Summary
Einer der pathologischen Merkmale von AD ist die Bildung von Amyloid β Protein positive neuritischen Plaques. In diesem Protokoll beschreiben wir zwei Methoden, um neuritischen Plaques in transgenen AD-Modell-Mäusen zu erkennen: immunhistochemischen Nachweis über die ABC-und DAB-Methode und Fluoreszenzdetektion mit Thioflavin S-Färbung.
Abstract
Alzheimer-Krankheit (AD) ist die häufigste neurodegenerative Erkrankung, die zu Demenz. Neuritischen Plaquebildung ist einer der pathologischen Kennzeichen der Alzheimer-Krankheit. Die zentrale Komponente des neuritischen Plaques ist ein kleiner faserigen Protein namens Amyloid β Protein (Aß) 1, die aus der sequenziellen proteolytische Spaltung des beta-Amyloid-Vorläuferprotein (APP) durch β-Sekretase und γ-Sekretase abgeleitet ist. Die Amyloid-Hypothese zur Folge, dass Aγ-haltigen Plaques als die zugrunde liegende toxische Mechanismus in AD-Pathologie 2. Die Obduktion Analyse der Präsenz von neuritischen Plaques bestätigt die Diagnose von AD. Um unser Verständnis von Aγ Neurobiologie in AD Pathogenese wurden verschiedene Maus-Stämme, die AD-bezogenen Mutationen im menschlichen APP-Gene erzeugt. Je nach Schwere der Erkrankung, werden diese Mäuse neuritischen Plaques in den verschiedenen Altersstufen zu entwickeln. Diese Mäuse dienen als unschätzbare Werkzeuge für das Studium der Pathogenese und Entwicklung von Medikamenten, die die APP-Prozessierung Weg und neuritischen Plaquebildung beeinflussen könnten. In diesem Protokoll, beschäftigen wir eine immunhistochemische Methode zum spezifischen Nachweis von neuritischen Plaques in AD-Modell-Mäusen. Wir werden insbesondere über die Vorbereitung von der Gewinnung der Hälfte des Gehirns, Paraformaldehyd Fixierung Kryoschneiden und zwei Methoden zur neurotischen Plaques in AD transgenen Mäusen zu erkennen: immunhistochemischen Nachweis über die ABC-und DAB-Methode und Fluoreszenzdetektion mit thiofalvin S-Färbung.
Protocol
1. Fixation der Maus Gehirne und Kryoschneiden
- Transgene Mäuse werden getötet mit Kohlendioxid-Gas, durch Enthauptung und das Gehirn entnommen gefolgt.
- Das Gehirn ist in Längsrichtung in der Mitte durchtrennt. Die Hälfte des Gehirns zu blinken auf Trockeneis für die biochemische Analyse eingefroren werden. Der andere wird in 4% Paraformaldehyd (PFA) für mindestens 48 Stunden bei 4 ° C getaucht
- Nach der Fixierung in 4% PFA für mindestens 48 Stunden wird die hemi Gehirn direkt in 30% Saccharose-Lösung überführt und bei 4 ° C. An dem Punkt, sollte die hemi Gehirn in der Saccharose-Lösung zu schweben. Wenn die hemi Gehirn auf den Grund sank, in der Regel erfordert etwa 48 Stunden ist es bereit, in OCT für Kryoschneiden eingebettet werden.
- Vor Kryoschneiden, montieren Sie eine dünne Schicht der OCT auf den Knopf und lassen Sie sie bei -20 ° C einfrieren Entfernen Sie das Kleinhirn aus dem Rest der hemi Gehirn und Ort auf die Schicht aus gefrorenem Oktober Unmittelbar decken die hemi Gehirn mit OCT und lassen Sie sie langsam bei -20 ° C einfrieren Sobald der OCT Einbettung des Gehirns hat sich deckend, ist es bereit zu sein geschnitten.
- Stellen Sie die Stärke eines jeden Abschnitts bis 30 um. Sammeln Sie jede Scheibe in einen Behälter mit D'Olomos Lösung.
