Målinriktad träning av Ultrasonic vocalizations i Aged och Parkinsons Råttor

Summary

Voice sjukdomar försvagande i åldrande och Parkinsons sjukdom. Ultraljudet vocalizations av råttor, som också påverkas av dessa förhållanden kan användas för att studera dessa röststörningar, deras neurala substrat, och den typ av funktionell återhämtning med beteendeproblem intervention.

Abstract

Voice underskott är en vanlig komplikation av både Parkinsons sjukdom (PS) och åldrande, de kan avsevärt minska livskvaliteten genom att påverka kommunikationsförmåga ¹ kan ² Riktad utbildning (tal / röst terapi) förbättra specifika röst ^{underskott, 3, 4} även om den. bakomliggande mekanismer av beteendemässiga interventioner förstås inte heller bra. Systematisk undersökning av röst underskott och terapi bör överväga många faktorer som är svåra att kontrollera på människor, såsom ålder, hemmiljö, ålder efter debut av sjukdom, sjukdomens svårighetsgrad och mediciner. Den metod som presenteras här används en djurmodell av läte som möjliggör systematisk studie av hur underliggande sensomotoriska mekanismer förändras med riktade röstträning. Ultraljudet registrering och analys förfaranden som beskrivs i detta protokoll är tillämpliga på någon undersökning av gnagare ultraljud läten.

Ultraljudet vocalizations gnagare växer fram som en värdefull modell för att undersöka neurala substrat av beteende. ^5-8 Både gnagare och mänskliga vocalizations bära semiotiska värde och produceras genom att ändra en egressive luftflöde med en laryngeala sammandragning. ^{9, 10} alltså, gnagare vocalizations kan vara en användbar modell för att studera röst underskott i en sensomotoriska sammanhang. Vidare råttmodeller ge oss möjlighet att studera neurobiologiska grunderna för återhämtning från underskott med riktad utbildning.

Att modellera PD använder vi Lång-Evans råttor (Charles River Laboratories International, Inc.) och framkalla parkinsonism genom en ensidig infusion av 7 mikrogram av 6-hydroxydopamine (6-OHDA) i mediala framhjärnan bunt som orsakar måttlig till allvarlig degeneration av presynaptiska striatala nervceller (för detaljer se Ciucci, 2010). ^{11, 12} för vårt åldrande modell vi använder Fischer 344/Brown Norge F1 (National Institute on Aging).

Vår främsta metod för att få fram läten är att exponera sexuellt erfarna hanråttor för att sexuellt mottaglig honråttor. När hanen blir intresserad av den kvinnliga, är den kvinnliga bort och hanen fortsätter att artikulera. Genom att belöna komplexa läten med mat eller vatten, både antalet komplexa läten och graden av vocalizations kan ökas (figur 1).

Ett ultraljud mikrofon monterad ovanför mannens hem bur registrerar läten. Inspelningen börjar efter den kvinnliga råttan tas bort för att isolera den manliga samtal. Vocalizations kan ses i realtid för utbildning eller registreras och analyseras offline. Genom att registrera och akustiskt analysera vocalizations före och efter vokal träning, kan effekterna av sjukdomen och återställande av normal funktion med utbildning bedömas. Denna modell ger oss även möjlighet att relatera den observerade beteende (sång) förbättringar av förändringar i hjärnan och neuromuskulära systemet.

Protocol

1. Före / efter träningen Inspelningar

1. Börja ultraljud övervakning med Avisoft brännaren med hjälp av konfiguration visas i figur 2.
2. Ultraljud vocalizations kan övervakas antingen visuellt genom att titta i realtid spektrogram, eller fonetiskt med hörlurar anslutna till ultraljud inspelning gränssnitt.
3. Placera en sexuellt mottaglig (i estrus) kvinnliga råtta i buren i ämnet manlig råtta. Tecken på estrus inkluderar lordos, öron vickar och snabb rusa. Kvinnor i estrus locka fram fler läten från män än icke-sexuellt mottagliga honor.
4. Efter att hanen har visat intresse för den kvinnliga (t.ex., snusas, jaga, och / eller montering), ta bort den kvinnliga och registrera mannens vocalizations i 1-2 minuter.
5. Om hanen inte artikulera omedelbart, kortfattat tillbaka den kvinnliga råttan till mannens hem bur för att stimulera läte.

