Summary
واحدة من الخصائص المرضية من ميلادي هو تشكيل لويحات بروتين اميلويد β التهاب الأعصاب إيجابية. في هذا البروتوكول وصفنا طريقتين للكشف عن التهاب الأعصاب لويحات في الفئران المعدلة وراثيا طراز م : كشف المناعى باستخدام الأسلوب ABC و DAB والكشف الفلوري باستخدام طريقة thioflavin S تلطيخ.
Abstract
مرض الزهايمر (ميلادي) هو اضطراب الاعصاب الأكثر شيوعا التي تؤدي إلى الخرف. التهاب الأعصاب تشكيل اللوحة هي واحدة من السمات المميزة المرضية لمرض الزهايمر. العنصر المركزي لويحات لالتهاب الأعصاب هو صغير الخيطية بروتين اميلويد β يسمى البروتين (Aβ) 1 ، وهي مشتقة من الانقسام بروتين متسلسلة من البروتين بيتا اميلويد السلائف (كونا) عن طريق secretase - β γ وsecretase. فرضية الأميلويد يستتبع ذلك Aγ المحتوية على لويحات باعتباره الآلية الأساسية في علم الأمراض السامة م 2. تحليل تشريح الجثة وجود لوحة لالتهاب الأعصاب يؤكد تشخيص ميلادي. لمزيد من فهمنا للبيولوجيا الأعصاب في Aγ المرضية م ، وقد تم توليد سلالات الماوس المختلفة ذات الصلة معربا عن ميلادي طفرات في الجينات البشرية APP. اعتمادا على شدة المرض ، وسيتم تطوير هذه الفئران لويحات لالتهاب الأعصاب في أعمار مختلفة. هذه الفئران بمثابة أدوات لا تقدر بثمن لدراسة تطوير والمخدرات المرضية التي قد تؤثر على مسار معالجة التهاب الأعصاب APP وتشكيل اللوحة. في هذا البروتوكول ، ونحن توظيف أسلوب المناعى للكشف محددة لويحات لالتهاب الأعصاب في نموذج الفئران ميلادي. وسوف نناقش على وجه التحديد من إعداد استخراج المخ نصف التثبيت بارافورمالدهيد ، cryosectioning ، وطريقتين للكشف عن اللوحات العصبية في الفئران المعدلة وراثيا م : كشف المناعى باستخدام الأسلوب ABC و DAB والكشف الفلوري باستخدام طريقة thiofalvin S تلطيخ.
Protocol
1. التثبيت من أدمغة فئران وcryosectioning
- وضحى الفئران المعدلة وراثيا باستخدام غاز ثاني أكسيد الكربون ، تليها قطع الرأس والدماغ المستخرج.
- يتم تشريح الدماغ طوليا في المركز. ونصف من الدماغ تكون فلاش المجمدة على الجليد الجاف لتحليل البيوكيميائية. وسيتم غمر الآخر في بارافورمالدهيد 4 ٪ (PFA) ما لا يقل عن 48 ساعة في 4 درجات مئوية.
- بعد التثبيت في PFA 4 ٪ على الأقل 48 ساعة ، ويتم نقل نصفي الدماغ مباشرة في حل 30 ٪ سكروز وضعت في 4 درجات مئوية. في هذه النقطة ، يجب أن نصفي الدماغ عائمة في حل السكروز. عندما غرقت نصفي الدماغ إلى أسفل ، الأمر الذي يتطلب عادة حوالي 48 ساعة ، انها مستعدة لتكون جزءا لا يتجزأ من أكتوبر لcryosectioning.
- قبل cryosectioning ، شن طبقة رقيقة من أكتوبر على مقبض الباب والسماح لتجميد عند -20 درجة مئوية. إزالة المخيخ عن بقية نصفي الدماغ ومكان على طبقة من أكتوبر المجمدة. تغطية مباشرة مع نصفي الدماغ أكتوبر ، والسماح لتجميد ببطء في -20 درجة مئوية. بمجرد دمج أكتوبر الدماغ تحولت مبهمة ، وانها مستعدة لتكون مقطوع.
- تعيين سمك كل قسم إلى 30 ميكرون. جمع كل شريحة في وعاء مع الحل Olomos D'.
