Summary
आवाज विकारों, उम्र बढ़ने और पार्किंसंस रोग में दुर्बल हैं. चूहों की अल्ट्रासोनिक vocalizations भी इन परिस्थितियों से प्रभावित है, इन विकारों की आवाज, उनके तंत्रिका substrates, और व्यवहार हस्तक्षेप के साथ कार्यात्मक वसूली की प्रकृति का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Protocol
1. पूर्व / प्रशिक्षण के बाद रिकॉर्डिंग
- Avisoft रिकॉर्डर के साथ अल्ट्रासोनिक निगरानी चित्रा 2 में दिखाया गया है विन्यास का उपयोग शुरू करो.
- अल्ट्रासोनिक vocalizations या तो नजर रखी जा सकता है नेत्रहीन spectrogram वास्तविक समय देख कर, या मौखिक रूप से headphones के साथ अल्ट्रासाउंड रिकॉर्डिंग अंतरफलक में plugged.
- एक यौन ग्रहणशील (गोमक्खी) विषय नर चूहे के घर पिंजरे में महिला चूहे रखें. मद के लक्षण अग्रकुब्जता, wiggling कान, और तेजी से तेज़ शामिल हैं. मद में महिलाओं गैर यौन ग्रहणशील महिलाओं की तुलना में पुरुषों से अधिक vocalizations प्रकाश में लाना.
- बाद पुरुष महिला (जैसे, सूँघने, का पीछा करते हुए, और / या बढ़ते) में रुचि दिखाई है, महिला को हटा दें और 1-2 मिनट के लिए पुरुष vocalizations रिकॉर्ड.
- यदि पुरुष तुरंत vocalize नहीं करता है, संक्षेप में पुरुष घर पिंजरे महिला चूहे लौटने के लिए वोकलिज़ेशन उत्तेजित.
2. मुखर प्रशिक्षण
- Avisoft रिकॉर्डर के साथ अल्ट्रासोनिक निगरानी चित्रा 2 में दिखाया गया है एक ही विन्यास का उपयोग शुरू करो.
- माइक्रोफोन के तहत अपने घर के पिंजरे में पुरुष चूहा रखें.
- पुरुष घर पिंजरे में एक महिला चूहे रखो. जैसा कि पहले कहा, महिला चूहे मद में पुरुष से वोकलिज़ेशन प्रतिक्रिया को अधिकतम चाहिए.
- एक बार पुरुष महिला में रुचि दिखाई है महिला हटायें.
- तुरंत बाद पुरुष लक्ष्य वोकलिज़ेशन उत्पादन, एक साथ एक कलम क्लिक करें और पानी की बोतल या भोजन का इलाज की एक संक्षिप्त प्रस्तुति के साथ इनाम. प्रारंभ में, किसी भी आवृत्ति 50 kHz के संग्राहक कॉल (चित्रा 5B) पुरस्कृत किया है. के रूप में प्रशिक्षण केवल कॉल की जटिल जैसे तेजी से उत्तराधिकार में 5 से 10 कॉल की तार, तार, प्रगति प्रबलित रहे हैं.
- प्रशिक्षण सत्र जारी रखें जब तक आप 30 reinforcements दिया है. यह आमतौर पर 5 के बीच लेता है 10 मिनट.
3. ध्वनिक विश्लेषण के लिए तैयारी
- हमेशा मूल ध्वनि फ़ाइलों के संग्रह और संपादन और एक काम की नकल पर माप, के रूप में विश्लेषण फ़िल्टरिंग और प्रत्येक फ़ाइल से शोर मिटा की आवश्यकता होगी.
- Avisoft SASLab प्रो के बैच मोड का उपयोग करना, उच्च गुजारें सभी ध्वनि फ़ाइलों के लिए 25 kHz पर विश्लेषण किया जा अल्ट्रासोनिक vocalizations नीचे अवांछित शोर को दूर फिल्टर.
- आदेश में SASLab प्रो स्वत: पता लगाने की सुविधा का उपयोग करने के लिए, शोर दहलीज पहले से निर्धारित किया जाना चाहिए. ऐसा करने के लिए, एक ध्वनि फ़ाइल खोलने के लिए और एक 3 चित्र में दिखाया सेटिंग्स का उपयोग spectrogram बनाने.
