Summary
Questo metodo viene illustrato come analizzare e valutare lo sviluppo della ghiandola mammaria e la funzione da topi. Escisse ghiandole mammarie sono valutati per il grado di sviluppo utilizzando montare tutto mentre emissione del latte viene valutata utilizzando un ossitocina a base di test contrazione delle cellule mioepiteliali.
Abstract
La ghiandola mammaria umano è composto da 15-20 lobi, che secernono il latte in una ramificazione del sistema di apertura del condotto al capezzolo. Quelli lobi sono a loro volta composte di un numero di unità terminali del condotto lobulare in alveoli secretoria e condotti convergenti 1. Nei topi, un'architettura simile è stato osservato in gravidanza in cui si alternano dotti e degli alveoli nello stroma del tessuto connettivo. L'epitelio della ghiandola mammaria mouse è un albero come sistema di condotti composto da due strati di cellule, uno strato interno di cellule luminali circondato da uno strato esterno di cellule mioepiteliali indicato con i confini di una membrana basale 2. Alla nascita, solo un albero duttale rudimentale è presente, composto da un condotto di rami primari e 15-20. Filiale di allungamento e iniziare amplificazione all'inizio della pubertà, circa 4 settimane, sotto l'influenza degli ormoni 3,4,5. A 10 settimane, la maggior parte dello stroma è invasa da un complesso sistema di canali che saranno sottoposti a cicli di ramificazione e di regressione di ogni ciclo estrale fino a quando la gravidanza 2. All'inizio della gravidanza, una seconda fase di sviluppo inizia, con la proliferazione e la differenziazione dell'epitelio a formare strutture a forma di uva secretoria latte chiamati alveoli 6,7. A seguito di parto e durante l'allattamento, il latte è prodotto dalle cellule secretorie luminale e conservati all'interno del lume degli alveoli. L'ossitocina rilascio, stimolato da un riflesso neurale indotta da latte di cuccioli, induce contrazioni sincronizzata delle cellule mioepiteliali intorno agli alveoli e lungo i condotti, permettendo il latte deve essere trasportato attraverso i condotti al capezzolo dove diventa disponibile per i cuccioli 8. Lo sviluppo della ghiandola mammaria, la differenziazione e la funzione sono strettamente orchestrata e richiedono, non solo le interazioni tra lo stroma e l'epitelio, ma anche tra le cellule mioepiteliali e luminale all'interno dell'epitelio 9,10,11. In tal modo, le mutazioni in molti geni implicati in queste interazioni possono compromettere sia l'allungamento duttale durante la pubertà o la formazione di alveoli durante la gravidanza iniziale, differenziazione durante la gravidanza e l'attivazione secretoria porta alla lattazione 12,13. In questo articolo viene descritto come analizzare ghiandole mammarie del mouse e valutare il loro sviluppo utilizzando supporti interi. Abbiamo anche dimostrare come valutare le contrazioni mioepiteliali e l'espulsione del latte con un ex-vivo a base di ossitocina test funzionali. L'effetto di una mutazione del gene per lo sviluppo della ghiandola mammaria e la funzione può quindi essere determinata in situ con l'esecuzione di queste due tecniche di controllo nei topi mutanti e wild-type.
Protocol
1. Dissezione della ghiandola mammaria
- Euthanize il mouse utilizzando CO 2 inalazione. Evitare dislocazione cervicale, se possibile, in quanto può danneggiare i vasi sanguigni del collo e provocare l'accumulo di sangue intorno ghiandole mammarie, rendendo più difficile la dissezione. Tuttavia, se gli altri criteri sono da valutare nel topo lo stesso, quali i livelli di ossitocina nel sangue, i metodi di eutanasia alternativa può essere necessario, anche se ciò deve essere valutato dal IACUC.
- Su un polistirene espanso avvolto in un foglio, posizionare il mouse sul dorso e diffuse ai quattro arti. Pin con fermezza tutti e quattro gli arti con 16-20 aghi calibro (Figura 1A).
- Spruzzare generosamente il mouse con il 70% di etanolo.