2. Vocal Training

1. Börja ultraljud övervakning med Avisoft inspelare med samma konfiguration som visas i figur 2.
2. Placera hanråttor i sitt hem buren under mikrofonen.
3. Sätt en kvinnlig råtta in i mannens hem bur. Som nämnts tidigare, bör den kvinnliga råttan vara i estrus att maximera vocalization svar från den manliga.
4. När hanen har visat intresse för den kvinnliga bort honan.
5. Omedelbart efter den manliga producerar målet vocalization, belöning samtidigt med en penna klick och en kort presentation av vattenflaskan eller mat behandla. Inledningsvis är alla 50-kHz modulerad (Figur 5B) kallar belönas. Eftersom utbildningen fortskrider bara allt mer komplexa strängar av samtal, såsom strängar på 5 till 10 samtal i snabb följd, är förstärkta.
6. Fortsätt träningspass tills du har gett 30 förstärkningar. Detta tar vanligtvis mellan 5 - 10 minuter.

3. Förberedelser för akustisk analys

1. Alltid arkivera det ursprungliga ljudet filer och göra ändringar och mätningar på en arbetskopia, eftersom analys kommer att kräva filtrering och radera buller från varje fil.
2. Med hjälp av batch-läge för Avisoft SASLab Pro högpassfilter alla ljudfiler som skall analyseras vid 25 kHz för att ta bort oönskat buller under ultraljud läten.
3. För att kunna använda den automatiska detektering inslag i SASLab Pro måste bullret tröskeln först avgöras. För att göra detta, öppna en ljudfil och skapa ett spektrogram med inställningarna visas i figur 3.
4. Den automatiska parametermätningar Displayen bör ställas in enligt de inställningar som visas i Figur 4.
5. Hitta ett område i spektrogram, där det inte finns några samtal eller ljud, det är bakgrundsljud.
6. Använda "automatisk (enda tröskelvärde)" alternativet, som den tröskel i elementet sektionen för automatisk parametermätningar dialogrutan Utskriftsformat till strax ovanför bakgrundsljud genom att justera den svarta linjen i kraftspektrum fönstret ovanför spektrogram. I figur 4 har tröskeln satts till -55 dB.
7. Längst ner i dialogrutan ställer du in "Avvisa om maximal amplitud är mindre än" värdet på 1 dB under den tröskel som finns i föregående steg. Dessa två värden bör nu användas för alla analyserade ljudfiler, förutsatt att all inspelning inställningar var desamma.

4. Vocalization Identification

1. Att märka vocalizations med den automatiska tröskel som anges ovan, först skapa ett spektrogram med ovanstående inställningar.
2. Manuellt radera några ljud som uppfyller följande kriterier: 1) felaktigt har identifierats som ett läte, 2) påverkar diskriminering av i början och / eller i slutet av läte, och / eller 3) har felaktigt identifierats som den högsta eller lägsta frekvensen i vocalization (anges av den övre och undre röda linjer, respektive). Alternativt kan start / stopp tider på vocalization etiketterna justeras manuellt efter att skapa permanenta etiketter i steg 4,5 nedan. Buller påverkar hög-och lågfrekventa mätningar, måste dock raderas manuellt.
3. I vissa fall kan en vocalization inte kommer att kunna avskiljas från den omgivande ljud, t.ex. ljudet av sängkläder under förflyttning. I dessa fall kan samtalet inte exakt analyseras och bör raderas.
4. När alla läten har identifierats, permanent radera bort delar av spektrogram från ljudfil genom att välja "Ta bort raderas spektrogram avsnitt från vågformen ..." från Verktyg-menyn. Om detta kommando inte utförs innan spektrogram är stängd, kommer alla att radera arbete gå förlorat.
5. Skapa permanenta etiketter i ljudfilen genom att klicka på knappen "Redigera" i elementet sektionen för automatisk parametermätningar inställningsfönstret.
6. Visuellt och fonetiskt granska varje märkt vocalization att bestämma sin kategori: enkel, frekvensmodulerad (FM) eller harmoniska. AssIGN lämplig beteckning att använda fördefinierade text-moduler. Exempel på varje vocalization kategori visas i figur 5.
7. Stäng spektrogram, spara ljudfilen, och fortsätta med nästa ljudfil som skall analyseras.

5. Akustiska mätningar

1. Efter vocalizations i alla ljudfilerna har identifierats, använda verktyget batch-bearbetning (Verktyg: Batch Processing) för att automatiskt mäta akustiska parametrarna för alla filer.
2. I batch-bearbetning dialogruta, välj "Automatisk parametermätningar" från rullgardinsmenyn.
3. Välj "processen alla filer i den valda mappen" rutan och klicka sedan på "mapp"-knappen och välj den mapp där ljudet filer sparas.
4. Klicka på "Start" och varje fil kommer automatiskt att analyseras enligt de inställningar som senast användes i den automatiska parameter mätning inställning dialogrutan.
5. Mätningarna kommer att sparas i en textfil som kan definieras med hjälp av DDE parametrar / loggfil Ange kommando. Denna textfil kan sedan importeras till ett program för statistisk analys.