2. المناعية الداخلي لويحات لالتهاب الأعصاب (الأقسام التعويم)
- علاج كل قسم في حمض الفورميك 88 ٪ لمدة 15 دقيقة. بعد العلاج حمض الفورميك ، فإن القسم بدوره مؤقتا مبهمة وربما يبدو أن تذبل.
- إزالة كل مقطع في لوحة وتغسل مع TX - PBS (0.3 ٪ تريتون X - 100 في برنامج تلفزيوني) عن X 3 5 دقائق مع اهتزاز لطيف.
- بيروكسيد كتلة الذاتية حجب 0.5 ٪ H 2 O 2 في TX - PBS ، RT 30 دقيقة مع اهتزاز لطيف.
- غسل المقطع مع TX - X برنامج تلفزيوني عن 10 دقيقة 3 مع الهز لطيف.
- القسم كتلة مع 5 ٪ الحليب الخالي من الدسم غير الذائبة في الدهون TX - PBS في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة مع الهز لطيف.
- المقاطع في احتضان الضد الابتدائي (Biotinylated 4G8 ، 1:500-1:2000 ، الخاتم) المخفف في TX - PBS تحتوي على 5 ٪ في الحليب 4 درجات مئوية خلال الليل مع اهتزاز لطيف.
- غسل المقطع مع TX - X برنامج تلفزيوني عن 10 دقيقة 3 مع الهز لطيف.
- إعداد بروتوكول ABC الصانع حل التالية (ABC النخبة ، المتجهات المختبرات ،). احتضان المقاطع في خليط ABC لمدة 30 دقيقة مع اهتزاز لطيف.
- غسل المقطع مع TX - X برنامج تلفزيوني عن 10 دقيقة 3 مع الهز لطيف.
- تعد 3،3 '- diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) (ناقلات مختبرات) بروتوكول المصنعة التالية. احتضان المقاطع في خليط DAB ل5-10 دقيقة. عند هذه النقطة ، وسوف نلاحظ اللون البني وضع على كل قسم.
- غسل المقطع مع TX - X برنامج تلفزيوني عن 10 دقيقة 3 مع الهز لطيف.
- هي التي شنت أقسام الدماغ التعويم الحر على الشرائح المغلفة الجيلاتين ، للمساعدة في التصاق الأنسجة. المقاطع ثم يتم تجفيفها ثم بمسح جوي مع سلسلة من الزيلين والتي تقام في Entellen.
- وتصور اللوحات تحت المجهر الضوئي في التكبير 40X وكميا من خلال تقييم لوحة العد يعني لكل شريحة لكل الماوس.
3. Thioflavin S تلطيخ الداخلي للكشف عن اللوحات لالتهاب الأعصاب
- وكما هو مبين التضحية الماوس والدماغ الداخلي في استخراج المقاطع 1،1-1،5.
- نصفي الدماغ جبل 4-5 المقاطع على شريحة زجاجية والسماح للهواء جاف تماما قبل التلوين.
- تغسل الشرائح مع الإيثانول 70 ٪ لمدة 1 دقيقة.
- تغسل الشرائح مع الإيثانول 80 ٪ لمدة 1 دقيقة.
- احتضان الشرائح في حل تصفية (0.2 ميكرون فلتر) thioflavin S (1 ٪ في 80 ٪ من الايثانول) لمدة 15 دقيقة. (حل Thioflavin S يحتاج إلى أن يصفى قبل كل استعمال). ملاحظة : حماية thioflavin S من الضوء الملون وحماية الشرائح من الضوء.
- تغسل الشرائح مع الإيثانول 80 ٪ لمدة 1 دقيقة.
- تغسل الشرائح مع 70 ٪ 1 دقيقة الايثانول.
- يغسل بالماء المقطر مرتين.
- الشرائح في جبل المائية المتزايدة وسائل الاعلام والسماح ليجف الشرائح في الظلام لمدة ساعة على الأقل 2 ، تليها ساترة الختم مع طلاء الأظافر واضحة. يجب أن يتم تخزين المقاطع الملون في الظلام في 4 درجات مئوية.
- ويمكن لويحات الأخضر الملون مضان يمكن تصور مع microscropy الفلورسنت. تحليل الشرائح غضون أسبوع واحد بسبب تلطيخ سوف تتلاشى مع مرور الوقت.
