Summary
Cette méthode décrit comment disséquer et d'évaluer le développement des glandes mammaires et de la fonction de souris. Excisées glandes mammaires sont évalués pour le degré de développement en utilisant mount ensemble, tandis que l'éjection du lait est évaluée en utilisant une ocytocine essai basé sur la contraction des cellules myoépithéliales.
Abstract
La glande mammaire humain est composé de lobes 15-20 que le lait sécrètent dans une ouverture du système conduit au branchement du mamelon. Ceux lobes sont eux-mêmes composés d'un nombre d'unités terminales lobulaire conduit en alvéoles sécrétoires et des conduits convergents 1. Chez la souris, une architecture similaire est observée à la grossesse dans laquelle les conduits et les alvéoles sont entrecoupées dans le stroma de tissu conjonctif. L'épithélium glande mammaire de souris est un arbre comme système de conduits composé de deux couches de cellules, une couche de cellules luminales entouré par une couche externe de cellules myoépithéliales notée par les limites d'une membrane de 2 sous-sol. À la naissance, seulement un arbre canalaire rudimentaire est présent, composé d'un conduit de branches primaires et 15-20. Direction l'élongation et de commencer d'amplification au début de la puberté, environ 4 semaines, sous l'influence des hormones 3,4,5. A 10 semaines, la plupart du stroma est envahi par un système complexe de canaux qui seront soumis à des cycles de ramification et de régression dans chaque cycle œstral jusqu'à la grossesse 2. Au début de la grossesse, une deuxième phase de développement commence, avec la prolifération et la différenciation de l'épithélium pour former des structures en forme de raisin sécrétion de lait appelés alvéoles 6,7. Après l'accouchement et pendant l'allaitement, le lait est produit par les cellules sécrétrices luminale et stockée dans la lumière des alvéoles pulmonaires. L'ocytocine communiqué, stimulée par un réflexe neurale induite par l'allaitement des bébés, induit des contractions synchronisée des cellules myoépithéliales autour des alvéoles et le long des canaux, permettant de lait pour être transportés à travers les conduits vers le mamelon où il devient à la disposition des huit chiots. Développement de la glande mammaire, la différenciation et la fonction sont étroitement orchestré et exigent, non seulement les interactions entre le stroma et l'épithélium, mais également entre les cellules myoépithéliales et luminales dans l'épithélium 9,10,11. Ainsi, des mutations dans plusieurs gènes impliqués dans ces interactions peuvent altérer soit un allongement canalaire durant la formation de la puberté ou alvéoles en début de grossesse, la différenciation en fin de grossesse et de l'activation sécrétoire conduisant à la lactation 12,13. Dans cet article, nous décrivons comment disséquer glandes mammaires de souris et d'évaluer leur développement en utilisant monte entier. Nous démontrons également comment évaluer les contractions myoépithéliales et d'éjection du lait à l'aide d'un ex-vivo ocytocine basée sur l'analyse fonctionnelle. L'effet de la mutation d'un gène sur le développement des glandes mammaires et de la fonction peut donc être déterminée in situ par l'exécution de ces deux techniques chez les souris mutantes et de contrôle de type sauvage.
Protocol
1. Dissection des glandes mammaires
- Euthanasier la souris en utilisant inhalation de CO 2. Évitez si possible dislocation cervicale car il peut endommager les vaisseaux sanguins principaux dans le cou et le résultat de l'accumulation de sang autour des glandes mammaires, ce qui rend la dissection plus difficile. Cependant, si d'autres critères doivent être évalués dans la même souris, tels que les niveaux sanguins de l'ocytocine, les méthodes alternatives d'euthanasie peut être nécessaire, même si cela doit être évalué par votre IACUC.
- Sur une mousse de polystyrène enveloppé dans une feuille, placez la souris sur son dos et la propagation des quatre membres. Pin fermement toutes les quatre membres en utilisant de 16 à 20 aiguilles de calibre (figure 1A).