2. Immunhistochemie Verfahren für neuritischen Plaques (frei schwebenden Abschnitte)
- Behandle jeden Abschnitt in 88% iger Ameisensäure für 15 Minuten. Nach Ameisensäure Behandlung wird der Abschnitt vorübergehend auszuschalten undurchsichtig und erscheinen zu schrumpfen.
- Nehmen Sie jedes Teil in einen Teller geben und gründlich mit Tx-PBS (0,3% Triton X-100 in PBS) für 5 min X 3 unter leichtem Schütteln.
- Block Endogene Peroxid blockieren 0,5% H 2 O 2 in Tx-PBS, RT 30 min unter leichtem Schütteln.
- Wash Abschnitt mit Tx-PBS für 10 min X 3 unter leichtem Schütteln.
- Block Abschnitt mit 5% fettfreier Magermilch in Tx-PBS bei Raumtemperatur gelöst für 1 Stunde unter leichtem Schütteln.
- Inkubieren Abschnitte in primärer Antikörper (biotinylierter 4G8, 1:500-1:2000, Signet) in Tx-PBS mit 5% Milch bei 4 ° C über Nacht verdünnt unter leichtem Schütteln.
- Wash Abschnitt mit Tx-PBS für 10 min X 3 unter leichtem Schütteln.
- Bereiten Sie ABC-Lösung folgende Protokoll des Herstellers (Elite ABC, Vector Laboratories,). Inkubieren Abschnitte in ABC-Gemisch für 30 min unter leichtem Schütteln.
- Wash Abschnitt mit Tx-PBS für 10 min X 3 unter leichtem Schütteln.
- Bereiten 3,3 '-Diaminobenzidintetrahydrochlorid (DAB) (Vector Laboratories) nach Protokoll des Herstellers. Inkubieren Abschnitte in DAB-Gemisch für 5-10 min. An dieser Stelle werden Sie feststellen, eine bräunliche Farbe auf jedem Abschnitt zu entwickeln.
- Wash Abschnitt mit Tx-PBS für 10 min X 3 unter leichtem Schütteln.
- Free-Floating-Hirn-Abschnitte werden auf Gelatine beschichtete Objektträger aufgebracht, mit Gewebeadhäsion helfen. Die Schnitte werden dann an der Luft, indem Sie mit einer Reihe von Xylol getrocknet gefolgt und montiert in Entellen.
- Plaques sind visualisiert unter Lichtmikroskopie bei 40-facher Vergrößerung und werden von der Beurteilung der mittleren Plaque-Zahl pro Stück für jede Maus quantifiziert.
3. Thioflavin S Färbung zum Nachweis von neuritischen Plaques
- Maus zu opfern und das Gehirn Extraktionsverfahren sind in Abschnitte von 1,1 bis 1,5 angegeben.
- Montieren Sie 4 bis 5 hemi Hirnschnitten auf einen Objektträger aus Glas und lassen Sie sie vollständig trocknen vor dem Färben.
- Waschen Sie die Objektträger mit 70% Ethanol für 1 Minute.
- Waschen Sie die Objektträger mit 80% Ethanol für 1 Minute.
- Inkubieren in filtriert (0,2 &mgr; m-Filter) Thioflavin S-Lösung (1% in 80% Ethanol) für 15 Minuten. (Thioflavin S-Lösung muss vor jedem Gebrauch gefiltert werden). Hinweis: Schutz Thioflavin S von Licht und schützen gefärbten Folien aus Licht.
- Waschen Sie die Objektträger mit 80% Ethanol für 1 Minute.
- Waschen Sie die Objektträger mit 70% Ethanol 1 Minute.
- Waschen mit destilliertem Wasser zweimal.
- Berg rutscht in wässrigen Medien und Montage ermöglichen Dias im Dunkeln für mindestens 2 Stunden, durch Abdichten Deckglas mit klarem Nagellack gefolgt trocken. Stained Abschnitte sollten im Dunkeln bei 4 ° C gelagert werden
- Die grüne Fluoreszenz gefärbten Plaques konnte visualisiert werden mit fluoreszierenden microscropy. Analysieren gleitet innerhalb einer Woche, weil die Färbung mit der Zeit verblassen wird.
