Summary
Hier beschrijven we een plasmide overexpressie scherm in
Abstract
De gist Saccharomyces cerevisiae, is een krachtig model systeem voor het definiëren van fundamentele mechanismen van de vele belangrijke cellulaire processen, waaronder die met directe relevantie voor de menselijke ziekte. Vanwege de korte generatietijd en goed gekarakteriseerd genoom, een grote experimentele voordeel van de gist modelsysteem is de mogelijkheid om genetische screens uit te voeren om genen en paden die betrokken zijn bij een bepaald proces te identificeren. In de afgelopen dertig jaar een dergelijke genetische screens zijn gebruikt om de celcyclus, secretieroute, en nog veel meer sterk geconserveerde aspecten van de eukaryote cel biologie 1-5 toe te lichten. In de afgelopen jaren zijn er verschillende genoomwijde bibliotheken van gist stammen en plasmiden is gegenereerd 6-10. Deze collecties nu zorgen voor de systematische ondervraging van gen-functie met behulp van winst-en verlies-van-functie benaderingen 11-16. Hier hebben we een gedetailleerd protocol voor het gebruik van een high-throughput gist transformatie protocol met een liquid handling robot aan een plasmide overexpressie scherm uit te voeren, met behulp van een gekleed bibliotheek van 5.500 gist plasmiden. We hebben gebruik gemaakt van deze schermen aan genetische factoren van toxiciteit in verband met de accumulatie van aggregatie-gevoelige humane neurodegeneratieve ziekten eiwitten te identificeren. De methoden die hier gepresenteerd zijn gemakkelijk aan te passen aan de studie van andere cellulaire fenotypes van belang.
Protocol
1. De voorbereidingen voor gist transformatie
Dit protocol is bedoeld voor tien 96-wells platen, maar kan worden opgeschaald naar boven of beneden aangepast. We hebben ontdekt dat dit protocol niet goed werkt voor meer dan twintig 96-well platen per ronde van transformatie. De gehele transformatie procedure (vanaf stap I.3) duurt ongeveer acht uur.
- Aliquot 5-10μL van plasmide DNA (100 ng / ul) van de gist FLEXGene ORF bibliotheek in elke well van een ronde bodem 96-well plaat met Biorobot RapidPlate vloeistof handler. Plaats 96-well platen ontdekt in schone bench zuurkast 's nachts om te drogen. Wij hebben gevonden soortgelijke transformatie efficiëntie met CEN en 2μ gist plasmiden.
- Inoculeren 200mL van gist pepton dextrose (YPD) media (10 g / L gistextract, 20 g / L pepton, 20 g / L glucose) met vragen stam in een 500ml verbijsterd erlenmeyer. Incubeer overnacht bij 30 ° C onder schudden (200 rpm). Indien gewenst kan selectieve media ook worden gebruikt voor deze starter culturen.
- De volgende ochtend, verdunnen de query stam tot OD 600 = 0,1 in 2L van YPD. Schud voor 4-6 uur bij 30 ° C (200 rpm), totdat de cultuur in OD 600 = 0.8 tot 1.0. Voor een optimale groei, groeien twee culturen 1L in afzonderlijke 2,8 L verbijsterd kolven. Indien gewenst kan selectieve media ook worden gebruikt in plaats van YPD.
2. Gist transformatie
- Oogst cellen door centrifugeren. Vult vier disposable 225ml conische buizen met gistcultuur en draaien op 3000rpm (~ 1800 xg) voor 5 minuten in tafelblad centrifuge (Eppendorf 5810R). Giet supernatant en herhaal tot alle cellen worden geoogst.
- Was de cellen in 200mL van geautoclaveerd gedistilleerd H 2 O. Resuspendeer celpellet door schudden of vortexen. Combineer cellen in een 225 ml conische buis. Draaien op 3000rpm gedurende 5 minuten. Verwijder supernatant.
- Bereid 0.1MLiOAc/1XTE oplossing (0,1 M LiOAc, 10mm Tris, 1 mM EDTA, pH 8 in geautoclaveerd gedestilleerd water). Was de cellen in 100 ml 0.1MLiOAc/1XTE. Draaien op 3000rpm gedurende 5 minuten. Verwijder supernatant.
- Resuspendeer cel pellet in 70 ml 0,1 M LiOAc/1xTE. Schudden en / of vortex om ervoor te zorgen pellet volledig geresuspendeerd.
- Incubeer met schudden bij 30 ° C gedurende 30 minuten (200 rpm).
- Voeg β-mercapto-ethanol op 0,1. Incubeer met schudden bij 30 ° C gedurende 30 minuten (200 rpm). Opmerking: Deze stap kan worden overgeslagen bij gebruik van gist stammen die gevoelig zijn voor β-mercapto-ethanol. We hebben ontdekt dat deze stap niet is essentieel voor een succesvolle transformatie, maar het doet verbeteren transformatie-efficiëntie.
- Kook 2 ml gesoniceerd zalmsperma DNA (10mg/mL) gedurende 15 minuten, en daarna chillen op ijs.
- Voeg 2 ml gekookt zalmsperma DNA naar cel mengsel. Let op: een neerslag kan ontstaan bij toevoeging van de zalm sperma-DNA naar de cel mengsel. Met behulp van een Pipetman en 200 ul tip, verwijder voorzichtig alle neerslag die zich vormt, omdat dit kan interfereren met stroomafwaarts pipetteren.
- Aliquot 50μL van cel mengsel aan elke well van de 96-wells plaat met behulp van de BioRobot Rapidplate (kan ook gebruik maken van multi-channel pipet). Gaan niet samen.
- Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten zonder schudden.