- स्वचालित पैरामीटर माप प्रदर्शन चित्रा 4 में दिखाया सेटिंग्स के अनुसार सेटअप किया जाना चाहिए.
- Spectrogram जहाँ वहाँ कोई कॉल या शोर के एक क्षेत्र का पता लगाएं, इस पृष्ठभूमि शोर है.
- "स्वत: (एकल दहलीज)" विकल्प का प्रयोग, स्वचालित पैरामीटर माप सेटअप संवाद बॉक्स के तत्व जुदाई spectrogram ऊपर शक्ति स्पेक्ट्रम विंडो में काला लाइन का समायोजन करके पृष्ठभूमि शोर बस के ऊपर अनुभाग में सीमा निर्धारित है. चित्रा 4 में, दहलीज -55 डीबी के लिए सेट किया गया है.
- संवाद बॉक्स के नीचे सेट, "अस्वीकार अगर शिखर आयाम से कम है" मूल्य पिछले चरण में पाया सीमा से नीचे 1 DB के लिए. इन दो मानों अब सभी ध्वनि विश्लेषण फाइलें, सभी रिकॉर्डिंग सेटिंग्स एक ही थे संभालने के लिए किया जाना चाहिए.
4. वोकलिज़ेशन पहचान
- Vocalizations लेबल स्वत: ऊपर सेट दहलीज का उपयोग करने के लिए, पहले उपरोक्त रूपरेखाओं के साथ एक spectrogram बनाने.
- मैन्युअल रूप से किसी भी शोर है कि मिलता निम्नलिखित मानदंडों को मिटा: 1) गलत तरीके से किया गया है एक वोकलिज़ेशन, 2) के रूप में पहचान की शुरुआत है और / या वोकलिज़ेशन के अंत के भेदभाव को प्रभावित है, और / या 3) गलत तरीके से किया गया है उच्चतम या के रूप में पहचाना वोकलिज़ेशन में सबसे कम आवृत्ति (ऊपरी और निचले लाल लाइनों से संकेत, क्रमशः). वैकल्पिक रूप से, वोकलिज़ेशन लेबल के शुरू / रोक बार नीचे 4.5 कदम में स्थायी लेबल बनाने के बाद मैन्युअल रूप से समायोजित कर सकते हैं. शोर, उच्च और कम आवृत्ति माप को प्रभावित तथापि, मैन्युअल रूप से मिट जाना चाहिए.
- कुछ मामलों में एक वोकलिज़ेशन बिस्तर के हरकत के दौरान ध्वनि के रूप में आसपास के शोर से अलग किया जा करने में सक्षम नहीं होगा. इन मामलों में, कॉल सही नहीं किया जा विश्लेषण कर सकते हैं और मिट जाना चाहिए.
- एक बार सभी vocalizations की पहचान की गई है, स्थायी रूप से ध्वनि फ़ाइल से चुनकर spectrogram के हटाए गए वर्गों को मिटा तरंग से मिट spectrogram वर्गों निकालें ... "उपकरण मेनू ड्रॉप - डाउन से. यदि इस आदेश से पहले spectrogram बंद है निष्पादित नहीं है, सभी मिटा काम खो जाएगा.
- स्वचालित पैरामीटर माप सेटअप विंडो के तत्व पृथक्करण अनुभाग में 'संपादित करें' बटन पर क्लिक करके ध्वनि फ़ाइल में स्थायी लेबल बनाएँ.
- नेत्रहीन और मौखिक रूप से प्रत्येक लेबल वोकलिज़ेशन समीक्षा निर्धारित करने के लिए अपनी श्रेणी: सरल, संग्राहक आवृत्ति (एफएम), या हार्मोनिक. गधाign उचित पूर्व निर्धारित पाठ मॉड्यूल का उपयोग लेबल. प्रत्येक वोकलिज़ेशन श्रेणी के उदाहरणों में चित्रा 5 में दिखाया गया है.
- Spectrogram बंद करने के लिए ध्वनि फ़ाइल को बचाने, और अगले ध्वनि फ़ाइल के साथ जारी रखने के लिए विश्लेषण किया.