- Vaporiser généreusement la souris avec de l'éthanol à 70%.
- En utilisant une pince, tirez sur la peau de l'abdomen à la ligne médiane et faire une petite incision avec des ciseaux pointus.
- A partir de l'incision, couper la peau jusqu'à la nuque de l'animal tout en évitant la perforation des cavités abdominale ou thoracique (figure 1B).
- Couper la peau sur les pattes avant à l'incision médiane, résultant en une «forme en Y" (figure 1B). Couper la peau sur les membres postérieurs de la même façon (figure 1B).
- En utilisant des pinces hémostatiques, retirez délicatement la peau abdominale et thoracique sur le côté de la souris. Si nécessaire, couper délicatement le tissu conjonctif.
- Fixer la peau à l'aide de mousse de polystyrène de 16 à 20 aiguilles de calibre, ce qui expose les glandes mammaires attaché à la face inférieure de la peau. Continuer et complétez un côté à la fois (figure 1C).
- En utilisant des pinces, soulever délicatement la glande mammaire d'intérêt et coupé entre la glande et la peau avec de petits ciseaux pointus, à partir de l'extérieur vers l'épine dorsale de l'animal. Assurez-vous que vous coupez soigneusement, de sorte qu'aucun des morceaux de peau ou les muscles restent sur la glande. Toutes les glandes mammaires (figure 1) peut être enlevé en utilisant ce protocole, mais abdominales glandes mammaires (# 4) sont les meilleurs pour le montage ensemble. Le 2 ème et 3 ème glandes ont des muscles interdigitées et alors qu'ils peuvent être utilisés pour monter l'ensemble et l'histologie, ils pourraient ne pas être approprié pour toutes les analyses.
2. Whole montage
- Au moins un jour avant la dissection, préparer la solution d'alun de carmin en dissolvant 1 g de carmin et 2,5 g de sulfate d'aluminium de potassium dans 500 ml d'eau distillée et faire bouillir pendant 20 minutes dans un flacon de 1 litre Erlenmeyer. Ajuster le volume final à 500 ml avec de l'eau. Filtrer à travers un papier Whatman et ajouter une petite quantité de thymol (quelques grains) comme conservateur. Réfrigérer. Après coloration, solution d'alun de carmin peut être reversé à la bouteille de stock et réutilisés plusieurs fois sur plusieurs semaines. Préparer une solution fraîche quand la couleur devient pâle.
- Après l'excision de la glande mammaire de la souris (étape 1), elle s'est répandue directement sur une lame de verre. Essayez de l'aplatir autant que possible, en gardant l'original dans la forme in situ. La glande se coller sur la lame bien lorsqu'il est correctement tendue.
- Fixer la glande en l'immergeant, sur la diapositive, dans un fixateur de Carnoy (100% EtOH, le chloroforme, acide acétique glacial; 6:3:1) pendant 4 heures dans la hotte à température ambiante dans un bocal. Notez que d'autres ont utilisé 2 heures qui semble être suffisant. Alternativement, les glandes peuvent également être fixé à 4 ° C pendant la nuit.
- Laver à l'éthanol 70% pendant 15 min. Puis, progressivement réhydrater dans l'eau en enlevant la moitié de la solution d'éthanol à partir du pot et de le remplacer par ddH 2 O. Incuber pendant 5 min. Répétez 3 fois. Sinon, utilisez 70% - 35% - 15% - bains d'éthanol et d'eau pendant 5 minutes chacune.
- Rincer à l'eau distillée pendant 5 minutes.
- Colorer dans l'alun carminé nuit à température ambiante. Il faut noter que la coloration peut prendre plus selon l'épaisseur de la glande.
- Retirez l'alun carminé tache pour la réutilisation et progressivement se déshydrater les tissus tachés par les bains d'éthanol de série (50%, 70%, 95%, 100%) pendant 5 min chacun et clarifier dans le xylène, ou dans une solution de rechange non toxiques tels que Histo-clair, pendant la nuit. Les deux déshydratation et de compensation pourrait également exiger plus incubations avec des échantillons plus épais.