4. ممثل النتائج
في دراستنا الأخيرة على فعالية الأدوية المضادة للصرع والمزاج حمض استقرار الفالبوريك (VPA) لمنع التهاب الأعصاب تشكيل اللوحة ، استخدمنا immunostaining المذكورة أعلاه وthioflavin S تلطيخ إجراءات لتحديد ويحات التهاب الأعصاب في الفئران نموذج ميلادي (3). الشكل 1 يمثل نموذجية 9 أشهر من العمر الماوس APP23 المعدلة وراثيا ، ملطخة 4G8 مكافحة Aβ biotinylated به والكشف عن طريق أسلوب ABC. وصفت بشكل واضح لويحات لالتهاب الأعصاب مع الأجسام المضادة والتي أشار إليها السهام البيضاء. باستخدام تلطيخ thioflavin S ، اكتشفنا لالتهاب الأعصاب ترسب البلاك 2 الشهر القديمة APP23xPS الهيئةالفئران nsgenic (الشكل 2). Thioflavin S ملزمة لويحات لالتهاب الأعصاب Aβ المحتوية يظهر الأخضر تحت المجهر مضان (المشار إليها السهام البيضاء). أثبتنا أن العلاج VPA ، هو انخفاض كبير لالتهاب الأعصاب تشكيل اللوحة (3). في دراسة أخرى ، درسنا ارتباط نقص الأكسجين الجزيئي المرضية الكامنة وميلادي. مرة أخرى ، باستخدام كل 4G8 تلطيخ المناعية المضادة للAβ وتلطيخ thioflavin S ، وجدنا أن نقص الأكسجة تسهيل تشكيل Aβ تحتوي على لوحات لالتهاب الأعصاب (4).
الشكل 1. التحليل المناعى لتكوين لوحة لالتهاب الأعصاب في الفئران المعدلة وراثيا ميلادي ، وقد ضحى APP23 الفئران في سن 9 أشهر ، وتشريح وثابتة ، ومقطوع. تم الكشف عن لوحات لالتهاب الأعصاب في قرن آمون باستخدام 4G8 الأضداد المضادة للAβ ووضعت باستخدام أساليب ABC و DAB. وتصور اللوحات بواسطة المجهر الضوئي مع 40X. السهام البيضاء نقطة لويحات Aβ التهاب الأعصاب.
الشكل 2. تمت التضحية تلطيخ Thioflavin S لويحات لالتهاب الأعصاب في الفئران على غرار ميلادي. APP23xPS45 الفئران المعدلة وراثيا مزدوج في 8 أسابيع من العمر وتشريح وثابتة ، ومقطوع. ويصيب التهاب الأعصاب وأكد الحصين في التلوين باستخدام thioflavin S الفلورسنت والتي تصور المجهري في التكبير 40X. الأسهم البيضاء تشير ويحات thioflavin S التهاب الأعصاب الملون.
Discussion
على غرار المناعية باستخدام biotinylated المسمى البقع الضد 4G8 ويحات التهاب الأعصاب في الفئران ميلادي مع التحديد. نتائج تلطيخ يسمح الكمي والمقارنة بين المجموعات تحميل وحة معاملة مختلفة. هناك العديد من الخطوات الحاسمة التي يمكن أن تؤثر في النتيجة. لأنه لم يتم perfused أدمغة نصفي قبل الاستخراج من الجمجمة ، ينبغي توخي الحذر أثناء عملية الاستخراج من أجل منع الأضرار التي لحقت نصفي الدماغ. وعلاوة على ذلك ، لأن perfused بسلبية نصفي الدماغ ، نوصي تفرخ في PFA 4 ٪ على الأقل 48 ساعة في 4 درجات مئوية قبل الغطس في حل السكروز 30 ٪. بدلا من ذلك ، يمكن القيام به نضح transcardial قبل استخراج المخ. إذا تم إصلاح الدماغ بشكل صحيح ، يجب أن يكون لديها مطاطي الملمس. في حال لم يتم إصلاح الدماغ بشكل صحيح ، فإن أبواب المسيل للدموع بسهولة في حل Olomos D' أو أثناء إجراءات تلطيخ.