6. Representativa resultat:

Ultrasonic vocalizations av råttor påverkas av fysiologiska förändringar i samband med åldrande och 6-OHDA Parkinsons modeller sjukdom ¹³ Vanligtvis ser vi en minskning av kvaliteten på ultraljud vocalizations kännetecknas av en minskning av följande kvantitativa akustiska parametrar:. Bandbredd, maximal frekvens, varaktighet och intensitet. Figur 6 visar frekvensmodulerad vocalizations av en råtta i PD-modellen vid tre olika tidpunkter: baslinjen, efter induktion av PD, och efter vocalization utbildning. I PD tillstånd, visar kalla en minskning av bandbredd, varaktighet och intensitet. Dessutom har frekvensmodulering blivit oregelbundna.

Förutom nedbrytning av specifika akustiska parametrar, observerar vi också mindre totala komplexiteten i de typer av läten som produceras i åldrarna och parkinsonism råttor. Till exempel, efter induktion av PD en råtta ger ett större antal enkla samtal och färre frekvensmodulerad samtal. Efter vocalization utbildning, många akustiska parametrar, såsom varaktighet och intensitet, tillvägagångssätt vid baseline och antalet komplexa samtal ökar (Figur 6). Åldrad råttor uppenbara liknande nedbrytning av akustiska parametrar i sina ultraljud läten. Vi undersöker för närvarande effekterna av vokala utbildning i åldern råttor.

Figur 1. Antal vocalizations per session (uppnått av alla råttor varje vecka) och vocalization hastighet (medelvärde och standard error visas) både öka under en 6-veckors praktik i en grupp av både unga (9 mån) och gamla (32 MO) Fischer 344/Brown Norge F1 råttor.

Figur 2 representant vocalizations av varje av de tre kategorierna av 50 kHz vocalizations;. (A) enkla, (B) frekvens-modulerad, och (C) harmonisk.

Figur 3. Representant frekvens-modulerad läten från en enda råtta vid (A) baslinje, (B) efter PD induktion, och (C) efter vocalization utbildning.

Discussion

Ultraljud vocalizations hos råttor verkar vara känsliga för åldrande och sjukdom processer, såsom Parkinsons sjukdom. Dessa ultraljud vocalizations ger en beteendevetenskaplig modell av sång funktion, inklusive underskott som följer med fysiologiska förändringar på grund av sjukdom och åldrande. Dessutom har akustiska förändringar i ultraljud vocalizations lätt mätas och kvantifieras. Dessutom kan ultraljud vocalizations ändras genom beteendemässiga ingrepp. Därför råtta ultraljud vocalizations ger en användbar modell för att studera effekterna av sjukdom, åldrande, och terapeutiska insatser på både beteende och bakomliggande neurobiologiska mekanismer.

Vår metod för röst-utbildning använder en betingad stimulus (en klick) förknippas med en positiv förstärkning (ett vatten eller mat behandla belöning). Den klickar följt av belöning används för att förstärka vocalizations av ökande komplexitet. Vi definierar komplexa läten som de som innehåller en "drill" (frekvensmodulerad) komponent (Figur 5B) jämfört med de som är "platt" och underhålla en enda frekvens (Figur 5A). Denna frekvens modulerad komponent är lätt identifieras genom sitt sinusformad utseende. Medan 50-kHz vocalizations kan vara helt sinusformad (Figur 5B), är det vanligt att stöta på mer komplexa 50-kHz läten som består dels av denna frekvens modulerad komponenten samt antingen stora hopp i frekvens eller en kort platt komponent. Dessa mer komplexa läten kan ha korta pauser på mindre än 10 ms mellan komponenter men betraktas som en enda läte. Även om ytterligare detaljerade sub-klassificering av dessa läten är möjligt nu, ¹⁴ vi klassificerar alla 50-kHz vocalizations innehåller en frekvensmodulerad komponent så komplext att minska behovet för online subjektiv klassificering och minska förstärkning variabilitet. I ditt eget labb är det viktigt att välja hur data klassificeras och analyseras enligt en studie design som är lämplig för syftet med studien.

Det finns många faktorer att tänka på när du använder detta protokoll. Först av allt, trots genetiska homogenitet och processuella konsistens, råttor har en varierande svar på träning. Vissa råttor artikulera naturligtvis mer än andra, ⁵ eller motiveras av exponering mot en kvinnlig mer än med ett livsmedel eller vatten belöning. Ett sätt vi står för denna variation är genom att undersöka förändringen i akustiska parametrar från enskilda råttornas baslinjen vocalizations till deras post-lesion och efter träning läten. Även om det inte diskuteras i detta protokoll har vi också beteendemässiga analyser för att kvantifiera intresse för den kvinnliga, såsom latens att montera. Dessutom, beroende på ålder och aktivitetsnivå en enskild råtta, kanske en tråd topp behövas på buren under träning för att förhindra flykt. Trots variationen mellan olika individer, har vi använt med framgång detta protokoll på en mängd olika stammar och åldrar för att förbättra vocalizations förhållande till varje enskild råttans baslinje.

