Formação específica de vocalizações ultra-som em ratos idosos e Parkinson

Summary

Distúrbios da voz são debilitantes no envelhecimento e na doença de Parkinson. As vocalizações ultra-sônicos de ratos, também afetados por essas condições, pode ser usado para estudar estes distúrbios da voz, seus substratos neurais, ea natureza da recuperação funcional com intervenção comportamental.

Abstract

Déficits de voz são uma complicação comum de ambos doença de Parkinson (PD) e do envelhecimento, pois eles podem diminuir significativamente a qualidade de vida, impactando habilidades de comunicação ^{1, 2} acções de formação específicas (fala / terapia voz) pode melhorar déficits específicos de ^{voz, 3, 4,} embora o. mecanismos subjacentes das intervenções comportamentais não são bem compreendidos. Investigação sistemática de déficits de voz e terapia deve considerar muitos fatores que são difíceis de controlar em humanos, tais como idade, ambiente familiar, idade pós-início da doença, gravidade da doença e medicamentos. O método apresentado aqui usa um modelo animal de vocalização que permite o estudo sistemático de como mudar os mecanismos subjacentes sensório-motora com o treinamento de voz-alvo. Os procedimentos de ultra-som de gravação e análise descrita neste protocolo são aplicáveis ​​a qualquer investigação de vocalizações ultra-sônicas de roedores.

As vocalizações ultra-sônica de roedores estão emergindo como um modelo valioso para investigar os substratos neurais do comportamento. ^5-8 roedores e vocalizações Ambos os humanos carregam valor semiótico e são produzidos por modificar um fluxo de ar egressive com uma constrição da laringe. ^{9, 10} Assim, vocalizações de roedores pode ser um modelo útil para estudar os déficits de voz em um contexto sensório-motor. Além disso, modelos de ratos nos permitem estudar os fundamentos neurobiológicos da recuperação de déficits com formação específica.

Para o modelo PD usamos Long-Evans ratos (Charles River Laboratories International, Inc.) e induzir parkinsonismo por uma infusão unilateral de 7 mg de 6 hidroxidopamina (6-OHDA) no feixe medial do prosencéfalo que causa degeneração moderada a grave de pré-sináptica neurônios estriatais (ver detalhes Ciucci, 2010). ^{11, 12} Para o nosso modelo de envelhecimento usamos a Fischer 344/Brown Noruega F1 (National Institute on Aging).

Nosso principal método para vocalizações provocando é expor sexualmente experientes ratos machos sexualmente receptiva a ratas. Quando o macho se torna interessado na fêmea, a fêmea é removida e os do sexo masculino continua a vocalizar. Recompensando vocalizações complexas com comida ou água, tanto o número de vocalizações complexas ea taxa de vocalizações pode ser aumentada (Figura 1).

Um microfone ultra-sônico montado acima da gaiola do macho casa registra as vocalizações. A gravação começa após a rata é removido para isolar a chama do sexo masculino. Vocalizações podem ser visualizados em tempo real para a formação ou gravados e analisados ​​offline. Pela gravação e análise acústica vocalizações antes e após o treinamento vocal, os efeitos da doença ea restauração da função normal com o treinamento pode ser avaliado. Este modelo também permite-nos relacionar o comportamento observado (vocal) melhorias a mudanças no cérebro e do sistema neuromuscular.

Protocol

1. Pré / pós-treinamento Recordings

1. Iniciar o monitoramento ultra-som com Avisoft Recorder usando a configuração mostrada na Figura 2.
2. Vocalizações ultra-som pode ser monitorado, ou visualmente, observando o espectrograma em tempo real, ou sonoros com fones de ouvido conectado à interface de gravação ultra-som.
3. Coloque um sexualmente receptiva rato (no cio) do sexo feminino na gaiola do rato sujeito masculino. Sinais de estro incluem ouvido lordose, wiggling, rápida e arremessando. Fêmeas em estro obter mais vocalizações dos machos do que fêmeas não-sexualmente receptiva.
4. Depois que o macho tem mostrado interesse no sexo feminino (por exemplo, cheirar, perseguindo, e / ou montagem), retire a fêmea e gravar vocalizações do macho por 1-2 minutos.
5. Se o macho não vocalize imediatamente, voltar brevemente o rato fêmea para gaiola do macho em casa para estimular a vocalização.