- Plongez dans la glande mammaire salicylate de méthyle. Les glandes mammaires peuvent être conservés dans du salicylate de méthyle dans une hotte jusqu'au images sont prêtes à prendre.
- Les images peuvent être prises dans une hotte avec un appareil photo numérique classique placé sur un trépied (utilisez "macro" de fonction si disponible), en plaçant les lames sur une table lumineuse. Utiliser un microscope à dissection pour un plus fort grossissement. Alternativement, les glandes mammaires peuvent être montés dans des supports tels que Permount (après l'étape 2.7) permettant de photos à prendre en dehors d'une hotte sur n'importe quelle plateforme d'imagerie fournissant les montures sont suffisamment minces.
- Afin de quantifier le développement des glandes mammaires avec mount ensemble, des mesures telles que le nombre de ramifications (ou branches latérales) le long des portions de conduits, de la longueur des conduits primaires, soit un ratio de l'épithélium à la surface du tissu adipeux pourrait être évaluée. Enfin, après documentation photographiquetion, monter mammaires toute la glande peut être incorporé dans de la paraffine pour la coupe et la coloration histologique conventionnelle.
3. D'éjection du lait induites par l'ocytocine
- Séparez les chiots à partir du barrage juste après qu'ils ont été nourris. Attendre 1 heure avant d'effectuer le dosage.
- Sacrifice de la mère et d'exposer les glandes mammaires, comme décrit précédemment (étapes 1.1 à 1.8), sans les supprimer de l'animal.
- Démarrez le dosage par tomber soit uniformément PBS ou la solution d'ocytocine directement sur la glande mammaire d'intérêt, à l'aide d'une pipette de transfert. Un large spectre de doses peuvent être utilisés; ~ 8 pg / ml (dose physiologique) est généralement utilisé. Cependant, une forte dose non physiologique (jusqu'à 1 mg / ml) peut être utilisé pour assurer l'absence de réponse dans des modèles murins génétiquement modifiés. Pour cette procédure, il est recommandé d'utiliser thoracique (# 2-3) glandes, en utilisant un côté comme témoin (exposé à PBS) et de l'autre côté de tester l'éjection du lait (exposition ocytocine).
- Incuber pendant 1 minute et retirer la solution en aspirant soigneusement avec une pipette de transfert. D'entrée de lait dans les canaux peuvent être surveillés par enregistrement sur bande vidéo, ou en prenant des images avant et après exposition PBS ou l'ocytocine.
4. Les résultats représentatifs:
Dans l'ensemble une bonne monture, la glande mammaire est joliment répartis et les conduits épithélium sont facilement observables (figure 2A). Si la glande n'est pas bien réparties, il peut soulever jusqu'à en partie ou totalement de la diapositive lorsqu'il est placé dans la solution de fixation. La glande deviendra alors dur et inutilisable (figure 2B). De même, si la glande n'est pas bien disséqué, soit une partie de l'épithélium peut être absent (figure 2C) ou encore certaines parties de la peau ou les muscles abdominaux va interférer avec l'analyse de la glande (Figure 2D).
Pour le dosage de l'ocytocine, il est important de séparer les petits allaités à partir du barrage pour la même quantité de temps à chaque occasion. De cette façon, vous vous assurerez que les pas de lait ou de petites quantités de lait est présent dans les conduits avant l'exposition d'ocytocine, mais aussi que suffisamment de lait est présent dans les alvéoles qui peut être éjecté dans les conduits par des contractions myoépithéliales (figure 3A) . Si les chiots sont retirés trop tôt, le lait peut s'accumuler dans les alvéoles et dans les conduits rendu l'effet de l'ocytocine difficiles à contrôler (figure 3B). Alternativement, si l'expérience est faite trop tôt après le retrait chiot, le lait ne sera pas le temps de s'accumuler dans les alvéoles et de l'ocytocine contractions induites par des cellules myoépithéliales ne déclenchera pas communiqué suffisamment de lait dans les conduits d'être observées (figure 3C).
