、胸部（＃2-3）腺を使用することをお勧めします。
4. 1分間インキュベートし、慎重に転送ピペットでそれを吸引することによってソリューションを削除する。ダクトへのミルクのエントリは、ビデオテープの録音によって、またはPBSまたはオキシトシン曝露前と後の画像を取ることによって監視できます。

4。代表的な結果：

良い全体のマウントでは、乳腺がきちんと広がっていると上皮のダクトは簡単に（図2A）観測されています。腺が十分に広がっていない場合は固定液に入れたとき、それは部分的にまたは完全にスライドから持ち上げることができる。腺は、（図2B）、ハードと使用できなくなります。同様に、腺がよく解剖されていない場合、どちらかの上皮の一部が欠落して（図2C）や皮膚の部分を残りや腹部の筋肉は、腺の分析（図2D）と干渉することができます。

オキシトシンアッセイのために、それはあらゆる機会に、同じ時間のためのダムから哺乳仔を分離することが重要です。この方法では、あなたは牛乳やミルクの少量が前にオキシトシン曝露にダクトに存在しないことが確認されますが、また十分な母乳が筋上皮の収縮（図3A）によりダクトに放出することができる肺胞に存在すること。子犬があまりにも早く削除されると、牛乳は肺胞にし（図3B）を監視することは困難オキシトシンの効果をレンダリングするダクトに蓄積することができます。また、実験は子犬を除去した後早すぎるが実行されている場合、ミルクは肺胞に蓄積する時間がないし、筋上皮細胞のオキシトシン誘発性収縮は、（図3C）が観察されるダクトに十分なミルクのリリースをトリガしません。

図1マウスの乳腺の解剖。四肢（）でその背中の上でマウスをピン。腹から首への最初の皮膚を切り取ります。次に、点線（B）で示すように、各肢に腹の中心から垂直切開を行います。優しくピール動物の側の皮膚や乳腺（C）を公開し、それを固定する。

図2。マウス乳腺の全体のマウント。上皮管（矢印）とリンパ節（矢印）が容易に腺のうまく広がる乳腺の全体のマウント＃4（）で観察されています。悪い広がる乳腺が（B）が使用できなくなる、スライドから切り離さと崩壊になることがあります。不適切に摘出した乳腺のいずれか（D）、残りの足りない部分（C）または筋肉や皮膚の部分を持つことができます。 ²番と³番目^の腺が筋肉を櫛歯しているが、依然として全体のマウントまたは組織学的に使用することができることに注意してください。

図3。オキシトシン誘発の射乳がオキシトシンの曝露（）以下の（矢印）上皮のダクトで観察することができます。しかし、ダクトはすでに子犬、オキシトシン曝露後のダクトの牛乳のさらなる蓄積（矢印）の授乳最後の後の待ち時間の不適切に長い期間のためにアッセイの開始時に牛乳（矢印）で満たされている場合には難しい観察（B）。また、子犬授乳後の短い潜伏期間が適切にオキシトシン曝露（C）の後にダクト（矢印）で観察される肺胞に牛乳の十分な蓄積のために許可されません。画像は、数値のカメラ（サイバーショット、ソニー）を使用して、オキシトシン曝露の前後に採取した。

