Summary
Troubles de la voix sont débilitants dans le vieillissement et la maladie de Parkinson. Les vocalisations ultrasoniques des rats, également touchés par ces conditions, peuvent être utilisés pour étudier ces troubles de la voix, leurs substrats neuronaux, et la nature de la récupération fonctionnelle avec une intervention comportementale.
Abstract
Voix déficits sont une complication fréquente de la maladie de Parkinson à la fois (PD) et le vieillissement, ils peuvent diminuer de façon significative la qualité de vie en impactant les capacités de communication 1, 2 formations ciblées (discours / thérapie vocale) peut améliorer les déficits voix spécifique, 3, 4, bien que l'. mécanismes sous-jacents des interventions comportementales ne sont pas bien comprises. Investigation systématique des déficits voix et le traitement doit considérer plusieurs facteurs qui sont difficiles à contrôler chez les humains, comme l'âge, le milieu familial, l'âge post-apparition de la maladie, la sévérité de la maladie et les médicaments. La méthode présentée ici utilise un modèle animal de la vocalisation, qui permet pour l'étude systématique de la manière sous-jacente sensori mécanismes de changement avec la formation vocale ciblées. Les procédures d'enregistrement et d'analyse par ultrasons décrits dans le présent protocole sont applicables à toute enquête sur les vocalisations des rongeurs à ultrasons.
Les vocalisations ultrasoniques des rongeurs sont en train de devenir un modèle précieux pour enquêter sur les substrats neuronaux de comportement. 5-8 Les rongeurs et les vocalisations humains portent une valeur sémiotique et sont produites en modifiant un flux d'air egressive avec une constriction du larynx. 9, 10 Ainsi, les vocalisations des rongeurs peut être un modèle utile pour étudier les déficits voix dans un contexte sensori-moteur. En outre, des modèles de rats nous permettre d'étudier les fondements neurobiologiques de la reprise des déficits avec des formations ciblées.
Pour le modèle que nous utilisons PD rats Long-Evans (Charles River Laboratories International, Inc) et induire un syndrome parkinsonien perfusion unilatérale de 7 pg de 6-hydroxydopamine (6-OHDA) dans le faisceau médial du télencéphale qui provoque une dégénérescence modérée à sévère de présynaptique les neurones du striatum (voir détails Ciucci, 2010). 11, 12 Pour notre modèle de vieillissement, nous utilisons le procédé Fischer 344/Brown Norvège F1 (National Institute on Aging).
Notre principale méthode pour susciter des vocalisations est d'exposer sexuellement expérimentés rats mâles sexuellement réceptifs rats femelles. Quand le mâle devient intéressé par la femelle, la femelle est retirée et le mâle continue à vocaliser. En récompensant les vocalisations complexes avec de la nourriture ou l'eau, à la fois le nombre de vocalisations complexes et le taux de vocalisations peut être augmenté (figure 1).
Un microphone à ultrasons montés au-dessus de la cage du mâle enregistre les vocalisations. L'enregistrement commence après le rat femelle est retirée pour isoler les appels des hommes. Vocalisations peuvent être visualisés en temps réel pour la formation ou enregistrés et analysés hors ligne. En enregistrant et en analysant les vocalisations acoustique avant et après une formation de chant, les effets de la maladie et du rétablissement des fonctions normales de la formation peuvent être évalués. Ce modèle nous permet aussi de relier le comportement observé (vocal) des améliorations à des changements dans le cerveau et le système neuromusculaire.
Protocol
1. Pré / post-formation Recordings
- Commencez la surveillance par ultrasons avec Avisoft enregistreur en utilisant la configuration de la figure 2.
- Vocalisations ultrasoniques peuvent être suivis soit visuellement en regardant le spectrogramme en temps réel, ou auditivement avec des écouteurs branchés sur l'interface d'enregistrement échographie.
- Placez une maladie sexuellement réceptive (en oestrus) chez le rat femelle dans la cage du rat sujet masculin. Les signes d'oestrus comprennent lordose, l'oreille se tortillant, rapide et dardant. Les femelles en oestrus susciter plus de vocalisations des mâles sexuellement que les non-femelles réceptives.