5. ध्वनिक माप
- के बाद सभी ध्वनि फ़ाइलों में vocalizations की पहचान की गई है, बैच प्रोसेसिंग उपकरण का उपयोग करें (उपकरण: बैच प्रसंस्करण) को स्वचालित रूप से सभी फ़ाइलों के ध्वनिक मापदंडों को मापने.
- बैच संसाधन संवाद बॉक्स में, ड्रॉप - डाउन मेनू से "स्वचालित पैरामीटर माप" का चयन करें.
- "प्रक्रिया चयनित फ़ोल्डर में सभी फ़ाइलें" चेकबॉक्स का चयन करें तो "फ़ोल्डर" बटन पर क्लिक करें और फ़ोल्डर का चयन करें जहां ध्वनि फ़ाइलें सहेजी जाती हैं.
- पर क्लिक करें "आरंभ" और प्रत्येक फ़ाइल स्वचालित रूप से पिछले स्वचालित पैरामीटर मापन सेटअप संवाद बॉक्स में इस्तेमाल किया सेटिंग्स के अनुसार विश्लेषण किया जाएगा.
- माप है कि DDE पैरामीटर्स / लॉग फ़ाइल की स्थापना के आदेश का उपयोग में परिभाषित किया जा सकता है एक पाठ फ़ाइल में सहेजा जाएगा. यह पाठ फ़ाइल तो सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए एक प्रोग्राम में आयात किया जा सकता है.
6. प्रतिनिधि परिणाम:
चूहों की अल्ट्रासोनिक vocalizations शारीरिक उम्र बढ़ने और 6-OHDA पार्किंसंस रोग मॉडल के साथ जुड़े परिवर्तन से प्रभावित कर रहे हैं 13 आमतौर पर, हम निम्नलिखित मात्रात्मक ध्वनिक मापदंडों की कमी द्वारा विशेषता अल्ट्रासोनिक vocalizations की गुणवत्ता में कमी देखें: बैंडविड्थ, शिखर आवृत्ति , अवधि. , और तीव्रता. आधारभूत: पीडी की प्रेरण, के बाद और वोकलिज़ेशन प्रशिक्षण के बाद, चित्रा 6 पीडी मॉडल में तीन अलग अलग समय बिंदुओं पर एक चूहे की आवृत्ति संग्राहक vocalizations से पता चलता है. पीडी हालत में, कॉल बैंडविड्थ, अवधि, और तीव्रता में कमी को दर्शाता है. इसके अतिरिक्त, आवृत्ति मॉडुलन अनियमित बन गया है.
विशिष्ट ध्वनिक मापदंडों का क्षरण करने के लिए इसके अलावा में, हम भी आयु वर्ग और parkinsonism चूहों में उत्पादित vocalizations के प्रकार में कम समग्र जटिलता निरीक्षण करते हैं. उदाहरण के लिए, पीडी के अधिष्ठापन के बाद एक चूहे की साधारण कॉल और कम आवृत्ति संग्राहक कॉल की एक बड़ी संख्या का उत्पादन. के बाद वोकलिज़ेशन, प्रशिक्षण की अवधि और तीव्रता, दृष्टिकोण आधारभूत स्तर और जटिल कॉल बढ़ जाती है की संख्या (चित्रा 6) के रूप में कई ध्वनिक पैरामीटर,. वृद्ध चूहों उनके अल्ट्रासोनिक vocalizations में ध्वनिक मानकों के समान गिरावट प्रकट. वर्तमान में हम आयु वर्ग के चूहों में मुखर प्रशिक्षण के प्रभाव की जांच कर रहे हैं.
चित्रा 1 प्रति सत्र vocalizations (लक्ष्य प्रत्येक सप्ताह के सभी चूहों से मुलाकात) और वोकलिज़ेशन दर (मतलब है और मानक त्रुटि दिखाया गया है) दोनों (9 मो) युवा और पुराने के एक समूह में एक प्रशिक्षण 6 सप्ताह की अवधि में दोनों वृद्धि (32 की संख्या. मो) फिशर 344/Brown नॉर्वे F1 चूहों.
चित्रा 2 50 kHz vocalizations की तीन श्रेणियों में से प्रत्येक के प्रतिनिधि vocalizations, (ए) सरल, (ख) आवृत्ति संग्राहक, और (सी) हार्मोनिक .