2. Treinamento Vocal

1. Iniciar o monitoramento ultra-som com Avisoft Recorder usando a mesma configuração mostrada na Figura 2.
2. Coloque o rato macho em sua gaiola casa sob o microfone.
3. Colocou um rato fêmea na gaiola do macho para casa. Como dito anteriormente, o rato fêmea deve estar no cio para maximizar a resposta vocalização do macho.
4. Uma vez que o macho tem mostrado interesse em remover a fêmea a fêmea.
5. Imediatamente após o macho produz a vocalização alvo, recompensa simultaneamente com um clique caneta e uma breve apresentação da garrafa de água ou tratamento de alimentos. Inicialmente, qualquer 50 kHz Frequência de chamada (Figura 5B) modulada é recompensado. Como o treinamento progride apenas strings cada vez mais complexas de chamadas, tais como cordas de 5 a 10 chamadas em rápida sucessão, são reforçadas.
6. Continue a sessão de treinamento até que você tenha dado 30 reforços. Isso normalmente demora entre 5-10 minutos.

3. Preparação para Análise Acústica

1. Sempre arquivar os arquivos de som original e fazer edições e medições em uma cópia de trabalho, como a análise exigirá filtragem e apagar o ruído de cada arquivo.
2. Usando o modo de lote de Avisoft SASLab Pro, filtro de alta freqüência todos os arquivos de som para ser analisada a 25 kHz para remover ruídos indesejados abaixo do vocalizações ultra-sônica.
3. A fim de utilizar o recurso de detecção automática de SASLab Pro, o limiar de ruído deve primeiro ser determinado. Para fazer isso, abra um arquivo de som e criar um espectrograma usando as configurações mostradas na Figura 3.
4. O parâmetro de visualização automática de medições devem ser configurados de acordo com as configurações mostradas na Figura 4.
5. Encontrar uma área de espectrograma onde não há chamadas ou ruídos, este é o ruído de fundo.
6. Usando o "automático (único limiar)" opção, definir o limite na seção de separação Elemento da caixa de diálogo Parâmetro Medições automáticas de configuração para um pouco acima do ruído de fundo, ajustando a linha preta na janela de espectro de potência acima do espectrograma. Na Figura 4, o limite foi definido para -55 dB.
7. Na parte inferior da caixa de diálogo, defina o "Rejeitar se amplitude de pico é inferior a" valor para 1 dB abaixo do limiar encontrado no passo anterior. Esses dois valores devem agora ser usado para todos os arquivos de som analisados, assumindo todas as configurações de gravação foram os mesmos.

4. Identificação vocalização

1. Para rotular as vocalizações usando o limite automático acima referidos, primeiro criar um espectrograma com as configurações acima.
2. Manualmente apagar qualquer ruído que atenda aos seguintes critérios: 1) tem sido erroneamente identificado como vocalização, 2) está afetando a discriminação do início e / ou no final da vocalização, e / ou 3), foi erroneamente identificada como a mais alta ou menor freqüência na vocalização (indicado pelas linhas superior e inferior vermelha, respectivamente). Alternativamente, os tempos de start / stop dos rótulos de vocalização pode ser ajustado manualmente após a criação de etiquetas permanentes no passo 4.5. Ruído que afetam as medições de freqüência de alta e baixa, no entanto, devem ser manualmente apagados.
3. Em alguns casos, uma vocalização não será capaz de ser separado do ruídos circundantes, tais como o som de cama durante a locomoção. Nestes casos, a chamada não pode ser precisamente analisados ​​e devem ser apagados.
4. Uma vez que todas as vocalizações foram identificados, apagar permanentemente as seções excluído do espectrograma do arquivo de som, selecionando "Remove seções espectrograma apagado da onda ..." no Ferramentas menu drop-down. Se este comando não é executado antes do espectrograma está fechado, todo o trabalho de apagar será perdido.
5. Criar etiquetas permanentes no arquivo de som clicando no botão "Editar" na seção Separação Elemento da janela de configuração automática de parâmetros Medições.
6. Visualmente e auditivamente analisar cada vocalização rotulados para determinar a sua categoria: de freqüência, simples modulada (FM), ou harmônica. Burroign o rótulo apropriado usando a pré-definidos texto módulos. Exemplos de cada categoria de vocalização são mostrados na Figura 5.
7. Fechar o espectrograma, salve o arquivo de som, e continuar com o arquivo de som próximo a ser analisado.

5. As medições acústicas

1. Depois de vocalizações em todos os arquivos de som foram identificados, use a ferramenta de processamento em lote (Ferramentas: Batch Processing) para medir os parâmetros acústicos de todos os arquivos.
2. Na caixa de diálogo Batch processamento, selecione "Medidas de parâmetros automático" no menu drop-down.
3. Selecione o "processo de todos os arquivos na pasta selecionada" checkbox e clique em "pasta" e selecione a pasta onde os arquivos de som são salvos.
4. Clique em "Iniciar" e cada arquivo será automaticamente analisado de acordo com as últimas configurações usadas na caixa de medição automática de parâmetros de diálogo de configuração.
5. As medições serão salvos em um arquivo de texto que pode ser definida de acordo com os Parâmetros DDE / Log comando configuração do arquivo. Este arquivo texto pode ser importado para um programa de análise estatística.