- Après le mâle a montré un intérêt dans le sexe féminin (par exemple, en reniflant, la ciselure, et / ou de montage), retirez la femelle et d'enregistrer les vocalisations du mâle pendant 1-2 minutes.
- Si le mâle ne vocalisent immédiatement, revenir brièvement le rat femelle cage du mâle pour stimuler la vocalisation.
2. Formation vocale
- Commencez la surveillance par ultrasons avec Avisoft enregistreur utilisant la même configuration de la figure 2.
- Placez le rat mâle dans sa cage sous le microphone.
- Mettez un rat femelle dans la cage chez le mâle. Comme indiqué précédemment, le rat femelle en oestrus devrait être de maximiser la réponse de vocalisation du mâle.
- Une fois que le mâle s'est montré intéressé à retirer la femelle la femelle.
- Immédiatement après le mâle produit la vocalisation cible, récompense simultanément avec un clic stylo et une brève présentation de la bouteille d'eau ou de traiter les aliments. Initialement, tous les 50 kHz de fréquence modulée (figure 5B) appel est récompensé. Comme la formation progresse uniquement des chaînes plus complexes d'appels, tels que les chaînes de 5 à 10 appels en succession rapide, sont renforcés.
- Continuer la session de formation jusqu'à ce que vous avez donné 30 renforts. Cela prend généralement entre 5 - 10 minutes.
3. Préparation pour l'analyse acoustique
- Toujours archiver les fichiers audio d'origine et effectuer des modifications et des mesures sur une copie de travail, comme l'analyse, il faudra filtrer et effacer le bruit de chaque fichier.
- En utilisant le mode batch de Avisoft SASLab Pro, filtre passe-haut tous les fichiers son à analyser à 25 kHz pour enlever les bruits indésirables ci-dessous les vocalisations ultrasoniques.
- Pour utiliser la fonction de détection automatique des SASLab Pro, le seuil de bruit doit d'abord être déterminé. Pour ce faire, ouvrez un fichier audio et de créer un spectrogramme utilisant les paramètres de la figure 3.
- Le paramètre d'affichage automatique mesures doivent être configuré selon les paramètres indiqués dans la figure 4.
- Trouvez un endroit du spectrogramme où il n'ya pas d'appels ou des bruits, c'est le bruit de fond.
- Utilisation de la "automatique (seuil simple)" option, définir le seuil de la section de séparation des éléments du paramètre Mesures boîte de dialogue de configuration automatique juste au-dessus du bruit de fond en ajustant la ligne noire dans la fenêtre de spectre de puissance au-dessus du spectrogramme. Dans la figure 4, le seuil a été fixé à -55 dB.
- Au bas de la boîte de dialogue, réglez le "Rejeter si l'amplitude de crête est inférieure à la« valeur à 1 dB en dessous du seuil dans l'étape précédente. Ces deux valeurs doivent maintenant être utilisé pour tous les fichiers sonores analysés, en supposant que tous les paramètres d'enregistrement sont les mêmes.
4. Identification vocalisation
- Pour marquer les vocalisations en utilisant le seuil de configuration automatique ci-dessus, tout d'abord créer un spectrogramme avec les paramètres ci-dessus.
- Effacer manuellement tout bruit qui remplit les critères suivants: 1) a été identifié à tort comme une vocalisation, 2) affecte la discrimination de début et / ou fin de la vocalisation, et / ou 3) a été identifié à tort comme le plus élevé ou fréquence la plus basse dans la vocalisation (indiqué par les lignes supérieures et inférieures rouges, respectivement). Alternativement, les temps de démarrage / arrêt des étiquettes de vocalisation peut être réglé manuellement après la création d'étiquettes permanentes à l'étape 4.5 ci-dessous. Bruit affectant les mesures à haute fréquence et faible, cependant, doivent être effacées manuellement.
- Dans certains cas, une vocalisation ne sera pas en mesure d'être séparé des bruits environnants, comme le bruit de la literie pendant la locomotion. Dans ces cas, l'appel ne peut pas être analysés avec précision et doivent être effacés.
