Summary
Одним из патологических характеристик АД является формирование амилоидных белков β положительные бляшки neuritic. В этом протоколе описываются два метода для обнаружения neuritic бляшек у трансгенных мышей модель AD: иммуногистохимического обнаружения с использованием ABC и DAB метод и флуоресцентной детекции использованием метода окрашивания тиофлавина S.
Abstract
Болезнь Альцгеймера (БА) является наиболее распространенным нейродегенеративные расстройства, ведущие к слабоумию. Neuritic бляшек является одним из патологических признаков болезни Альцгеймера. Центральным компонентом neuritic бляшек небольшой нитчатые белок, называемый белок амилоида β (Ар) 1, который является производным от последовательного протеолитического расщепления бета-белка-предшественника амилоида (APP) в β-и γ секретазы-секретазы. Амилоида гипотеза предполагает, что Aγ содержащие бляшки в качестве базовой токсичными механизм в AD патология 2. Посмертном анализе присутствия neuritic доска подтверждает диагноз БА. Для более глубокого понимания Aγ нейробиологии в нашей эры патогенеза, различных линий мышей выражения AD связанных мутаций в генах человека APP были получены. В зависимости от тяжести заболевания, эти мыши будут развиваться neuritic бляшек в разном возрасте. Эти мыши служат бесценными инструментами для изучения патогенеза и разработки лекарственных средств, которые могут повлиять пути APP обработки и формирования neuritic бляшки. В этом протоколе, мы используем иммуногистохимического метода специфической детекции neuritic бляшек у мышей AD модели. Мы специально обсудить подготовку от добычи половина мозга, параформальдегид фиксации, cryosectioning, и два метода для выявления невротических бляшек в нашей эры трансгенных мышей: иммуногистохимического обнаружения с использованием ABC и DAB метод и флуоресцентной детекции использованием метода окрашивания thiofalvin S.
Protocol
1. Фиксация мыши мозги и cryosectioning
- Трансгенные мыши были принесены в жертву использовании углекислого газа, а затем путем обезглавливания и мозга извлечены.
- Мозг расчлененный продольно в центре. Половина мозга будут заморозки на сухом льду для биохимического анализа. Другие будут затоплены в 4% параформальдегида (PFA), по крайней мере 48 часов при температуре 4 ° C.
- После фиксации в 4% PFA, по крайней мере 48 часов, мозг геми передается непосредственно на 30% раствором сахарозы и помещен при 4 ° C. В точке, мозг геми должны быть плавающие в растворе сахарозы. Когда мозг геми опустился на дно, как правило, требуется около 48 часов, он готов вложить в октябре для cryosectioning.
- Перед cryosectioning, смонтировать тонким слоем октября на ручку и позволить заморозить при -20 ° C. Удаление мозжечка от остальной части мозга геми и место на слой замороженного октября Сразу же покрытие мозга геми с октября и дать медленно замерзать при -20 ° C. Как только вложение октября мозг превратился непрозрачным, он будет готов к секционным.
- Установите толщину каждой секции до 30 мкм. Сбор каждый ломтик в контейнер с раствором D'Olomos.
2. Immunohistochemistry процедура neuritic бляшек (свободное плавание разделы)
- Обработайте каждую часть в 88% муравьиной кислоты в течение 15 минут. После лечения муравьиная кислота, раздел будет временно свою очередь, непрозрачными и может показаться, сморщиваются.
- Удалить каждый раздел в тарелку и вымыть с Тх-би-эс (0,3% Тритон Х-100 в PBS) в течение 5 мин х 3 с нежным встряхивания.
- Блок Эндогенные перекиси блокирование 0,5% H 2 O 2 в Tx-би-эс, RT 30 мин при осторожном встряхивании.
- Вымойте секция с Tx-PBS в течение 10 мин х 3 с нежным встряхивания.
- Блок секции с 5% обезжиренного обезжиренного молока, растворенного в Tx-PBS при комнатной температуре в течение 1 часа при осторожном встряхивании.
- Инкубируйте разделы в первичных антител (биотинилированных 4g8, 1:500-1:2000, перстень) разводят в Tx-би-эс, содержащий 5% молока при температуре 4 ° С в течение ночи с нежным встряхивания.
- Вымойте секция с Tx-PBS в течение 10 мин х 3 с нежным встряхивания.
- Подготовка протокола ABC решение следующих производителей (Elite ABC, Vector Laboratories). Инкубируйте разделы ABC смеси в течение 30 мин при осторожном встряхивании.
- Вымойте секция с Tx-PBS в течение 10 мин х 3 с нежным встряхивания.