- Utilizzando pinze, tirare la pelle addominale sulla linea mediana e fare una piccola incisione con forbici affilate.
- A partire dall'incisione, tagliare la pelle fino al collo dell'animale, evitando pungere la cavità addominale e toracica (Figura 1B).
- Tagliare la pelle sulle zampe anteriori per l'incisione sulla linea mediana, con conseguente "forma Y" (Figura 1B). Tagliare la pelle sugli arti posteriori allo stesso modo (Figura 1B).
- Utilizzando pinze emostatiche, buccia delicatamente la pelle addominale e toracica al lato del mouse. Se necessario, tagliare delicatamente tessuto connettivo.
- Fissare la pelle al polistirolo espanso con 16-20 aghi calibro, esponendo le ghiandole mammarie attaccato alla parte inferiore della pelle. Procedere e completare un lato alla volta (Figura 1C).
- Con le pinzette e sollevare delicatamente la ghiandola mammaria di interesse e tagliare tra la ghiandola e la pelle con piccole forbici affilate, a partire dall'esterno verso la colonna vertebrale dell'animale. Assicurati di tagliare con attenzione, quindi non pezzi di pelle o dei muscoli rimangono sulla ghiandola. Tutte le ghiandole mammarie (Figura 1) può essere rimosso utilizzando questo protocollo, ma addominale ghiandole mammarie (# 4) sono i migliori per il montaggio intero. Il 2 ° e 3 ° ghiandole sono alcuni muscoli interdigitati e mentre possono essere usati per montare tutto e istologia, potrebbero non essere appropriati per tutte le analisi.
2. Intero monte
- Almeno un giorno prima della dissezione, preparare una soluzione di allume carminio sciogliendo 1 g di carminio e di 2.5g di solfato di alluminio, potassio in 500 ml di acqua distillata e fate bollire per 20 minuti in un pallone di Erlenmeyer 1 litro. Regolare il volume finale a 500 ml con acqua. Filtrare attraverso carta Whatman e aggiungere una piccola quantità di timolo (alcuni grani) come conservante. Conservare in frigorifero. Dopo la colorazione, la soluzione di allume carminio può essere versato di nuovo alla bottiglia fotografici e riutilizzato più volte nell'arco di diverse settimane. Fare una soluzione fresca quando il colore diventa debole.
- Dopo ablazione della ghiandola mammaria dal mouse (fase 1), si è diffuso direttamente su un vetrino. Cercare di appiattire il più possibile, mantenendo la forma originale in situ. La ghiandola che si attacchi sul vetrino bene se correttamente allungati.
- Fissare la ghiandola immergendolo, sul vetrino, in fissativo Carnoy (100% EtOH, cloroformio, acido acetico glaciale; 06:03:01) per 4 ore in cappa a temperatura ambiente in un barattolo. Da notare che altri ricercatori hanno utilizzato due ore che sembra essere sufficiente. In alternativa, le ghiandole possono anche essere fissato a 4 ° C durante la notte.
- Lavare in etanolo al 70% per 15 min. Poi, a poco a poco reidratare in acqua, eliminando metà della soluzione di etanolo dal vaso e la sua sostituzione con DDH 2 O. Incubare per 5 min. Ripetere 3 volte. In alternativa, utilizzare il 70% - 35% - 15% - bagni di etanolo e acqua per 5 minuti ciascuno.
- Sciacquare con acqua distillata per 5 minuti.
- Colorare con allume carminio notte a temperatura ambiente. Va notato che la colorazione potrebbe richiedere più tempo a seconda dello spessore della ghiandola.
- Rimuovere allume carminio macchia di riutilizzare e gradualmente disidratano i tessuti colorati con bagni di etanolo seriale (50%, 70%, 95%, 100%) per 5 minuti ciascuno e chiaro in xilene, o in un non-tossico alternative come Histo-chiaro, durante la notte. Sia la disidratazione e di compensazione, potrebbero richiedere più incubazione con i campioni più spessi.