Figure 1. Dissection des glandes mammaires de souris. Pin de la souris sur son dos par les quatre membres (A). Couper la première peau du ventre à la nuque. Ensuite, faire des incisions perpendiculaires à partir du centre du ventre à chaque membre, comme indiqué par la ligne pointillée (B). Décoller doucement la peau sur le côté de l'animal et le pin, exposant les glandes mammaires (C).
Figure 2. Souris monter mammaires toute la glande. Conduits épithélium (flèches) et le ganglion lymphatique (flèche) sont facilement observées dans une monture glande mammaire très bien réparties ensemble de la glande # 4 (A). Une glande mal réparties mammaires peuvent se détacher de la lame et s'est effondrée, la rendant inutilisable (B). Une glande mammaire de mal excisée peut avoir soit des pièces manquantes (C) ou des morceaux de muscle ou la peau restante (D). Notez que les 2 ème et 3 ème glandes ont interdigitées musculaire, mais peut encore être utilisé pour l'ensemble de montage ou d'histologie.
Figure 3. Éjection du lait induites par l'ocytocine peut être observée dans l'épithélium des conduits (flèches) après une exposition d'ocytocine (A). Cependant, si les conduits sont déjà remplis avec du lait (flèches) au début de l'essai en raison d'une période de temps de latence de façon inappropriée après la dernière tétée des chiots, une nouvelle accumulation de lait dans les conduits (flèches) après l'exposition ocytocine est difficile de observer (B). Alternativement, une courte période de latence après la tétée chiot ne permettra pas à l'accumulation suffisante de lait dans les alvéoles d'être correctement observés dans les conduits (flèches) après une exposition d'ocytocine (C). Les images ont été prises avant et après l'exposition ocytocine aide d'une caméra numérique (Cybershot, Sony).
Figure 4. Représentation schématique des dosages ensemble du traitement de montage et de l'ocytocine.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Développement des glandes mammaires et la fonction sont étroitement orchestrée. Les souris mutantes pourraient abriter des mutations génétiques qui peuvent altérer le développement des glandes mammaires et de la fonction soulignant la nécessité d'évaluer l'architecture 13,12 glande. De montage entières peuvent être réalisées comme décrit dans cet article à toutes les étapes du développement de la glande mammaire. Typiquement, le développement de l'épithélium est évalué au début de la puberté (~ 4 semaines), au milieu de la puberté (~ 6 semaines) et après la puberté (~ 10-12 semaines) 2,10. Lors de ces étapes, la quantité de conduits de branchement, le nombre de bourgeons extrémité terminale et la longueur des conduits peut être déterminé afin de quantifier le degré de développement de la glande 14,15. De même, alveologenesis (développement des alvéoles pendant la grossesse) est généralement déterminée à 2-3 points au cours de la grossesse; les changements structurels qui se produisent pendant la lactation et l'involution peuvent également être observés et quantifiés dans l'ensemble des préparations glande monture 16. Cependant, la quantification de l'ensemble monte de la fin des souris enceintes et allaitantes peut être difficile en raison de la densité du tissu. Il est recommandé de combiner monter l'ensemble des analyses histologiques, en particulier pour ces 12 étapes. Pour l'évaluation histologique plus détaillée, les glandes mammaires peuvent être enlevés en utilisant le même protocole noté dans ce rapport, fixés dans le formol et soumis à l'hématoxyline et éosine. Mont entiers peuvent également être inclus en paraffine et utilisé pour l'histologie fois imagerie a été effectuée. Pour les deux techniques, la dissection adéquate et délicate de la glande mammaire est cruciale. Si les souris mutantes sont en cours d'évaluation, il est important de comparer ces souris aux souris contrôle le plus proche possible, car les souches de souris différentes peuvent montrer la face ou variable tertiaire ramifications, ou alveologenesis 17. Par exemple, lorsque comparé à souris Balb / c, C57BL / 6 présentent des ramifications secondaires réduits et alveologenesis 17,18. Par conséquent, souris Balb / c ne doit pas être utilisé comme un contrôle des souris génétiquement modifiées produites sur fond C57BL / 6 de la souris. Alors que le montage donne un aperçu de l'ensemble brute défauts de développement, la fonction de la glande mammaire peuvent aussi avoir besoin d'être évalués en utilisant d'autres techniques complémentaires.