- Подготовка 3,3 '-диаминобензидина tetrahydrochloride (DAB) (Vector Laboratories) протокол следующие производителя. Инкубируйте разделы DAB смесь в течение 5-10 мин. На данный момент, вы будете наблюдать коричневатого цвета развиваются на каждой секции.
- Вымойте секция с Tx-PBS в течение 10 мин х 3 с нежным встряхивания.
- Свободно плавающие разделы мозга установлены на желатин покрытием слайды, чтобы помочь с тканью адгезии. Разделы высушить на открытом воздухе следует поляну с серией ксилол и установлены в Entellen.
- Бляшки визуализируются при световой микроскопии в 40-кратном увеличении и количественно путем оценки необязательным доска на срез для каждой мыши.
3. Тиофлавина S окрашивание процедурой для обнаружения neuritic бляшек
- Мышь жертву и порядок мозга экстракции, как указано в разделах 1.1 до 1.5.
- Горе от 4 до 5 геми мозга разделы на предметное стекло и позволяют полностью высохнуть до окрашивания.
- Вымойте слайды с 70% этанола в течение 1 минуты.
- Вымойте слайды с 80% этанола в течение 1 минуты.
- Инкубируйте слайды в раствор фильтруют (фильтр 0,2 мкм) тиофлавина S (1% в 80% этанола) в течение 15 минут. (Раствор тиофлавина S должна быть отфильтрованы перед каждым использованием). Примечание: защитить тиофлавина S от света и защиты окрашенных слайды из света.
- Вымойте слайды с 80% этанола в течение 1 минуты.
- Вымойте слайды с 70% этанола на 1 минуту.
- Промыть дистиллированной водой в два раза.
- Горы слайды в водных монтажа средств массовой информации и позволяют слайды сушить в темноте в течение как минимум 2 часа, после чего уплотнения покровное прозрачным лаком ногтей. Витражи разделов следует хранить в темноте при 4 ° C.
- Зеленая флуоресценция окрашенных бляшки могут быть визуализированы с люминесцентными microscropy. Анализ слайдов в пределах одной недели, потому что окрашивание исчезнет со временем.
4. Представитель Результаты
В нашем недавнем исследовании по эффективности противоэпилептических лекарств и стабилизатор настроения вальпроевая кислота (VPA) для подавления neuritic образование зубного налета, мы использовали описанные выше иммунной и тиофлавина S окрашивания процедур по выявлению neuritic бляшек в AD модели мышей (3). Рисунок 1 представляет собой типичную 9 месяца APP23 трансгенные мыши, витражи с анти-Ар использованием биотинилированного 4g8 и обнаружил с помощью метода АВС. Neuritic бляшки четко маркированы антител и обозначены белыми стрелками. Использование окрашивания тиофлавина S, мы обнаружили neuritic осаждения доска 2 месяца APP23xPS траnsgenic мышей (рис. 2). Тиофлавина S связаны Ар-содержащие бляшки neuritic появляется зеленый под флуоресцентной микроскопии (обозначены белыми стрелками). Мы показали, что при лечении VPA, neuritic бляшек значительно снижается (3). В другом исследовании, мы изучили молекулярную связь лежащий в основе гипоксию и AD патогенез. Опять же, используя как 4g8 анти-Ар окрашивания иммуногистохимии и окрашивания тиофлавина S, мы обнаружили, что гипоксия, способствовал формированию Ар содержащие neuritic бляшки (4).
Рисунок 1. Иммуногистохимический анализ neuritic бляшек в нашей эры трансгенных мышей. APP23 мышей в возрасте 9 месяцев, были принесены в жертву и были вскрыты, фиксированных и секционные. Neuritic бляшек в гиппокампа были обнаружены с помощью анти-Ар антител 4g8 и были разработаны с использованием ABC и DAB методами. Бляшки были визуализированы с помощью световой микроскопии с 40Х. Белые стрелки указывают на Ар бляшек neuritic.
Рисунок 2. Окрашивание тиофлавина к югу от neuritic бляшек в AD моделируется мышей. APP23xPS45 двойной трансгенных мышей на 8 недель и были принесены в жертву были вскрыты, фиксированных и секционные. Neuritic чумы в гиппокампе которые были подтверждены с помощью флуоресцентного окрашивания тиофлавина S и визуализируется с помощью микроскопа при 40-кратном увеличении. Белые стрелки указывают тиофлавина S окрашенных бляшек neuritic.