6. Resultados representativos:

Vocalizações ultra-sônicos de ratos são afetados por mudanças fisiológicas associadas ao envelhecimento e 6-OHDA modelos doença de Parkinson ¹³ Normalmente, vemos uma redução na qualidade das vocalizações ultra-som caracterizado por uma redução dos seguintes parâmetros acústicos quantitativos:. Largura de banda, freqüência de pico, duração e intensidade. A Figura 6 mostra as vocalizações freqüência modulada de um rato no modelo de PD em três momentos diferentes: basal, após a indução da DP, e depois do treino de vocalização. Na condição de PD, a chamada mostra uma redução na largura de banda, intensidade, duração e. Além disso, a modulação de freqüência tornou-se irregular.

Para além da degradação de determinados parâmetros acústicos, observamos também menor complexidade geral nos tipos de vocalizações produzida nos ratos idosos e parkinsonismo. Por exemplo, após a indução da PD um rato produz um maior número de chamadas simples e menos chamadas de frequência modulada. Vocalização de treinamento seguintes, muitos parâmetros acústicos, tais como duração e intensidade, os níveis basais de aproximação e aumenta o número de complexas chamadas (Figura 6). Ratos idosos manifesta degradação dos parâmetros acústicos semelhantes em suas vocalizações ultra-sônica. Estamos investigando os efeitos do treinamento vocal em ratos idosos.

Figura 1. Número de vocalizações por sessão (alvo cumpridas por todos os ratos a cada semana) e taxa de vocalização (média e erro padrão mostrado) tanto o aumento ao longo de um período de treinamento de 6 semanas em um grupo de dois jovens (9 meses) e velhos (32 mo) ratos Fischer 344/Brown Noruega F1.

Figura 2 vocalizações representante de cada uma das três categorias de vocalizações 50 kHz;. (A) simples, (B) freqüência modulada, e (C) harmônica.

Figura 3. Representante freqüência modulada vocalizações a partir de um único rato em (A) base, (B) indução pós-PD, e (C) após a formação de vocalização.

Discussion

Vocalizações ultra-sônicas em ratos parecem ser vulneráveis ​​ao envelhecimento e doença processos, tais como a doença de Parkinson. Estas vocalizações ultra-sônicas fornecer um modelo de comportamento da função vocal, incluindo déficits que acompanhar as mudanças fisiológicas, devido a doenças e envelhecimento. Além disso, mudanças acústico em vocalizações ultra-sônicas são facilmente medidos e quantificados. Além disso, vocalizações ultra-som pode ser modificada através de intervenções comportamentais. Portanto, vocalizações ultra-sônicas rato fornecer um modelo útil para estudar o impacto da doença, envelhecimento e intervenções terapêuticas em ambos os comportamentos e mecanismos neurobiológicos subjacentes.

Nosso método de treinamento vocal usa um estímulo condicionado (um clique) associado a um reforço positivo (recompensa tratar a água ou comida). O clique em seguida a recompensa é usada para reforçar vocalizações de complexidade crescente. Nós definimos vocalizações complexas como as que contêm um "trinado" (frequência modulada) componente (Figura 5B) versus aqueles que são "flat" e manter uma única freqüência (Figura 5A). Este componente de freqüência modulada é facilmente identificado por sua aparência senoidal. Enquanto 50 kHz-vocalizações podem ser inteiramente sinusoidal (Figura 5B), é comum encontrar mais complexa 50 kHz-vocalizações, que consistem em parte deste componente de freqüência modulada, bem como quer grandes saltos em freqüência ou um componente breve plana. Estas vocalizações mais complexas podem ter pequenos intervalos de menos de 10 ms entre os componentes, mas são considerados uma vocalização única. Embora mais detalhada sub-classificação destas vocalizações é possível offline, nós classificamos todos os ¹⁴ vocalizações de 50 kHz contendo um componente de freqüência modulada tão complexo para reduzir a necessidade de classificação subjetiva on-line e reduzir a variabilidade de reforço. Em seu próprio laboratório, é importante escolher como os dados são classificados e analisados ​​de acordo com um projeto de estudo que é apropriado para o propósito do estudo.

Há muitos fatores a considerar quando se usa esse protocolo. Primeiro de tudo, apesar de homogeneidade genética e consistência processual, os ratos têm uma resposta variável ao treinamento. Alguns ratos naturalmente vocalize mais do que outros, ⁵ ou são motivados por exposição a uma mais mulheres do que por uma recompensa de comida ou água. Uma maneira de explicar essa variabilidade é examinando a alteração dos parâmetros acústicos de vocalizações ratos individuais "linha de base para a sua pós-lesão e pós-treinamento vocalizações. Embora não discutido neste protocolo, também temos ensaios comportamentais para quantificar o interesse na mulher, tais como a latência para montar. Além disso, dependendo da idade e nível de atividade de um rato individual, uma parte superior dos fios pode ser necessária na gaiola durante o treino para evitar fugas. Apesar da variabilidade individual, temos utilizado com sucesso este protocolo em uma variedade de linhagens e idades para melhorar vocalizações em relação à linha de base cada rato indivíduo.

