Summary
AD的病理特征之一，是淀粉样β蛋白阳性神经炎斑的形成。在这个协议中，我们介绍两种方法来检测转基因AD模型小鼠神经炎斑：免疫组织化学检测使用美国广播公司（ABC）和DAB法和荧光检测使用thioflavin S染色方法。
Abstract
阿尔茨海默氏病（AD）是最常见的神经退行性疾病，导致老年痴呆症。神经炎斑块的形成是阿尔茨海默氏症的病理特点之一。神经炎斑的核心组成部分，是一个小的丝状蛋白质称为淀粉样β蛋白（Aβ）1，这是从连续的β-淀粉样蛋白前体蛋白（APP）的β-分泌和γ-分泌蛋白水解裂解所得。淀粉样蛋白假说，需要在AD 病理学 2的毒性机制作为基础，Aγ含斑块。事后分析神经炎斑块的存在，证实了AD的诊断。为了进一步Aγ神经生物学的认识，在AD的发病机制，不同的小鼠品系，在人类的APP基因表达AD相关的基因突变产生。根据疾病的严重程度，这些老鼠在不同的年龄发展神经炎斑。这些老鼠作为研究的发病机制及药物开发，可能会影响应用程序的处理途径和神经炎斑块的形成的宝贵工具。在这个协议中，我们采用免疫组织化学方法对AD模型小鼠神经炎斑的具体检测。我们将特别讨论中提取的半脑，多聚甲醛固定，cryosectioning，以及两种方法来检测神经质的斑块在AD转基因小鼠的制备方法：使用美国广播公司（ABC）和DAB法和荧光检测使用thiofalvin S染色方法免疫组化检测。
Protocol
1。老鼠大脑中的固定和cryosectioning
- 使用二氧化碳气体，斩首和大脑中提取的转基因小鼠牺牲。
- 大脑是纵向中心解剖。大脑的一半将用于生化分析的干冰冰冻闪光。其他的将被淹没在4％多聚甲醛（PFA）至少48小时在4 ° C。
- 后至少48小时在4％PFA固定，半脑是直接传送到30％的蔗糖溶液，置于4 ° C。在点，半脑应漂浮在蔗糖溶液。当半脑沉到了谷底，通常需要大约48小时，它准备在OCT包埋cryosectioning。
- cryosectioning之前，安装在旋钮华侨城的一个薄薄的一层，并允许在-20 ° C冻结小脑上一层冰冻华侨城删除从半侧大脑和地方休息。立即盖华侨城半侧大脑，让慢慢冻结在-20 ° C。一旦华侨城嵌入大脑已经变成了不透明的，它是准备切片。
- 设置每节30微米的厚度。 D' Olomos解决方案的容器收集到每个切片。
2。免疫组织化学过程神经炎斑（自由浮动部分）
- 对待每节15分钟，在88％甲酸。甲酸处理后，将暂时关闭部分不透明，并且可能会出现萎缩。
- 取出到一个盘子和凭借TX - PBS（0.3％的Triton X - 100的PBS）洗5分钟× 3，轻轻摇动中的每个部分。
- 阻断内源性过氧化物阻断0.5％H 2 O 2在Tx - PBS中，RT，轻轻摇动30分钟。
- 洗10分钟× 3节的Tx - PBS，轻轻摇动。
- 块段与非脂肪5％脱脂牛奶的Tx - PBS在室温下溶解，轻轻摇动1小时。
- 孵育部分初级抗体（生物素4G8，1:500-1:2000，徽记）的Tx - PBS在4 5％的牛奶含有稀释° C轻轻摇动过夜。
- 洗10分钟× 3节的Tx - PBS，轻轻摇动。
- 准备ABC的解决方案制造商的协议（精英实验室，美国广播公司（ABC），矢量）。在ABC混合物孵育30分钟，轻轻摇动部分。
- 洗10分钟× 3节的Tx - PBS，轻轻摇动。
- 准备3,3' - 二氨基tetrahydrochloride（民建联）（矢量实验室）以下制造商的协议。在民建联的混合物为5-10分钟孵育部分。在这一点上，你会发现一个棕褐色的每一节。
- 洗10分钟× 3节的Tx - PBS，轻轻摇动。
- 明胶涂层片安装在自由浮动的脑切片，以帮助组织粘连。部分，然后通过一系列二甲苯结算和风干之后安装在Entellen。
- 斑块40X放大倍率的光学显微镜下观察，并通过量化评估每个鼠标的计数每片平均斑块。
3。 Thioflavin S染色神经炎斑块的检测程序
- 鼠标牺牲和脑提取过程是在第1.1至1.5表示。
- 山半到4至5玻片脑切片和允许完全风干染色前。
- 用70％乙醇1分钟的幻灯片。
- 用80％乙醇1分钟的幻灯片。
- 过滤（0.2微米的过滤器）thioflavin小号溶液（1％）80％的乙醇中孵育15分钟的幻灯片。 （Thioflavin s解决方案需要在每次使用前过滤）。注：保护光thioflavin S和避光染色的幻灯片。