चित्रा 3 (ए) आधारभूत पर एक चूहे, (बी) के बाद पीडी प्रेरण, और (सी) के बाद वोकलिज़ेशन प्रशिक्षण से प्रतिनिधि vocalizations आवृत्ति संग्राहक.
Discussion
चूहों में अल्ट्रासोनिक vocalizations पार्किंसंस रोग जैसे उम्र बढ़ने और रोग प्रक्रियाओं, की चपेट में होना दिखाई देते हैं. ये अल्ट्रासोनिक vocalizations घाटा है कि शारीरिक बीमारी और उम्र बढ़ने के लिए कारण परिवर्तन के साथ सहित मुखर समारोह के एक व्यवहार मॉडल उपलब्ध कराते हैं. इसके अलावा, अल्ट्रासोनिक vocalizations में ध्वनिक परिवर्तन और आसानी से मापा जाता है मात्रा निर्धारित है. इसके अलावा, अल्ट्रासोनिक vocalizations व्यवहार उपायों के माध्यम से संशोधित किया जा सकता है. इसलिए, चूहे अल्ट्रासोनिक vocalizations रोग के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए, उम्र बढ़ने के लिए एक उपयोगी मॉडल, और दोनों व्यवहार और अंतर्निहित neurobiological तंत्र पर उपचारात्मक उपायों प्रदान करते हैं.
हमारे मुखर प्रशिक्षण के एक वातानुकूलित (एक क्लिक करें) उत्तेजना एक सकारात्मक सुदृढीकरण (एक पानी या भोजन का इलाज इनाम) के साथ जुड़े विधि का उपयोग करता है. इनाम द्वारा पीछा क्लिक करने के लिए बढ़ती जटिलता के vocalizations को सुदृढ़ करने के लिए प्रयोग किया जाता है. हम उन है कि 'फ्लैट' कर रहे हैं और बनाए रखने के एक एकल आवृत्ति (चित्रा 5A) बनाम एक "trill" (संग्राहक आवृत्ति) घटक (चित्रा 5B) युक्त उन लोगों के रूप में जटिल vocalizations परिभाषित. इस आवृत्ति संग्राहक घटक आसानी से अपनी sinusoidal उपस्थिति के द्वारा की पहचान की है. जबकि 50 kHz vocalizations पूरी तरह से sinusoidal (चित्रा 5B) हो सकता है, यह अधिक जटिल 50 kHz vocalizations कि इस आवृत्ति संग्राहक के रूप में अच्छी तरह के रूप में घटक आवृत्ति में या तो बड़े कूदता है या एक संक्षिप्त फ्लैट घटक के आंशिक रूप से मिलकर बनता है मुठभेड़ आम बात है. इन अधिक जटिल vocalizations घटकों के बीच कम से कम 10 ms से कम टूटता है, लेकिन एक एकल वोकलिज़ेशन माना जाता सकता है. हालांकि आगे विस्तृत इन vocalizations की अन्य उप वर्गीकरण ऑफ़लाइन संभव है, 14 है कि हम सभी 50 kHz के परिसर के रूप में एक आवृत्ति संग्राहक घटक ऑनलाइन व्यक्तिपरक वर्गीकरण के लिए जरूरत को कम करने और सुदृढीकरण परिवर्तनशीलता को कम युक्त vocalizations वर्गीकृत. अपनी खुद की प्रयोगशाला में यह महत्वपूर्ण है कि कैसे डेटा में वर्गीकृत है और एक अध्ययन डिजाइन है कि अध्ययन का उद्देश्य के लिए उपयुक्त है के अनुसार विश्लेषण करने के लिए चुनते हैं.