Discussion
Immunohistochemistry использованием биотинилированного меченых антител 4g8 пятна neuritic бляшек в AD моделируется мышей с специфичности. Окрашивание результат позволяет количественной оценки и сравнения налета нагрузку между разными группами лечения. Есть несколько важных шагов, которые могли бы повлиять на результат. Потому что геми мозги не перфузии до извлечения из черепа, ухода следует применять во время процесса извлечения, чтобы предотвратить повреждение мозга Hemi. Более того, поскольку мозг геми пассивно перфузии, мы рекомендуем инкубации ее в 4% PFA, по крайней мере 48 часов при температуре 4 ° С до погружения в 30% раствором сахарозы. Кроме того, transcardial перфузии может быть сделано до извлечения мозга. Если мозг правильно закреплен, он должен иметь резиновой текстурой. В случае, когда мозгу не фиксируется должным образом, разделы будут легко рваться в решении D'Olomos или во время окрашивания процедур.
4g8 моноклональное антитело реагирует на аминокислотных остатков 17-24 оператора Ар и признанных эпитопа в ядре последовательности (VFFAE). С 4g8 происходит от мыши видов, как правило, дают более высокий фон окрашивания. Таким образом, мы выбрали для инкубации участков на указанных разбавления соображения для достижения истинного сигнала при минимальном фоне окрашивания.
В дополнение к иммуногистохимическое neuritic обнаружения бляшек использованием 4g8 антител, метод окрашивания тиофлавина S также используется для идентификации бляшек. Тиофлавина S является однородной смеси красителей, что результаты метилирования dehydrothiotoluidine с сульфокислоты. Тиофлавина S неселективно связывает бета содержания листа белков, таких, как в амилоидных олигомеров. После связывания, тиофлавина претерпевает характерные синее смещение ее спектра излучения. Наоборот обязательным тиофлавина S к мономерной формы не будут вызывать синее смещение и не могли быть обнаружены с помощью флуоресцентного микроскопа. Окрашивание тиофлавина S обеспечивает быструю альтернативу экран для амилоида, как интенсивность флуоресценции позволяет хорошей визуализации небольших количеств амилоидных отложений. Тем не менее, один недостаток о окрашивание тиофлавина S является отсутствие специфичности. Многие компоненты тканей, включая содержащие обширную листов бета, таких как fibrinoids, гиалиновые, кератин и т.д., имеют довольно сродством к этим красителем.
Disclosures
Все эксперименты были проведены в соответствии с Университета Британской Колумбии Уходу за животными и комитет Использование и CIHR руководящих принципов.
Acknowledgments
Работа выполнена при поддержке Канадского института исследований в области здравоохранения (CIHR), Таунсенд семьи, и Джек Браун и семьи Альцгеймера исследовательский фонд (для WAS). БЫЛ является заведующий кафедрой исследований Канаде при болезни Альцгеймера. PTTL поддерживается естественным наукам и инженерным исследованиям и адвокат Майкл Смит Фонд стипендий исследованиям в области здравоохранения.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148-1KG | |
| Polyvinylpyrrolidene | Sigma-Aldrich | PVP40-100G | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-3 | |
| Ethylene glycol | Sigma-Aldrich | 324558-2L | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| 88% formic acid | Fisher Scientific | A118P-500 | |
| Triton X-100 | ICN Biomedicals | 807426 | |
| H2O2 | Sigma-Aldrich | H-1009 | |
| Biotin Labeled 4G8 Antibody | Cedarlane Labs | SIG-39240-500 | |
| Elite ABC kit | Vector Laboratories | PK-6100 | |
| Imm PACT DAB | Vector Laboratories | SK-4105 | |
| Xylene | Fisher Scientific | X4-4 | |
| Entellan | Electron Microscopy Sciences | 65037-71 | |
| Superfrost* Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Cryostat | Leica Microsystems | CM-3050-S | |
| MX35 Premier microtome blade | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 3052835 | |
| Thioflavin S | Sigma-Aldrich | T1892-25G |
References
- Glenner, G. G., Wong, C. W. Alzheimer's disease: initial report of the purification and characterization of a novel cerebrovascular amyloid protein. Biochem Biophys Res Commun. 120, 885-890 (1984).
- Hardy, J., Selkoe, D. J. The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease: progress and problems on the road to therapeutics. Science. 297, 353-356 (2002).
- Qing, H., He, G., Ly, P. T., Fox, C. J., Staufenbiel, M., Cai, F., Zhang, Z., Wei, S., Sun, X., Chen, C. H., Zhou, W., Wang, K., Song, W. Valproic acid inhibits Abeta production, neuritic plaque formation, and behavioral deficits in Alzheimer's disease mouse models. J Exp Med. 205, 2781-2789 (2008).
- Sun, X., He, G., Qing, H., Zhou, W., Dobie, F., Cai, F., Staufenbiel, M., Huang, L. E., Song, W. Hypoxia facilitates Alzheimer's disease pathogenesis by up-regulating BACE1 gene expression. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 18727-18732 (2006).