- Une fois tous les vocalisations ont été identifiés, d'effacer définitivement les sections supprimées du spectrogramme à partir du fichier sonore en sélectionnant «Supprimer sections spectrogramme effacé de forme d'onde ..." à partir des outils dans le menu déroulant. Si cette commande n'est pas exécutée avant que le spectrogramme est fermée, effaçant tous les travaux seront perdus.
- Créez des étiquettes permanentes dans le fichier audio en cliquant sur le bouton 'Edit' dans la section de séparation des éléments de la fenêtre des paramètres de configuration automatique des mesures.
- Visuellement et phonétiquement en revue chaque vocalise étiquetés afin de déterminer sa catégorie: simple, modulation de fréquence (FM), ou harmonique. AssIGN l'étiquette appropriée à l'aide de pré-texte défini-modules. Des exemples de chaque catégorie de vocalisation sont présentés dans la Figure 5.
- Fermer le spectrogramme, enregistrez le fichier son, et continuer avec le fichier son côté pour être analysés.
5. Mesures acoustiques
- Après vocalisations dans tous les fichiers sonores ont été identifiés, utilisez l'outil de traitement par lots (Outils: Traitement par lot) pour mesurer automatiquement les paramètres acoustiques de tous les fichiers.
- Dans la boîte de dialogue Traitement par lots, sélectionnez "mesures des paramètres automatiques" dans le menu déroulant.
- Sélectionnez le «processus de tous les fichiers dans le dossier sélectionné" case puis cliquez sur le "dossier" et sélectionnez le dossier où les fichiers son sont enregistrés.
- Cliquez sur "Démarrer" et chaque fichier sera automatiquement analysés selon les derniers paramètres utilisés dans la boîte de dialogue Mesurées automatique de configuration.
- Les mesures seront enregistrées dans un fichier texte qui peut être définie en utilisant les paramètres DDE / commande de réglage du fichier journal. Ce fichier texte peut ensuite être importé dans un programme d'analyse statistique.
6. Les résultats représentatifs:
Vocalisations ultrasoniques des rats sont affectés par les changements physiologiques associés au vieillissement et à la 6-OHDA modèles maladie de Parkinson 13 Typiquement, nous constatons une diminution de la qualité de l'vocalisations ultrasoniques caractérisée par une diminution des paramètres suivants acoustiques quantitatives:. Bande passante, la fréquence maximale, la durée , et l'intensité. La figure 6 montre les vocalisations modulation de fréquence d'un rat dans le modèle PD à trois moments différents: de base, après l'induction de la maladie de Parkinson, et après la formation de vocalisation. Dans la condition PD, l'appel montre une réduction de bande passante, la durée et l'intensité. En outre, la modulation de fréquence est devenue irrégulière.
En plus de la dégradation des paramètres spécifiques acoustique, on observe également la complexité globalement moins dans les types de vocalisations produites chez les rats âgés et de parkinsonisme. Par exemple, après l'induction de la maladie de Parkinson un rat produit un plus grand nombre de simples appels et les appels de fréquence moins modulée. Après une formation de vocalisation, de nombreux paramètres acoustiques, comme la durée et l'intensité, les niveaux de référence de la méthode et le nombre d'appels augmente complexe (figure 6). Rats âgés manifestent dégradation similaire des paramètres acoustiques dans leurs vocalisations ultrasoniques. Nous étudions actuellement les effets de la formation vocale chez les rats âgés.
Figure 1. Nombre de vocalisations par session (objectif atteint par tous les rats de chaque semaine) et le taux de vocalisation (erreur moyenne et montré) à la fois augmenter sur une période de formation de 6 semaines dans un groupe de deux jeunes (9 Mo) et vieux (32 mo) Fischer 344/Brown rats surmulots F1.
Figure 2 vocalisations représentant de chacune des trois catégories de vocalisations 50 kHz;. (A) simple, (B) en modulation de fréquence, et (C) harmoniques.
Figure 3. Représentant en modulation de fréquence à partir des vocalisations un seul rat en (A) de base, (B) après-PD par induction, et (C) de formation après la vocalisation.