الأجسام المضادة وحيدة النسيلة 4G8 هو رد الفعل على بقايا من الأحماض الأمينية 17-24 Aβ وأقر حاتمة في التسلسل الأساسية (VFFAE). منذ مشتق من الأنواع 4G8 الماوس ، أنه يميل إلى إعطاء أعلى تلوين الخلفية. وبالتالي ، اخترنا لاحتضان المقاطع في تخفيف وأشارت إلى تحقيق مع الاعتبارات إشارة حقيقية مع تقليل تلوين الخلفية.
بالإضافة إلى immunostaining للكشف عن اللوحات باستخدام الأجسام المضادة لالتهاب الأعصاب 4G8 ، كما يستخدم أسلوب thioflavin S تلطيخ لتحديد ويحات. Thioflavin S هو خليط متجانس الصبغة التي تنتج من مثيلة من dehydrothiotoluidine مع حمض السلفونيك. Thioflavin S غير انتقائي يربط محتويات ورقة بيتا من البروتينات ، مثل تلك الموجودة في oligomers اميلويد. عند ملزمة ، thioflavin يخضع لتحول مميزة الزرقاء من الطيف انبعاثاته. على العكس سيكون ملزما thioflavin S لأشكال موحودي لا تثير تحولا الأزرق وأنه لا يمكن الكشف عنها مع المجهر الفلورسنت. تلطيخ Thioflavin S يوفر بديلا سريعا للكشف عن اميلويد وكثافة مضان تسمح برؤية جيدة للكميات صغيرة من الودائع اميلويد. ومع ذلك ، عيب واحد عن تلطيخ thioflavin S هو عدم وجود خصوصية. العديد من المكونات الأخرى بما فيها الأنسجة التي تحتوي على صفائح بيتا واسعة النطاق ، مثل fibrinoids ، زجاجي ، الكيراتين ، الخ ، وتقارب بدلا عن هذه الصبغة.
Disclosures
وأجريت جميع التجارب وفقا للرعاية جامعة كولومبيا البريطانية الحيوان واللجنة التوجيهية واستخدم CIHR.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الكندية لأبحاث الصحة (CIHR) ، والأسرة تاونسند ، وجاك براون والأسرة مؤسسة أبحاث الزهايمر (لWAS). كان هو صاحب كرسي أبحاث كندا في مرض الزهايمر. معتمد من قبل PTTL العلوم الطبيعية والهندسة والبحوث المستشار مايكل سميث مؤسسة المنح الدراسية بحوث الصحية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148-1KG | |
| Polyvinylpyrrolidene | Sigma-Aldrich | PVP40-100G | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-3 | |
| Ethylene glycol | Sigma-Aldrich | 324558-2L | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| 88% formic acid | Fisher Scientific | A118P-500 | |
| Triton X-100 | ICN Biomedicals | 807426 | |
| H2O2 | Sigma-Aldrich | H-1009 | |
| Biotin Labeled 4G8 Antibody | Cedarlane Labs | SIG-39240-500 | |
| Elite ABC kit | Vector Laboratories | PK-6100 | |
| Imm PACT DAB | Vector Laboratories | SK-4105 | |
| Xylene | Fisher Scientific | X4-4 | |
| Entellan | Electron Microscopy Sciences | 65037-71 | |
| Superfrost* Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Cryostat | Leica Microsystems | CM-3050-S | |
| MX35 Premier microtome blade | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 3052835 | |
| Thioflavin S | Sigma-Aldrich | T1892-25G |
References
- Glenner, G. G., Wong, C. W. Alzheimer's disease: initial report of the purification and characterization of a novel cerebrovascular amyloid protein. Biochem Biophys Res Commun. 120, 885-890 (1984).
- Hardy, J., Selkoe, D. J. The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease: progress and problems on the road to therapeutics. Science. 297, 353-356 (2002).
- Qing, H., He, G., Ly, P. T., Fox, C. J., Staufenbiel, M., Cai, F., Zhang, Z., Wei, S., Sun, X., Chen, C. H., Zhou, W., Wang, K., Song, W. Valproic acid inhibits Abeta production, neuritic plaque formation, and behavioral deficits in Alzheimer's disease mouse models. J Exp Med. 205, 2781-2789 (2008).
- Sun, X., He, G., Qing, H., Zhou, W., Dobie, F., Cai, F., Staufenbiel, M., Huang, L. E., Song, W. Hypoxia facilitates Alzheimer's disease pathogenesis by up-regulating BACE1 gene expression. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 18727-18732 (2006).