La fonction principale de la glande mammaire est de produire et de livrer du lait aux bébés. Ces processus requièrent non seulement la différenciation correcte des cellules sécrétrices luminal pendant la grossesse, mais aussi coordonner les contractions et efficace des cellules myoépithéliales autour des alvéoles et le long des conduits pour le transport du lait 8. Alors que la production laitière et la qualité peuvent être évaluées par une évaluation analytique de 12 la composition du lait, entre autres, les causes de la livraison du lait à la déficience des chiots est plus difficile à évaluer. En effet, l'absence observée de lait dans l'estomac des nouveau-nés peut être liée à de nombreux défauts tels que la production de lait déficience, l'incapacité des chiots à téter, les défauts de comportement de la mère ou les défauts d'éjection du lait. Une façon d'évaluer le transport du lait et des défauts d'éjection des alvéoles dans les canaux est d'induire des contractions myoépithéliales utilisant l'ocytocine, comme décrit dans cet article. Cependant, la quantification de transport du lait et d'éjection est difficile car l'effet de l'ocytocine ex vivo est rapide (généralement le lait peut être observé dans les conduits de moins de 1 minute après l'exposition), même en utilisant de faibles doses physiologiques de l'ocytocine 10. Ainsi, une légère différence dans l'efficacité de l'éjection du lait entre deux lignées de souris pourrait ne pas être observable en utilisant cette technique. Quantifier cette réponse est difficile, mais une semi-quantitative façon d'évaluer l'éjection du lait induites par l'ocytocine est d'examiner la réponse sous une variété de dosages et de déterminer le temps de traitement nécessaire pour remplir les conduits avec du lait. . Dans tous les cas, la cohérence de la période d'attente entre la dernière tétée chiot au début de l'essai est critique. Pour une quantification plus précise de l'allaitement ou l'identification d'un défaut d'éjection du lait, cette méthode peut être complétée par la quantification des protéines du lait et des voies de signalisation, tels que β-caséine et Stat5, respectivement, ou dans la contraction des cellules myoépithéliales in vitro lors de l'exposition ocytocine 19 .
En résumé, les modèles de souris transgéniques sont importants et largement utilisé pour étudier la fonction des glandes mammaires et du développement, et d'évaluer le rôle des gènes clés dans ces processus. L'architecture de l'épithélium des glandes mammaires peuvent être facilement observés dans les glandes correctement excisée à l'aide monter ensemble à tous les stades du développement. Alors que les défauts de lactation menant à la malnutrition chiots peuvent avoir de nombreuses origines, une carence en l'éjection du lait peut être évaluée par l'ocytocine induit une contraction synchronisée des cellules myoépithéliales in situ. Ensemble, ces deux techniques (figure 4) peut donner un éclairage important sur l'effet des mutations des gènes spécifiquestions ou suppressions sur le développement des glandes mammaires et de la fonction.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Ces études ont été financées par les IRSC et subventions de l'ACRCS au DWL. IP a été financée par des bourses des IRSC-STP, le FRSQ et les IRSC. MKGS a été financée par des bourses CGO et les IRSC-STP. Les auteurs remercient Kevin Barr pour son aide dans l'élevage de souris.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Carmine | Sigma-Aldrich | C1022 | |
| Aluminum potassium sulfate | Sigma-Aldrich | A6435 | |
| Thymol | Sigma-Aldrich | T0501 | |
| Methyl salicylate | Sigma-Aldrich | M6752 | |
| Oxytocin | Sigma-Aldrich | O3251 |
References
- Geddes, D. T. Inside the lactating breast: the latest anatomy research. J Midwifery Womens Health. 52, 556-556 (2007).