- Immergere ghiandola mammaria in salicilato di metile. Ghiandole mammarie possono essere tenuti in salicilato di metile in una cappa aspirante fino a quando le immagini sono pronte per essere adottate.
- Le immagini possono essere prese in una cappa con una normale fotocamera digitale posizionata su un treppiede (utilizzare la funzione "macro" se disponibile), ponendo i vetrini su un tavolo luminoso. Utilizzare un microscopio da dissezione per una maggiore ingrandimento. In alternativa, ghiandole mammarie possono essere montati in supporti come Permount (dopo il punto 2.7) che consente per le immagini da prendere all'esterno di una cappa su qualsiasi piattaforma di imaging che fornisce i supporti sono sufficientemente sottili.
- Al fine di quantificare lo sviluppo della ghiandola mammaria utilizzando montare tutto, misure come il numero di ramificazioni (o rami collaterali) lungo porzioni dei condotti, la lunghezza dei condotti primari, o un rapporto di epiteliali di superficie del tessuto adiposo può essere valutato. Infine, dopo documentazione fotograficazione, montare tutta la ghiandola mammaria possono essere inclusi in paraffina per sezionamento e tradizionale colorazione istologica.
3. Indotte da ossitocina latte espulsione
- Separare i cuccioli dalla madre solo dopo che sono stati nutriti. Attendere 1 ora prima di eseguire il test.
- Il sacrificio della madre ed esporre le ghiandole mammarie, come descritto prima (passi 1,1-1,8), senza rimuoverli dall'animale.
- Iniziare l'analisi di cadere in modo uniforme sia PBS o la soluzione di ossitocina direttamente sulla ghiandola mammaria di interesse, utilizzando una pipetta di trasferimento. Un ampio spettro di dosi può essere utilizzato; ~ 8 pg / ml (dose fisiologica) viene utilizzato in genere. Tuttavia, l'alta non fisiologica dosi (fino a 1 mg / ml) può essere utilizzato per garantire l'assenza di risposta in modelli di topo geneticamente modificati. Per questa procedura, si consiglia di utilizzare toracica (# 2-3) ghiandole, utilizzando un lato come un controllo (esposto a PBS) e l'altro lato per testare emissione del latte (esposizione ossitocina).
- Incubare per 1 minuto e rimuovere la soluzione con attenzione lo aspirazione con una pipetta di trasferimento. Ingresso latte nei dotti può essere monitorato da registrazione video su nastro, o prendendo le immagini prima e dopo l'esposizione PBS o ossitocina.
4. Rappresentante dei risultati:
In un montaggio buon complesso, la ghiandola mammaria è ben diffuso e condotti epitelio sono facilmente osservabili (Figura 2A). Se la ghiandola non è ben diffusa, può sollevare in parte o totalmente dalla diapositiva, quando sono immessi nella soluzione di fissativo. La ghiandola sarà quindi difficile e inutilizzabile (Figura 2B). Allo stesso modo, se la ghiandola non è ben sezionato, sia una parte dell'epitelio può mancare (Figura 2C) o ancora parti della pelle o dei muscoli addominali interferirà con l'analisi della ghiandola (Figura 2D).
Per l'analisi ossitocina, è importante separare i cuccioli da latte dalla diga per la stessa quantità di tempo in ogni occasione. In questo modo, si farà in modo che nessun latte o piccole quantità di latte è presente nei condotti prima dell'esposizione ossitocina, ma anche che il latte a sufficienza è presente negli alveoli che possono essere espulso nei dotti da contrazioni mioepiteliali (Figura 3A) . Se i cuccioli vengono rimosse troppo presto, il latte può accumularsi negli alveoli e dei dotti rendere l'effetto di difficile ossitocina per monitor (Figura 3B). In alternativa, se l'esperimento viene effettuato troppo presto dopo la rimozione del cucciolo, il latte non avrà il tempo di accumulare negli alveoli e indotte da ossitocina le contrazioni delle cellule mioepiteliali non innescare rilascio abbastanza latte nei dotti da osservare (Figura 3C).