Ratos são sensíveis a mudanças aparentemente pequenas no meio ambiente, tais como aromas, a temperatura, e pessoal. Um esforço deve ser feito para evitar scented produtos de cuidados pessoais, tais como loções, produtos de cabelo e perfumes. Antes de tentar a formação, o indivíduo deve ser confortável e interagindo com manipulação de ratos. Além disso, as inconsistências de pessoal ou de ambiente pode afetar a resposta dos ratos de vocalização.

Porque os ratos são noturnos, eles devem ser mantidos em um ciclo de luz revertida para permitir a formação a ter lugar durante a parte escura do seu ciclo de quando eles estão mais ativos. Nós iluminar a nossa sala de treinamento com luzes vermelhas. Além disso, se uma recompensa a água é utilizada durante o treinamento, os ratos devem ter acesso restrito à água. Nossos ratos são água restrito a 21 horas antes da sessão de treinamento. Três horas de exposição à água foi determinada pelo nosso Animal Care Use Institucional e Comitê para ser o período mínimo de tempo restritivas que permitiu que a água para ser útil como reforço em nossos estudos comportamentais sem apresentar um compromisso substancial para a saúde animal ou bem-estar. Ratos têm acesso à água em momentos aleatórios (10 minutos a 30 minutos) após o treinamento e, posteriormente, têm livre acesso à água por três horas durante a parte escura do seu ciclo de luz. Ratos devem ser inspecionados diariamente para detectar sinais de desidratação e pesava todos os dias para garantir que não haja perda de peso significativa (superior a 10%). A restrição alimentar não é necessário se utilizar um tratamento de alimentos como uma recompensa. Trata específicos para ratos estão comercialmente disponíveis, mas temos encontrado um pequeno pedaço de um cereal com açúcar a ser uma recompensa eficaz.

Como mencionado acima, ratas em estro obter uma resposta maior vocalização dos machos do que fêmeas não-sexualmente receptiva. Através da manutenção de um grande número de mulheres na colônia, há uma grande probabilidade de que apelo menos uma fêmea no cio será em um determinado dia. No entanto, o estro também pode ser farmacologicamente induzida em ratas por via subcutânea injetar 10 mg de β-estradiol em 0,1 cc estéril de óleo de gergelim 48 horas antes do treino seguido por 500 mg de progesterona em 0,1 cc de óleo de gergelim estéril quatro horas antes do treino. Além disso, os ratos do sexo masculino que são ingênuo ratas devem ser sexualmente experientes antes do treinamento vocal. Isto é conseguido colocando uma ratazana que está exibindo sinais de receptividade sexual (dardo, lordose ouvido, balançando) na gaiola do macho em casa até as montagens do sexo masculino e ejacula. Os machos não podem montar durante as primeiras sessões ea fêmea podem ser removidos após o interesse do sexo masculino mostra na mulher por cheirar e / ou perseguindo a fêmea ao redor da gaiola. Sexualmente experimentando é feito uma vez ao dia por duas semanas. Este período de tempo também fornece uma oportunidade para ratos habituar ao experimentador (s) e sala de gravação.

Uma limitação deste método é a determinação subjetiva do tipo de vocalização. Além disso, esse fator limita a velocidade de coleta de dados, já que cada chamada deve ser independente examinados e classificados manualmente. Relacionado a isso está a importância de ter avaliadores experientes, que têm sido constantemente treinados na identificação de vocalização. A confiabilidade intra e inter-avaliador deve ser avaliada dentro do seu próprio laboratório.

Em resumo, vocalizações ultra-sônicas em roedores são utilizados em muitos modelos diferentes para estudar as relações cérebro-comportamento, incluindo estados emocionais, recompensa e vício, e estados de doença, como o autismo. ^6,14-16 método Este romance é uma forma de estudar a mecanismos subjacentes alvo de treinamento vocal para o tratamento de déficits de voz no envelhecimento e na Doença de Parkinson. Este método tem o potencial de ser aplicado a modelos de outras doenças que afetam a comunicação e voz.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Condenser ultrasound microphone CM16/CMPA	Avisoft BioAcoustics	40011
UltraSoundGate 116Hb	Avisoft BioAcoustics	41161
Avisoft-RECORDER	Avisoft BioAcoustics	10201
Avisoft-SASLab Pro	Avisoft BioAcoustics	10101