Discussion
Vocalisations ultrasoniques chez des rats semblent être vulnérables aux processus de vieillissement et la maladie, telles que la maladie de Parkinson. Ces vocalisations ultrasoniques fournissent un modèle de comportement de la fonction vocale, y compris les déficits qui accompagnent les changements physiologiques dus à la maladie et le vieillissement. En outre, les changements dans les vocalisations ultrasoniques acoustiques sont facilement mesurables et quantifiables. En outre, les vocalisations ultrasoniques peuvent être modifiés grâce à des interventions comportementales. Par conséquent, les vocalisations ultrasoniques rat fournir un modèle utile pour étudier l'impact de la maladie, le vieillissement, et des interventions thérapeutiques sur le comportement et qui sous-tendent les mécanismes neurobiologiques.
Notre méthode de formation vocale utilise un stimulus conditionné (un clic) associée à un renforcement positif (récompense traiter l'eau ou de nourriture). Le clic suivie par la récompense est utilisé pour renforcer les vocalisations de complexité croissante. Nous définissons les vocalisations complexes que ceux contenant un «trille» (fréquence modulée) composant (figure 5B) par rapport à ceux qui sont "à plat" et de maintenir une fréquence unique (figure 5A). Cette composante de fréquence modulée est facilement identifié par son aspect sinusoïdal. Alors que 50 kHz vocalisations peuvent être entièrement sinusoïdale (figure 5B), il est fréquent de rencontrer plus complexe de 50 kHz vocalisations qui consistent en partie de cette composante en modulation de fréquence ainsi que deux grands sauts de fréquence ou un composant brève plat. Ces vocalisations plus complexes peuvent avoir de courtes pauses de moins de 10 ms entre les composants, mais sont considérés comme une vocalisation unique. Bien plus détaillée des sous-classification de ces vocalisations est possible en ligne, nous classons toutes les 14 vocalisations 50 kHz contenant un composant à modulation de fréquence aussi complexe pour réduire la nécessité pour la classification subjective en ligne et de réduire la variabilité de renfort. Dans votre propre laboratoire, il est important de choisir comment les données sont classées et analysées selon un modèle d'étude qui est approprié pour le but de l'étude.
Il ya plusieurs facteurs à considérer lors de l'utilisation de ce protocole. Tout d'abord, malgré une homogénéité génétique et la cohérence de procédure, les rats ont une réponse variable à la formation. Certains rats naturellement vocalisent plus que les autres, 5 ou sont motivés par l'exposition à un plus de femmes que par une récompense alimentaire ou de l'eau. Une façon de rendre compte de cette variabilité est en examinant les changements dans les paramètres acoustiques des vocalisations de base des rats individuels à leurs études post-lésion et post-formation vocalisations. Bien qu'il n'ait pas discuté de ce protocole, nous avons également des dosages de comportement afin de quantifier l'intérêt pour la femelle, comme la latence de monter. En outre, selon l'âge et le niveau d'activité d'un rat individuel, un top de fil peuvent être nécessaires sur la cage lors de l'entraînement pour éviter qu'ils s'échappent. Malgré la variabilité individuelle, nous avons utilisé avec succès ce protocole sur une variété de souches et d'âges pour améliorer vocalisations rapport aux valeurs initiales chaque rat individu.
Les rats sont sensibles aux changements apparemment minimes dans l'environnement, comme les odeurs, la température, et le personnel. Un effort doit être fait pour éviter parfumés produits de soins personnels, comme des lotions, produits pour les cheveux, et les parfums. Avant de tenter de formation, une personne doit être à l'aise d'interagir avec et de manipulation des rats. Par ailleurs, toutes les incohérences dans le personnel ou l'environnement peut affecter la réponse de vocalisation des rats.