Råttor är känsliga för till synes små förändringar i miljön, såsom dofter, temperatur och personal. Ansträngningar bör göras för att undvika parfymerade hygienprodukter, såsom krämer, hårvårdsprodukter och parfymer. Innan utbildning måste en person vara bekväm interagera med och hantering råttor. Dessutom kan eventuella inkonsekvenser i personal eller miljö påverkar råttornas vocalization svar.

Eftersom råttor är nattdjur, bör de hållas på en omvänd ljus cykel för att möjliggöra utbildning för att äga rum under den mörka delen av sin cykel när de är mest aktiva. Vi lyser upp vårt träningsrum med röda lampor. Dessutom, om ett vatten belöning används vid utbildning bör råttor har begränsad tillgång till vatten. Våra råttor är vatten begränsas för 21 timmar före träningspasset. Tre timmar av vatten exponering bestäms av våra institutionella Djurvård och använda kommittén för att vara de minst restriktiva tidsperiod som lät vattnet vara användbar som förstärkning i vår beteendestudier utan att utgöra en betydande kompromiss för djurens hälsa eller välbefinnande. Råttor får tillgång till vatten vid slumpmässiga tidpunkter (10 minuter till 30 minuter) efter träning och därefter har fri tillgång till vatten i tre timmar under den mörka delen av deras ljus cykel. Råttor bör inspekteras varje dag för tecken på uttorkning och vägde varannan dag för att se till att det inte finns någon betydande (mer än 10%) viktminskning. Ett livsmedel begränsning är inte nödvändig om du använder ett livsmedel behandla som en belöning. Behandlar specifika för råttor är kommersiellt tillgängliga, men vi har hittat en liten bit av en söt spannmål vara en effektiv belöning.

Som nämnts ovan honråttor i estrus framkalla en högre vocalization svar från män än icke-sexuellt mottagliga honor. Genom att upprätthålla ett stort antal honor i kolonin, det finns en hög sannolikhet för att vidMinst en kvinna kommer att vara i estrus en viss dag. Däremot kan estrus också farmakologiskt inducerad hos honråttor av subkutant injicera 10 mikrogram av β-estradiol i 0,1 cc sterilt 48 sesamolja timmar före utbildning följt av 500 mikrogram av progesteron i 0,1 cc sterilt sesamolja 4 timmar innan träning. Dessutom måste hanråttor som är naivt att honråttor vara sexuellt erfaren före vokal träning. Detta sker genom att placera en kvinnlig råtta som uppvisar tecken på sexuella mottaglighet (rusa, lordos, öron vickar) i mannens hem bur tills den manliga fästen och utlösning. Hanar får inte montera under de första sessionerna och det kvinnliga kan tas bort efter den manliga visar intresse för den kvinnliga genom att sniffa och / eller jagar honan runt i buren. Sexuellt upplever sker en gång om dagen i två veckor. Denna tidsperiod ger också en möjlighet för råttor för att vänja till försöksledaren (er) och inspelningsrummet.

En begränsning med denna metod är den subjektiva bestämning av vocalization typ. Dessutom begränsar denna faktor hastigheten på insamling av uppgifter som varje samtal måste vara oberoende undersökas och manuellt klassificerade. Relaterat till detta är vikten av att ha erfarna bedömare som konsekvent har utbildats i vocalization identifiering. Både inom och inter-rater reliability bör bedömas inom ditt eget lab.

Sammanfattningsvis är ultraljud vocalizations hos gnagare som används i många olika modeller för att studera hjärnan beteende relationer, inklusive känslotillstånd, belöning och missbruk, och stater sjukdomar såsom autism. ^6,14-16 Denna roman metod är ett sätt att studera mekanismerna bakom riktade sång träning för behandling av röst underskott i åldrande och Parkinsons sjukdom. Denna metod har potential att kunna tillämpas på andra sjukdomar modeller som påverkar kommunikationen och röst.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Condenser ultrasound microphone CM16/CMPA	Avisoft BioAcoustics	40011
UltraSoundGate 116Hb	Avisoft BioAcoustics	41161
Avisoft-RECORDER	Avisoft BioAcoustics	10201
Avisoft-SASLab Pro	Avisoft BioAcoustics	10101