- 用80％乙醇1分钟的幻灯片。
- 用70％乙醇1分钟的幻灯片。
- 用蒸馏水洗两次。
- 山在水溶液中的安装媒体，并允许幻灯片干燥至少2小时，用透明指甲油密封盖玻片，在黑暗中的幻灯片。染色切片，应存放在黑暗中，在4 ° C。
- 绿色荧光染色斑块可与荧光microscropy可视化。分析一个星期内的幻灯片，因为随着时间的推移会褪色染色。
4。代表性的成果
在我们最近的抗癫痫药物的疗效和情绪稳定剂丙戊酸（VPA），以抑制神经炎斑块的形成研究中，我们使用上面介绍的免疫和thioflavin S染色程序，以确定在AD模型小鼠（3）神经炎斑。图1展示了一个典型的9个月大的APP23转基因小鼠，通过与抗生物素化的Aβ使用4G8和染色ABC法检测。神经炎斑是清楚的标记抗体，是由白色箭头表示。使用thioflavin S染色，我们发现2个月大的APP23xPS TRA神经炎斑块沉积nsgenic小鼠（图2）。 Thioflavin小号约束Aβ含神经炎斑出现绿色荧光显微镜下（白色箭头表示）。我们发现，丙戊酸钠治疗，神经炎斑块的形成明显减少（3）。在另一项研究中，我们研究的分子联系，底层缺氧和AD的发病机制。同样，使用都4G8抗Aβ的免疫组织化学染色和thioflavin S染色，我们发现，缺氧，促进形成含有神经炎斑的Aβ（4）。
图1。神经炎斑块的形成在AD转基因小鼠的免疫组织化学分析。APP23在9个月的年龄处死，并进行了解剖，固定和切片。在海马神经炎斑检测使用一种抗Aβ抗体4G8和使用ABC和DAB方法进行开发。 40X光镜与斑块。白色箭头指向的Aβ神经炎斑。
图2。 Thioflavin S染色在公元建模小鼠神经炎斑。APP23xPS45双转基因小鼠，8周龄处死，并进行了解剖，固定，并切片。在海马神经炎瘟疫被证实使用thioflavin小号荧光染色，在显微镜下可视化40X放大倍率。白色箭头指示thioflavin小号染色神经炎斑。
Discussion
采用免疫组织化学和素标记的4G8抗体污渍在公元神经炎斑为蓝本小鼠特异性。染色的结果，允许不同治疗组之间的斑块负荷的量化和比较。有几个关键步骤，可能会影响结果的。由于半侧大脑灌注前从头骨提取，应在提取过程中使用，以防止损害的半脑。此外，由于半脑是被动灌注，我们建议孵育至少48小时在4％煤灰4 ° C之前，淹没在30％的蔗糖溶液。另外，transcardial灌注可之前完成提取大脑。如果是固定的大脑，它应该有一个橡胶质地。大脑是不固定的正确的情况下，部分会很容易撕裂德Olomos解决方案或在染色程序。
4G8单克隆抗体反应的氨基酸残基的Aβ17-24和公认的核心序列（VFFAE）的抗原表位。由于4G8是从鼠种的，它往往给予了较高的背景染色。因此，我们选择了孵化表示稀释的部分，考虑到实现一个真正的信号，同时最大限度地减少背景染色。
此外免疫神经炎斑使用4G8抗体的检测，一个thioflavin S染色方法也可以用来识别斑块。 Thioflavin S是一个同质的染料混合物，从dehydrothiotoluidine甲基磺酸的结果。 Thioflavin非选择性结合蛋白质测试表的内容，如淀粉样蛋白的低聚物的。 thioflavin结合后，经历了它的发射光谱特性的蓝移。相反thioflavin小号单体形式结合不会引起蓝移，不能用荧光显微镜检测。 Thioflavin S染色提供了一个屏幕淀粉样蛋白的快速荧光强度允许少量的淀粉样蛋白沉积的良好的可视化。然而，关于thioflavin S染色的缺点是缺乏特异性。许多其他的组织成分，包括fibrinoids，透明，角蛋白，等，如含有丰富的测试版张，而对于这种染料亲和力。
Disclosures
所有实验均在与不列颠哥伦比亚省的动物护理和使用委员会和CIHR指引大学的规定进行。
Acknowledgments
这项工作是由加拿大卫生研究院研究院（CIHR），汤森家庭，和杰克布朗和家庭阿尔茨海默氏症研究基金会（到WAS）的支持。 WAS是加拿大研究主席在阿尔茨海默氏病的人。 PTTL是由自然科学和工程研究的律师和迈克尔史密斯健康研究基金会奖学金的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148-1KG | |