Parce que les rats sont des animaux nocturnes, ils doivent être conservés sur un cycle de lumière inversé pour permettre la formation qui aura lieu lors de la partie sombre de leur cycle où elles sont le plus actifs. Nous éclairer notre salle de formation avec des lumières rouges. De plus, si une récompense de l'eau est utilisée lors de l'entraînement, les rats doivent avoir un accès restreint à l'eau. Nos rats sont l'eau restreint pendant 21 heures avant la séance d'entraînement. Trois heures d'exposition à l'eau a été déterminée par nos soins des animaux et des institutionnels Utilisez Comité pour la période la moins restrictive que le temps permis à l'eau pour être utile comme renfort dans nos études de comportement, sans présenter un compromis substantiels à la santé animale ou le bien-être. Les rats ont accès à l'eau à des moments aléatoires (10 minutes à 30 minutes) après la formation et par la suite ont libre accès à l'eau pendant trois heures au cours de la partie sombre de leur cycle de lumière. Les rats doivent être inspectées chaque jour pour des signes de déshydratation et pesé tous les autres jours pour s'assurer qu'il n'ya pas de perte de poids significative (supérieure à 10%). Une restriction alimentaire n'est pas nécessaire si vous utilisez un traitement de la nourriture comme une récompense. Traite spécifiques aux rats sont disponibles commercialement, mais nous avons trouvé un petit morceau d'une céréale sucrée pour être une récompense efficace.
Comme mentionné ci-dessus, les rats femelles en oestrus obtenir une réponse plus vocalises des mâles sexuellement que les non-femelles réceptives. En maintenant un grand nombre de femelles dans la colonie, il ya une forte probabilité que, àAu moins une femme sera en oestrus sur un jour donné. Toutefois, l'oestrus peut aussi être induite pharmacologiquement chez les rats femelles par voie sous-cutanée injectant 10 ug de β-estradiol dans 0,1 cc stériles huile de sésame 48 heures avant la formation suivie par 500 ug de la progestérone dans l'huile de sésame 0,1 cc stériles 4 heures avant l'entraînement. En outre, les rats mâles qui sont naïfs à des rats femelles doivent être sexuellement expérimentés avant la formation vocale. Ceci est accompli en plaçant un rat femelle qui présente des signes de réceptivité sexuelle (dardant, lordose, l'oreille se tortillant) en cage du mâle jusqu'à ce que les montages hommes et éjacule. Les mâles peuvent pas monter au cours des premières séances, et la femelle peut être retiré après masculins montre l'intérêt de la femelle par inhalation et / ou chasser la femelle autour de la cage. Sexuellement vivons est faite une fois par jour pendant deux semaines. Cette période donne aussi l'occasion pour les rats à s'habituer à l'expérimentateur (s) et salle d'enregistrement.
Une limitation de cette méthode est la détermination subjective du type de vocalisation. De plus, ce facteur limite la vitesse de collecte des données, chaque appel doit être examiné de façon indépendante et manuellement classés. S'ajoute à cela l'importance d'avoir des évaluateurs expérimentés qui ont été systématiquement formés à l'identification de vocalisation. Tant la fiabilité intra et inter-évaluateurs devraient être évaluées dans votre propre laboratoire.
En résumé, les vocalisations ultrasoniques chez les rongeurs sont utilisés dans de nombreux modèles différents pour étudier les relations cerveau-comportement, y compris les états émotionnels, la récompense et la dépendance, et des états pathologiques, tels que l'autisme. 6,14-16 Cette nouvelle méthode est un moyen d'étudier les mécanismes sous-jacents ciblés de formation vocale pour le traitement des déficits voix dans le vieillissement et la maladie de Parkinson. Cette méthode a le potentiel pour être appliqué à d'autres modèles de maladies qui affectent la communication et la voix.
Disclosures
Expériences sur les animaux ont été effectuées en conformité avec les directives et les règlements énoncés par la Politique sur les services de santé publique sur les soins aux animaux et l'utilisation des animaux de laboratoire, le guide des NIH pour les soins et l'utilisation des animaux de laboratoire, et l'acte de protection animale. Le protocole d'utilisation d'animaux a été approuvé par le soin des animaux et du Comité institutionnel d'utilisation (IACUC) de l'Université de Wisconsin-Madison School of Medicine et la santé publique.