4. Repräsentative Ergebnisse
In unserer jüngsten Studie über die Wirksamkeit des anti-epileptischen Medikamenten und Stimmungsstabilisator Valproinsäure (VPA), um neuritischen Plaquebildung hemmen, verwendeten wir die oben beschriebenen Immunfärbung und Thioflavin S Färbeverfahren zu neuritischen Plaques in AD-Modell-Mäusen (3) zu identifizieren. Abbildung 1 stellt eine typische 9 Monate alten APP23 transgene Maus, mit Anti-Aß mit biotinylierten 4G8 angefärbt und mittels der ABC-Methode. Neuritischen Plaques sind deutlich mit dem Antikörper markiert und werden durch die weißen Pfeile angedeutet. Mit Thioflavin S-Färbung, entdeckten wir neuritischen Plaqueablagerung 2 Monate alt APP23xPS transgenic Mäusen (Abbildung 2). Thioflavin S gebunden Aß-haltigen neuritischen Plaques erscheint unter Fluoreszenz-Mikroskopie (angezeigt durch weiße Pfeile) grün. Wir zeigten, dass mit VPA behandelt, neuritischen Plaquebildung deutlich reduziert wird (3). In einer anderen Studie untersuchten wir die molekulare Verbindung zugrunde liegenden Hypoxie und AD Pathogenese. Wieder mit beiden 4G8 anti-Aß Immunhistochemie-Färbung und Thioflavin S-Färbung, fanden wir, dass Hypoxie erleichtert die Bildung von Aß mit neuritischen Plaques (4).
Abbildung 1. Immunhistochemische Analyse der neuritischen Plaquebildung in AD transgenen Mäusen. APP23 Mäuse im Alter von 9 Monaten wurden getötet und seziert, fixiert und geschnitten. Neuritischen Plaques im Hippocampus nachgewiesen wurden mit einem Anti-Aß-Antikörper 4G8 und wurden mit Hilfe der ABC-und DAB-Verfahren. Die Plaques wurden unter dem Lichtmikroskop sichtbar gemacht mit 40X. Weiße Pfeile zeigen auf Aß neuritischen Plaques.
Abbildung 2. Thioflavin S-Färbung von neuritischen Plaques in AD modelliert Mäusen. APP23xPS45 doppelt transgenen Mäusen 8 Wochen alt, wurden getötet und präpariert, fixiert und geschnitten. Neuritischen Plagen in den Hippocampus sind bestätigt wurden mit Thioflavin S Fluoreszenzfärbung und visualisiert durch Mikroskopie bei 40-facher Vergrößerung. Weiße Pfeile zeigen Thioflavin S gefärbt neuritischen Plaques.
Discussion
Immunhistochemie mit dem biotinylierten gekennzeichnet 4G8 Antikörper Flecken neuritischen Plaques in AD modelliert Mäuse mit Spezifität. Die Färbung Ergebnis ermöglicht die Quantifizierung und Vergleich der Plaque-Last zwischen den verschiedenen Behandlungsgruppen. Es gibt mehrere wichtige Schritte, die das Ergebnis beeinflussen könnten. Da die hemi Gehirne nicht vor der Extraktion aus dem Schädel perfundiert, sollte darauf bei der Extraktion verwendet werden, um Schäden an der hemi Gehirn zu verhindern. Da darüber hinaus die hemi Gehirn passiv durchströmt wird, empfehlen wir Inkubation in 4% PFA für mindestens 48 Stunden bei 4 ° C vor dem in der 30% Saccharose-Lösung eingetaucht. Alternativ könnte transcardial Perfusion vor der Extraktion des Gehirns durchgeführt werden. Wenn das Gehirn richtig befestigt ist, sollte es eine gummiartige Konsistenz. In dem Fall, dass das Gehirn noch nicht behoben ist richtig, werden die Abschnitte leicht in die D'Olomos Lösung oder während der Färbeverfahren reißen.
Die 4G8 monoklonalen Antikörper reaktiv Aminosäurereste 17-24 von Aß und erkannte die Epitop in der Core-Sequenz (VFFAE). Da 4G8 aus Maus Arten abgeleitet wird, neigt sie dazu, eine höhere Hintergrundfärbung zu geben. So entschieden wir uns, um die Abschnitte zu den angegebenen Verdünnung mit Überlegungen zur Erreichung eines echten Signals bei gleichzeitiger Minimierung der Hintergrundfärbung inkubieren.