| Polyvinylpyrrolidene | Sigma-Aldrich | PVP40-100G | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-3 | |
| Ethylene glycol | Sigma-Aldrich | 324558-2L | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| 88% formic acid | Fisher Scientific | A118P-500 | |
| Triton X-100 | ICN Biomedicals | 807426 | |
| H2O2 | Sigma-Aldrich | H-1009 | |
| Biotin Labeled 4G8 Antibody | Cedarlane Labs | SIG-39240-500 | |
| Elite ABC kit | Vector Laboratories | PK-6100 | |
| Imm PACT DAB | Vector Laboratories | SK-4105 | |
| Xylene | Fisher Scientific | X4-4 | |
| Entellan | Electron Microscopy Sciences | 65037-71 | |
| Superfrost* Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Cryostat | Leica Microsystems | CM-3050-S | |
| MX35 Premier microtome blade | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 3052835 | |
| Thioflavin S | Sigma-Aldrich | T1892-25G |
References
- Glenner, G. G., Wong, C. W. Alzheimer's disease: initial report of the purification and characterization of a novel cerebrovascular amyloid protein. Biochem Biophys Res Commun. 120, 885-890 (1984).
- Hardy, J., Selkoe, D. J. The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease: progress and problems on the road to therapeutics. Science. 297, 353-356 (2002).
- Qing, H., He, G., Ly, P. T., Fox, C. J., Staufenbiel, M., Cai, F., Zhang, Z., Wei, S., Sun, X., Chen, C. H., Zhou, W., Wang, K., Song, W. Valproic acid inhibits Abeta production, neuritic plaque formation, and behavioral deficits in Alzheimer's disease mouse models. J Exp Med. 205, 2781-2789 (2008).
- Sun, X., He, G., Qing, H., Zhou, W., Dobie, F., Cai, F., Staufenbiel, M., Huang, L. E., Song, W. Hypoxia facilitates Alzheimer's disease pathogenesis by up-regulating BACE1 gene expression. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 18727-18732 (2006).