Acknowledgments
Soutenu par le National Institutes of Health (NIDCD, P30-DC010754, T32-DC009401).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Condenser ultrasound microphone CM16/CMPA | Avisoft BioAcoustics | 40011 | |
| UltraSoundGate 116Hb | Avisoft BioAcoustics | 41161 | |
| Avisoft-RECORDER | Avisoft BioAcoustics | 10201 | |
| Avisoft-SASLab Pro | Avisoft BioAcoustics | 10101 |
References
- Fox, C. M., Morrison, C. E., Ramig, L. O., Sapir, S. Current perspectives on the Lee Silverman Voice Treatment (LSVT) for individuals with idiopathic Parkinson disease. Am J Speech Lang Pathol. 11, 111-123 (2002).
- Roy, N., Stemple, J., Merrill, R. M., Thomas, L. Epidemiology of voice disorders in the elderly: preliminary findings. Laryngoscope. 117, 628-633 (2007).
- Ramig, L. O., Sapir, S., Fox, C., Countryman, S. Changes in vocal loudness following intensive voice treatment (LSVT) in individuals with Parkinson's disease: a comparison with untreated patients and normal age-matched controls. Mov. Disord. 16, 79-83 (2001).
- Sapir, S., Ramig, L. O., Fox, C. The Lee Silverman Voice Treatment® for voice, speech and other orofacial disorders in patients with Parkinson's disease. Future Neurology. 1, 563-570 (2006).
- Panksepp, J., Burgdorf, J. 50-kHz chirping (laughter?) in response to conditioned and unconditioned tickle-induced reward in rats: effects of social housing and genetic variables. Behav. Brain Res. 115, 25-38 (2000).
- Scattoni, M. L., Gandhy, S. U., Ricceri, L., Crawley, J. N. Unusual repertoire of vocalizations in the BTBR T+tf/J mouse model of autism. PLoS One. 3, e3067-e3067 (2008).
- Wohr, M., Houx, B., Schwarting, R. K., Spruijt, B. Effects of experience and context on 50-kHz vocalizations in rats. Physiol. Behav. 93, 766-776 (2008).
- Lahvis, G. P., Alleva, E., Scattoni, M. L. Translating mouse vocalizations: prosody and frequency modulation. Genes Brain Behav. 10, 4-16 (2011).
- Brudzynski, S. M. Communication of adult rats by ultrasonic vocalization: biological, sociobiological, and neuroscience approaches. ILAR J. 50, 43-50 (2009).
- Johnson, A. M., Ciucci, M. R., Russell, J. A., Hammer, M. J., Connor, N. P. Ultrasonic output from the excised rat larynx. J. Acoust. Soc. Am. 128, EL75-EL79 (2010).
- Fulceri, F., Biagioni, F., Lenzi, P., Falleni, A., Gesi, M., Ruggieri, S., Fornai, F. Nigrostriatal damage with 6-OHDA: validation of routinely applied procedures. Ann N Y Acad Sci. 1074, 344-348 (2006).
- Ciucci, M. R., Vinney, L., Wahoske, E. J., Connor, N. P. A translational approach to vocalization deficits and neural recovery after behavioral treatment in Parkinson disease. J. Commun. Disord. 43, 319-326 (2010).
- Ciucci, M. R. Reduction of dopamine synaptic activity: degradation of 50-kHz ultrasonic vocalization in rats. Behav. Neurosci. 123, 328-336 (2009).
- Wright, J. M., Gourdon, J. C., Clarke, P. B. Identification of multiple call categories within the rich repertoire of adult rat 50-kHz ultrasonic vocalizations: effects of amphetamine and social context. Psychopharmacology (Berl). 211, 1-13 (2010).
- Burgdorf, J., Kroes, R. A., Beinfeld, M. C., Panksepp, J., Moskal, J. R. Uncovering the molecular basis of positive affect using rough-and-tumble play in rats: a role for insulin-like growth factor I. Neuroscience. 168, 769-777 (2010).
- Wöhr, M., Schwarting, R. K. Ultrasonic communication in rats: effects of morphine and naloxone on vocal and behavioral responses to playback of 50-kHz vocalizations. Pharmacol Biochem Behav. 94, 285-295 (2009).