Zusätzlich zur neuritischen Plaques Detektion mit dem 4G8 Antikörper Immunfärbung ist ein Thioflavin S Färbemethode auch verwendet, um Plaques zu identifizieren. Thioflavin S ist eine homogene Mischung Farbstoff, der sich aus Methylierung von Dehydrothiotoluidin mit Sulfonsäuregruppen. Thioflavin S nicht selektiv bindet Beta-Faltblatt-Inhalte von Proteinen, wie sie in Amyloid-Oligomere. Bei der Bindung erfährt Thioflavin eine charakteristische blaue Verschiebung seines Emissionsspektrums. Umgekehrt Thioflavin S Bindung an die monomeren Formen nicht zu entlocken eine Blauverschiebung und konnte nicht mit Fluoreszenz-Mikroskop detektiert werden. Thioflavin S-Färbung ist eine schnelle Alternative zum Bildschirm für die Amyloid als die Intensität der Fluoreszenz ermöglicht eine gute Darstellung von kleinen Mengen von Amyloid-Ablagerungen. Allerdings ist ein Nachteil zu Thioflavin S-Färbung der mangelnden Spezifität. Viele andere Gewebe Komponenten, einschließlich mit umfangreichen Beta-Faltblätter, wie fibrinoids, hyaline, Keratin, etc, haben eine eher Affinität zu diesem Farbstoff.
Disclosures
Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit der University of British Columbia Animal Care und Verwenden Ausschuss und CIHR Richtlinien durchgeführt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von den Canadian Institutes of Health Research (CIHR), die Townsend Familie und Jack Brown und Familie Alzheimer Research Foundation (WAS) unterstützt. WAS ist der Inhaber des Canada Research Chair in der Alzheimer-Krankheit. PTTL wird vom kanadischen Natural Sciences and Engineering Research Counsel und Michael Smith Foundation for Health Research Scholarship unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148-1KG | |
| Polyvinylpyrrolidene | Sigma-Aldrich | PVP40-100G | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-3 | |
| Ethylene glycol | Sigma-Aldrich | 324558-2L | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| 88% formic acid | Fisher Scientific | A118P-500 | |
| Triton X-100 | ICN Biomedicals | 807426 | |
| H2O2 | Sigma-Aldrich | H-1009 | |
| Biotin Labeled 4G8 Antibody | Cedarlane Labs | SIG-39240-500 | |
| Elite ABC kit | Vector Laboratories | PK-6100 | |
| Imm PACT DAB | Vector Laboratories | SK-4105 | |
| Xylene | Fisher Scientific | X4-4 | |
| Entellan | Electron Microscopy Sciences | 65037-71 | |
| Superfrost* Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Cryostat | Leica Microsystems | CM-3050-S | |
| MX35 Premier microtome blade | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 3052835 | |
| Thioflavin S | Sigma-Aldrich | T1892-25G |
References
- Glenner, G. G., Wong, C. W. Alzheimer's disease: initial report of the purification and characterization of a novel cerebrovascular amyloid protein. Biochem Biophys Res Commun. 120, 885-890 (1984).
- Hardy, J., Selkoe, D. J. The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease: progress and problems on the road to therapeutics. Science. 297, 353-356 (2002).
- Qing, H., He, G., Ly, P. T., Fox, C. J., Staufenbiel, M., Cai, F., Zhang, Z., Wei, S., Sun, X., Chen, C. H., Zhou, W., Wang, K., Song, W. Valproic acid inhibits Abeta production, neuritic plaque formation, and behavioral deficits in Alzheimer's disease mouse models. J Exp Med. 205, 2781-2789 (2008).
- Sun, X., He, G., Qing, H., Zhou, W., Dobie, F., Cai, F., Staufenbiel, M., Huang, L. E., Song, W. Hypoxia facilitates Alzheimer's disease pathogenesis by up-regulating BACE1 gene expression. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 18727-18732 (2006).