Figura 1. Dissezione della ghiandola mammaria mouse. Pin con il mouse sul dorso dai quattro arti (A). Tagliare la prima pelle dalla pancia al collo. Poi fare incisioni perpendicolare dal centro del ventre per ogni arto, come mostrato dalla linea tratteggiata (B). Buccia delicatamente la pelle sul lato dell'animale e lo spillo, esponendo le ghiandole mammarie (C).
Figura 2. Mouse ghiandola mammaria monte tutto. Condotti epitelio (frecce) e il linfonodo (punta di freccia) sono facilmente osservabili in un montaggio ben diffuso della ghiandola mammaria intera ghiandola # 4 (A). Una ghiandola mammaria scarsamente diffuse possono staccarsi dalla diapositiva e crollò, rendendolo inutilizzabile (B). Una ghiandola mammaria impropriamente asportato possono avere parti mancanti (C) o pezzi di muscolo o della pelle residua (D). Si noti che il 2 ° e 3 ° ghiandole hanno interdigitati muscolare, ma può ancora essere utilizzato per intero il montaggio o istologia.
Figura 3. Indotte da ossitocina emissione del latte può essere osservato nei condotti epitelio (frecce) a seguito di esposizione ossitocina (A). Tuttavia, se condotti sono già pieni di latte (frecce) all'inizio del test a causa di un lungo periodo di latenza impropriamente dopo l'ultima allattamento dei cuccioli, un ulteriore accumulo di latte nei dotti (frecce) dopo l'esposizione ossitocina è difficile da osservare (B). In alternativa, un periodo di latenza breve dopo allattamento cucciolo non consentirà l'accumulo sufficiente di latte negli alveoli di essere adeguatamente osservati nei condotti (frecce) dopo l'esposizione ossitocina (C). Le immagini sono state scattate prima e dopo l'esposizione ossitocina usando una macchina fotografica numerica (Cybershot, Sony).
Figura 4. Rappresentazione schematica del tutto saggi trattamento di montaggio e l'ossitocina.
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Discussion
Sviluppo della ghiandola mammaria e la funzione sono strettamente orchestrata. Topi mutanti possono ospitare le mutazioni del gene che può alterare lo sviluppo della ghiandola mammaria e la funzione evidenziando la necessità di valutare l'architettura della ghiandola 13,12. Montaggio intero può essere eseguita come descritto in questo articolo in tutte le fasi di sviluppo della ghiandola mammaria. Tipicamente, lo sviluppo del epitelio è valutata all'inizio della pubertà (~ 4 settimane), nel bel mezzo della pubertà (~ 6 settimane) e dopo la pubertà (~ 10-12 settimane di età) 2,10. A queste fasi, la quantità di ramificazioni condotto, il numero di gemme fine terminali e la lunghezza dei condotti può essere determinato al fine di quantificare il grado di sviluppo della ghiandola 14,15. Allo stesso modo, alveologenesis (sviluppo degli alveoli durante la gravidanza) è di solito determinata a 2-3 punti durante la gravidanza, i cambiamenti strutturali che si verificano durante l'allattamento e involuzione può anche essere osservato e quantificato in preparati tutto ghiandola montare 16. Tuttavia, la quantificazione dei monti tutto da fine femmine di topo gravide e in allattamento può essere difficile a causa della densità del tessuto. Si raccomanda di combinare montare tutto con analisi istologiche, soprattutto per chi fasi 12. Per informazioni più dettagliate valutazione istologica, ghiandole mammarie può essere rimosso utilizzando lo stesso protocollo notato in questo rapporto, fissato in formalina e sottoposti a colorazione ematossilina e eosina. Montare tutto può essere anche paraffina e utilizzati per l'imaging istologia una volta è stata eseguita. Per entrambe le tecniche, dissezione corretto e delicato delle ghiandole mammarie è fondamentale. Se i topi mutanti sono in corso di valutazione, è importante confrontare questi topi ai topi di controllo più vicino possibile, dal momento che diversi ceppi di topi può mostrare variabile collaterali o terziario-ramificazioni, o alveologenesis 17. Per esempio, rispetto a topi BALB / c, topi C57BL / 6 ridotto presentano ramificazioni laterali e alveologenesis 17,18. Pertanto, topi BALB / c non deve essere utilizzato come controllo per i topi geneticamente modificati generato su un fondo C57BL / 6 del mouse. Durante il montaggio tutto permette di comprendere lordo difetti di sviluppo, la funzione della ghiandola mammaria può anche avere bisogno di essere valutata utilizzando altre tecniche complementari.