- Sternlicht, M. D. Key stages in mammary gland development: the cues that regulate ductal branching morphogenesis. Breast Cancer Res. 8, 201-201 (2006).
- Silberstein, G. B., Flanders, K. C., Roberts, A. B., Daniel, C. W. Regulation of mammary morphogenesis: evidence for extracellular matrix-mediated inhibition of ductal budding by transforming growth factor-beta 1. Dev Biol. 152, 354-354 (1992).
- Daniel, C. W., Robinson, S., Silberstein, G. B. The role of TGF-beta in patterning and growth of the mammary ductal tree. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 1, 331-331 (1996).
- Neville, M. C., Daniel, C. W. The Mammary gland : development, regulation, and function. , Plenum Press. New York. (1987).
- Oakes, S. R., Hilton, H. N., Ormandy, C. J. The alveolar switch: coordinating the proliferative cues and cell fate decisions that drive the formation of lobuloalveoli from ductal epithelium. Breast Cancer Res. 8, 207-207 (2006).
- Anderson, S. M., Rudolph, M. C., McManaman, J. L., Neville, M. C. Key stages in mammary gland development. Secretory activation in the mammary gland: it's not just about milk protein synthesis! Breast Cancer Res. 9, 204-204 (2007).
- Reversi, A., Cassoni, P., Chini, B. Oxytocin receptor signaling in myoepithelial and cancer cells. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 10, 221-221 (2005).
- Haslam, S. Z. Cell to cell interactions and normal mammary gland function. J Dairy Sci. 71, 2843-2843 (1988).
- Plante, I., Laird, D. W. Decreased levels of connexin43 result in impaired development of the mammary gland in a mouse model of oculodentodigital dysplasia. Dev Biol. 318, 312-312 (2008).
- Talhouk, R. S. Heterocellular interaction enhances recruitment of alpha and beta-catenins and ZO-2 into functional gap-junction complexes and induces gap junction-dependant differentiation of mammary epithelial cells. Exp Cell Res. 314, 3275-3275 (2008).
- Palmer, C. A., Neville, M. C., Anderson, S. M., McManaman, J. L. Analysis of lactation defects in transgenic mice. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 11, 269-269 (2006).
- Howlin, J., McBryan, J., Martin, F. Pubertal mammary gland development: insights from mouse models. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 11, 283-283 (2006).
- You, L. Modulation of mammary gland development in prepubertal male rats exposed to genistein and methoxychlor. Toxicol Sci. 66, 216-216 (2002).
- Grill, C. J., Cohick, W. S., Sherman, A. R. Postpubertal development of the rat mammary gland is preserved during iron deficiency. J Nutr. 131, 1444-1444 (2001).
- Hennighausen, L., Robinson, G. W. Think globally, act locally: the making of a mouse mammary gland. Genes Dev. 12, 449-449 (1998).
- Aupperlee, Strain-specific differences in the mechanisms of progesterone regulation of murine mammary gland development. Endocrinology. 150, 1485-1485 (2009).
- Montero Girard, G. Association of estrogen receptor-alpha and progesterone receptor A expression with hormonal mammary carcinogenesis: role of the host microenvironment. Breast Cancer Res. 9, R22-R22 (2007).
- Moore, D. M., Vogl, A. W., Baimbridge, K., Emerman, J. T. Effect of calcium on oxytocin-induced contraction of mammary gland myoepithelium as visualized by NBD-phallacidin. J Cell Sci. 88, 563-563 (1987).