वहाँ कई कारकों पर विचार जब इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर रहे हैं. सबसे पहले, आनुवंशिक एकरूपता और प्रक्रियात्मक स्थिरता के बावजूद, चूहों को प्रशिक्षण के लिए एक चर प्रतिक्रिया है. कुछ चूहों को स्वाभाविक रूप से दूसरों, 5 से अधिक vocalize या एक भोजन या पानी इनाम के द्वारा की तुलना में एक महिला और जोखिम से प्रेरित हैं. एक तरह से हम इस परिवर्तनशीलता के लिए खाते में व्यक्तिगत चूहों के आधारभूत vocalizations से उनके बाद घाव और प्रशिक्षण के बाद vocalizations ध्वनिक मापदंडों में परिवर्तन का परीक्षण करके है. हालांकि इस प्रोटोकॉल में चर्चा नहीं है, हम भी व्यवहार assays माउंट विलंबता के रूप में महिला, में रुचि यों. इसके अतिरिक्त, उम्र और गतिविधि के स्तर के एक व्यक्ति चूहे पर निर्भर करता है, एक तार शीर्ष भागने को रोकने के प्रशिक्षण के दौरान घर पिंजरे पर आवश्यक हो सकता है. व्यक्तिगत परिवर्तनशीलता के बावजूद, हम सफलतापूर्वक उपभेदों और प्रत्येक व्यक्ति चूहे आधारभूत सापेक्ष vocalizations सुधार करने के लिए उम्र की एक किस्म पर इस प्रोटोकॉल का उपयोग किया.
चूहे scents, तापमान, और कर्मियों के जैसे प्रतीत होता है छोटे वातावरण में परिवर्तन के प्रति संवेदनशील हैं. एक प्रयास सुगंधित लोशन, बाल उत्पादों, और इत्र के रूप में व्यक्तिगत देखभाल उत्पादों, से बचने के लिए किया जाना चाहिए. प्रशिक्षण प्रयास करने से पहले, एक व्यक्ति सहज हो के साथ बातचीत और चूहों से निपटने चाहिए. इसके अलावा, कर्मियों या वातावरण में किसी भी विसंगतियों 'चूहों वोकलिज़ेशन प्रतिक्रिया को प्रभावित कर सकता है.
चूहों रात कर रहे हैं, क्योंकि वे एक उलट प्रकाश चक्र पर रखा जाना चाहिए करने के अपने चक्र के अंधेरे हिस्से के दौरान जगह ले जब वे सबसे अधिक सक्रिय हैं प्रशिक्षण के लिए अनुमति. हम अपने लाल बत्ती के साथ प्रशिक्षण कमरा रोशन. इसके अलावा, अगर एक पानी इनाम प्रशिक्षण के दौरान प्रयोग किया जाता है, चूहों पानी के लिए प्रतिबंधित पहुँच होनी चाहिए. हमारे चूहों प्रशिक्षण सत्र से पहले 21 घंटे के लिए प्रतिबंधित पानी कर रहे हैं. पानी के जोखिम के तीन घंटे हमारे संस्थागत पशु की देखभाल के द्वारा निर्धारित किया गया था और समिति के प्रयोग के कम से कम प्रतिबंधक समय अवधि है कि पानी के सुदृढीकरण के रूप में हमारे व्यवहार के अध्ययन में उपयोगी पशु स्वास्थ्य या अच्छी तरह से किया जा रहा करने के लिए पर्याप्त समझौता पेश बिना अनुमति है. चूहे प्रशिक्षण के बाद यादृच्छिक समय (30 मिनट से 10 मिनट) पर पानी तक पहुँच दी जाती है और बाद में तीन घंटे के लिए उनके प्रकाश चक्र के अंधेरे भाग के दौरान पानी के लिए मुफ्त का उपयोग किया है. चूहे निर्जलीकरण के लक्षण के लिए हर दिन निरीक्षण किया जाना चाहिए और हर दूसरे दिन वजन करने के लिए सुनिश्चित करें वहाँ कोई महत्वपूर्ण वजन घटाने (10% से अधिक) है. एक इनाम के रूप में एक भोजन का इलाज का उपयोग कर यदि एक खाद्य प्रतिबंध आवश्यक नहीं है. व्यवहार करता है चूहों के लिए विशिष्ट व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं, लेकिन हम एक मीठा अनाज का एक छोटा सा टुकड़ा के लिए एक प्रभावी इनाम पाया है.