La funzione principale della ghiandola mammaria è quello di produrre e distribuire latte per cuccioli. Questi processi richiedono non solo corretta differenziazione delle cellule secretorie luminale durante la gravidanza, ma anche coordinare le contrazioni ed efficiente delle cellule mioepiteliali intorno agli alveoli e lungo i condotti per il trasporto del latte 8. Mentre la produzione di latte e di qualità può essere valutata mediante la valutazione analitica della composizione del latte 12, tra gli altri, le cause di consegna del latte alterato per i cuccioli è più difficile da valutare. Infatti, l'assenza di latte osservato nello stomaco dei cuccioli appena nati può essere collegato a molti difetti, come la produzione di latte alterato, l'incapacità dei cuccioli di succhiare, difetti comportamentali della madre o difetti di emissione del latte. Un modo di valutare il trasporto del latte e difetti espulsione dagli alveoli nei dotti è di indurre le contrazioni mioepiteliali con l'ossitocina, come descritto in questo articolo. Tuttavia, la quantificazione del trasporto del latte e l'espulsione è difficile poiché l'effetto dell'ossitocina ex vivo è rapida (di solito il latte può essere osservato nei condotti entro 1 minuto dopo l'esposizione), anche quando si utilizzano basse dosi fisiologiche di ossitocina 10. Così, una leggera differenza in termini di efficienza di emissione del latte tra le due linee del mouse potrebbero non essere osservabile con questa tecnica. Quantificare questa risposta è difficile, ma una semi-quantitativa modo di valutare indotte da ossitocina emissione del latte è quello di esaminare la risposta in una serie di dosaggi e per determinare il tempo di trattamento necessario compilare condotti con il latte. . In tutti i casi, la consistenza del periodo di attesa tra il cucciolo ultima latte per l'inizio del test è fondamentale. Per una quantificazione più precisa di allattamento o l'identificazione di un difetto di emissione del latte, questo metodo può essere integrata dalla quantificazione delle proteine del latte e di vie di segnalazione, come il β-caseina e Stat5, rispettivamente, o nella contrazione in vitro delle cellule mioepiteliali a seguito di esposizione ossitocina 19 .
In sintesi, modelli di topi transgenici sono importanti e ampiamente utilizzati per studiare la funzione della ghiandola mammaria e di sviluppo, e di valutare il ruolo dei geni chiave in questi processi. L'architettura dell'epitelio della ghiandola mammaria può essere facilmente osservata in ghiandole correttamente asportate utilizzando montare tutto in tutte le fasi dello sviluppo. Mentre difetti allattamento porta a malnutrizione cuccioli può avere molteplici origini, una carenza di emissione del latte può essere valutata indotte da ossitocina contrazione sincronizzata di cellule mioepiteliali in situ. Insieme, queste due tecniche (Figura 4) possono dare importanti informazioni sugli effetti di specifiche mutazioni del genezioni o cancellazioni sullo sviluppo della ghiandola mammaria e la funzione.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Questi studi sono stati finanziati dalla CIHR e sovvenzioni per CBCRA DWL. IP è stato finanziato da borse di studio da CIHR-STP, FRSQ e CIHR. MKGS è stato finanziato da borse di studio e OGS CIHR-STP. Gli autori ringraziano Kevin Barr per la sua assistenza con l'allevamento del mouse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Carmine | Sigma-Aldrich | C1022 | |
| Aluminum potassium sulfate | Sigma-Aldrich | A6435 | |
| Thymol | Sigma-Aldrich | T0501 | |
| Methyl salicylate | Sigma-Aldrich | M6752 | |
| Oxytocin | Sigma-Aldrich | O3251 |
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