図4全体の取付けとオキシトシン治療アッセイの概略図。

Discussion

乳腺の発達と機能は密接にオーケストレーションされています。変異マウスは、腺のアーキテクチャ^13,12を評価する必要性を強調する乳腺の発達と機能を損なうことができる遺伝子の変異を抱くことができる。乳腺の発達のすべての段階でこの資料に記載したように全体を取付けを行うことができます。典型的には、上皮の開発は思春期（〜6週齢）の途中でと^2,10思春期（〜10〜12週齢）の後に、思春期（〜4週齢）の開始時に評価される。これらの段階で、ダクト分岐、末端のつぼみとダクトの長さの数の量は、腺の発達^14,15の程度を定量化するために決定することができます。同様に、alveologenesis（妊娠中の肺胞の開発）は、通常、妊娠中に2〜3点で決定され、授乳と退縮時に発生する構造的な変化は、全体のマウント腺の準備¹⁶で観察し、定量することができる。しかし、妊娠後期や授乳中のマウスからの全マウントの定量化は、組織の密度のために困難になる可能性があります。それは特にそれらのステージ¹²に対して、組織学的分析と全体のマウントを組み合わせることをお勧めします。より詳細な組織学的評価の場合は、乳腺をホルマリンで固定し、ヘマトキシリン​​及びエオシン染色を施したこのレポートに記載されている同じプロトコルを、使用して削除することができます。全体のマウントはまた、パラフィンイメージングが実行された後は、組み込みと組織学のために使用することができます。両方の手法の場合は、乳腺の適切かつ繊細な解離は重要です。変異マウスが評価されている場合、異なるマウス系統は、変数サイドまたは三次波及効果、またはalveologenesis ^17を示すことができるので、それは、可能な限り近い対照マウスにこれらのマウスを比較することが重要です。例えば、BALB / cマウスと比較して、C57BL / 6マウスでは減少側分岐とalveologenesis ^17,18を示 ​​す。従って、BALB / cマウスは、C57BL / 6マウスの背景上で生成された遺伝子改変マウスのコントロールとして使用しないでください。全体の取り付けが総発達障害への洞察を提供していますが、乳腺の機能は、他の補完的な技術を用いて評価する必要があります。

乳腺の主な機能は、生産と子犬にミルクを提供することです。これらのプロセスだけでなく、妊娠中に分泌管腔細胞の適切な分化するだけでなく、肺胞の周りと牛乳の輸送⁸のダクトに沿って筋上皮細胞の座標と効率的な収縮を必要とする。牛乳の生産と品質が乳組成¹²の分析評価によって評価することができるが、とりわけ、子犬に障害牛乳配達の原因は、評価することが困難です。確かに、新生児仔の胃にミルクの観察不在は、そのような障害牛乳の生産、サックに仔の能力の欠如、母親や射乳の欠陥の行動異常などの多くの欠陥にリンクすることができます。ダクトに肺胞から牛乳の輸送と排出の欠陥を評価する一つの方法は、この資料に記載されているオキシトシンを使用して、筋上皮の収縮を誘発することです。オキシトシンex vivoでの効果が急速であるため、しかし、牛乳の輸送と排出の定量化は、オキシトシン¹⁰の低生理的用量を使用している場合でも、（普通牛乳は暴露後1分以内にダクトで観察することができる）ことは困難である。したがって、2つのマウスライン間射乳の効率のわずかな違いは、この手法を用いて観測されていない可能性があります。この応答を定量化することは困難ですが、オキシトシン誘発の射乳を評価の一つの半定量的な方法は、用量の様々な環境下での応答を調べるために、牛乳とダクトを埋めるために必要な処理時間を決定することです。 。すべてのケースでは、アッセイの先頭に授乳最後の子犬との間の待機期間の一貫性は重要です。それぞれ、射乳の欠陥の授乳や識別のより正確な定量化のため、このメソッドはそのようなβ-カゼインおよびSTAT5などの乳タンパク質とシグナル伝達経路の定量化によって補完することができる、またはオキシトシン曝露¹⁹時試験管内筋上皮細胞の収縮に 。

要約では、トランスジェニックマウスモデルでは、乳腺の機能と開発を研究するための重要かつ広く使用されており、これらのプロセスで重要な遺伝子の役割を評価する。乳腺上皮のアーキテクチャは、容易に開発のすべての段階で全体のマウントを使用して適切に切除した腺で観察することができます。子犬の栄養失調につながる授乳の欠陥は多くの起源を持つことができますが、射乳の欠乏は、 その場で筋上皮細胞のオキシトシン誘発の同期収縮によって評価することができる。一緒に、これら2つの技術（図4）特定の遺伝子変異の効果は重要な洞察を与えることができますtionsまたは乳腺の発達と機能で削除。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Carmine	Sigma-Aldrich	C1022
Aluminum potassium sulfate	Sigma-Aldrich	A6435
Thymol	Sigma-Aldrich	T0501
Methyl salicylate	Sigma-Aldrich	M6752
Oxytocin	Sigma-Aldrich	O3251