जैसा कि ऊपर उल्लेख किया है, मद में मादा चूहों गैर यौन ग्रहणशील महिलाओं की तुलना में पुरुषों से एक उच्च वोकलिज़ेशन प्रतिक्रिया प्रकाश में लाना. कॉलोनी में महिलाओं की एक बड़ी संख्या को बनाए रखने से, वहाँ एक उच्च संभावना है कि परकम से कम एक महिला किसी भी दिन पर मद में किया जाएगा. हालांकि, मद भी pharmacologically subcutaneously 0.1 सीसी बाँझ तिल का तेल 48 घंटे में β-estradiol के 10 μg 0.1 सीसी बाँझ तिल का तेल 4 घंटे पहले प्रशिक्षण में 500 μg progesterone के द्वारा पीछा प्रशिक्षण के लिए पहले इंजेक्शन द्वारा मादा चूहों में प्रेरित किया जा. इसके अतिरिक्त, नर चूहों कि मादा चूहों को अनुभवहीन हैं यौन मुखर प्रशिक्षण से पहले अनुभवी चाहिए. यह एक महिला चूहे कि पुरुष mounts और ejaculates जब तक पुरुष के घर पिंजरे में यौन ग्रहणशीलता के लक्षण (सवेग, अग्रकुब्जता कान wiggling) का प्रदर्शन कर रहा है रखने के द्वारा पूरा किया है. नर पहले कुछ सत्रों के दौरान नहीं माउंट और महिला सूँघने और / या पिंजरे के आसपास का पीछा करते हुए महिला द्वारा महिला में पुरुष से पता चलता है ब्याज के बाद हटाया जा सकता है है हो सकता है. यौन अनुभव एक बार एक दिन में दो सप्ताह के लिए किया जाता है. इस समय अवधि भी चूहों के लिए (ओं) experimenter और रिकॉर्डिंग के कमरे के लिए अभ्यस्त करने के लिए एक अवसर प्रदान करता है.
इस विधि के लिए एक सीमा वोकलिज़ेशन प्रकार के व्यक्तिपरक दृढ़ संकल्प है. इसके अलावा, इस पहलू डेटा संग्रह की गति की सीमा, प्रत्येक कॉल के रूप में स्वतंत्र और जांच चाहिए मैन्युअल वर्गीकृत. इस अनुभवी रेटर जो लगातार वोकलिज़ेशन पहचान में प्रशिक्षित किया गया है होने के महत्व है. दोनों अंतर और अंतर - करदाता विश्वसनीयता अपनी खुद की प्रयोगशाला के भीतर मूल्यांकन किया जाना चाहिए.
सारांश में, कृन्तकों में अल्ट्रासोनिक vocalizations कई विभिन्न मॉडलों में इस्तेमाल किया जाता है भावनात्मक राज्यों, इनाम और लत और autism के रूप में रोग राज्यों सहित मस्तिष्क व्यवहार रिश्तों का अध्ययन 6,14-16 इस उपन्यास विधि अध्ययन करने के लिए के लिए एक रास्ता है. उम्र बढ़ने और पार्किंसंस रोग में आवाज घाटे के उपचार के लिए लक्षित मुखर प्रशिक्षण अंतर्निहित तंत्र. इस विधि के अन्य रोग मॉडल है जो संचार और आवाज को प्रभावित करने के लिए लागू होने की संभावना है.
Disclosures
जानवरों पर प्रयोग इंसानियत और प्रयोगशाला पशु, और प्रयोगशाला पशुओं की देखभाल और उपयोग के लिए NIH गाइड, और पशु कल्याण अधिनियम की देखभाल का प्रयोग करें पर सार्वजनिक स्वास्थ्य सेवा नीति के द्वारा निर्धारित दिशा निर्देशों और नियमों के अनुसार में प्रदर्शन किया गया. जानवर उपयोग प्रोटोकॉल संस्थागत पशु की देखभाल और चिकित्सा और सार्वजनिक स्वास्थ्य के स्कूल मैडिसन विस्कॉन्सिन विश्वविद्यालय का प्रयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया था.
Acknowledgments
स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान (NIDCD, p30-DC010754, T32-DC009401) द्वारा समर्थित है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Condenser ultrasound microphone CM16/CMPA | Avisoft BioAcoustics | 40011 | |
| UltraSoundGate 116Hb | Avisoft BioAcoustics | 41161 | |
| Avisoft-RECORDER | Avisoft BioAcoustics | 10201 | |
| Avisoft-SASLab Pro | Avisoft BioAcoustics | 10101 |
References
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