- Bereid 200 ml 40% PEG-3350/10% DMSO/0.1M LiOAc (160ml van 50% PEG-3350, 20 ml DMSO, 20 ml 1M LiOAc). Maak een oplossing onmiddellijk voor gebruik.
- Voeg 125μL van de PEG / LioAc / DMSO oplossing voor elk putje. Meng door opzuigen en doseren celsuspensie acht keer met RapidPlate.
- Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten zonder schudden.
- Heat shock de cellen bij 42 ° C gedurende 15 minuten in een droge incubator. Niet stapelen platen. Opmerking: We hebben gemerkt dat deze heat shock stap niet is essentieel voor een succesvolle transformatie. Voor bepaalde giststammen (bijvoorbeeld, temperatuur gevoelige mutanten), heat shock is schadelijk. We hebben eerder verlaagde de heat shock tijd om een minuut en in staat zijn geweest om met succes te transformeren een giststam drager zijn van een ypt1 temperatuurgevoelige mutatie met behulp van dit protocol.
- Spin platen bij 2500rpm (~ 1100 xg) voor 5 minuten, met behulp centrifuge adapters voor 96-well platen tegemoet te komen. Verwijder de PEG-oplossing door het omkeren van platen over afval emmer. Blot omgekeerd bord op papier handdoek om de resterende vloeistof te verwijderen (cellen zullen blijven aan de onderkant van putten).
- Spoel cellen door het toevoegen van 200μL van minimale media (bijv. SD /-Ura) aan elk putje met RapidPlate.
- Spin platen op 2500rpm gedurende 5 minuten en verwijder supernatant door het omkeren van meer dan afval emmer en blotting op keukenpapier.
- Voeg 200μL van minimale media (bijv. SD /-Ura) aan elk putje met RapidPlate.
- Incubeer bij 30 ° C gedurende 2 dagen zonder schudden. Na 2 dagen, moeten kleine kolonies van cellen beginnen te vormen op de bodem van iedere succesvolle goed getransformeerd.
3. Spotting assay
- Doseer 200μL van raffinose op basis van minimale media (bijv. SRaf /-Ura) in elk putje vaneen nieuwe vlakke bodem 96-well plaat.
- Meng elke well van transformatie plaat door opzuigen en doseren celsuspensie acht keer met Rapidplate.
- Inoculeren SRaf platen met 5μL van cel-mengsel uit de transformatie plaat.
- Incubeer bij 30 ° C gedurende een dag. Kleine kolonies aanwezig zou moeten zijn aan de onderkant van elk putje na een dag.
- Spot kolonies op SD /-Ura en SGal /-Ura platen in capuchon. Steriliseer 96-bout replicator (Frogger) door flamberen. Meng kolonies met Frogger voor de vlekken op selectieve media platen. Na het spotten, laat platen te drogen in de kap voor 5-10 minuten.
- Incubeer bij 30 ° C gedurende 2-3 dagen.
Foto platen met digitale camera, en visueel te vergelijken groei van de kolonies op SGal /-Ura platen om kolonies, waarin vraag stam toxiciteit wordt versterkt (tragere groei / minder dichte kolonies) of onderdrukt (een snellere groei / meer dichte kolonies) te vinden.
4. Representatieve resultaten:
Figuur 1. Gist plasmide overexpressie scherm om onderdrukkers en versterkers van TDP-43 toxiciteit te identificeren. TDP-43 is een menselijk eiwit dat is betrokken bij de pathogenese van amyotrofe laterale sclerose (ziekte van Lou Gehrig). Cytoplasmatische aggregaten van TDP-43 zich ophopen in de hersenen en het ruggenmerg neuronen van ALS patiënten 17. Uiten van TDP-43 in gist cellen resulteert in aggregatie en cytotoxiciteit 18. We hebben gebruik gemaakt van dit model systeem om mechanismen van TDP-43 toxiciteit 19,20 definiëren. Getoond worden repesentative voorbeelden van platen uit onze gist TDP-43 toxiciteit modifier scherm. Deze platen weer kolonies met een geïntegreerde galactose-induceerbare TDP-43 plasmide en ook getransformeerd met plasmiden uit de FLEXGene ORF uitdrukking bibliotheek. De plaat aan de linkerkant bevat glucose, die expressie van TDP-43 of de FLEXGene plasmiden onderdrukt. De plaat aan de rechterkant bevat galactose, die de expressie van TDP-43 en de ORF's in de FLEXGene plasmiden induceert. De groene pijlpunt geeft een kolonie getransformeerd met een plasmide dat de toxiciteit van TDP-43 onderdrukt. De rode pijlpunt geeft een kolonie getransformeerd met een plasmide dat de toxiciteit van TDP-43 verbetert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier presenteren wij een protocol om een high-throughput plasmide overexpressie screen in gist uit te voeren. Deze aanpak maakt het mogelijk om snelle en onpartijdige screening op genetische factoren van een groot aantal verschillende cellulaire fenotypes. Met behulp van deze aanpak, een onderzoeker kan een aanzienlijk deel van de gist genoom scherm in een kwestie van weken. Deze onpartijdige aanpak maakt het ook mogelijk voor de identificatie van modifiers, die niet mag worden voorspeld op basis van eerdere bevindingen. We hebben gebruik gemaakt van deze aanpak voor modifiers van toxiciteit in verband met de samenvoeging van de menselijke neurodegeneratieve ziekte eiwitten 19,21-23 te identificeren. Echter, ten gevolge van het aanpassingsvermogen van dit protocol om andere cellulaire processen te bestuderen, zal dit protocol nuttig zijn om onderzoekers het aanpakken van een breed scala aan belangrijke biologische vragen. Zo hebben we ook gevonden deze screening nuttig voor het identificeren van genen en routes die betrokken zijn in de aanpassing aan het milieu stressoren, waaronder zware metalen en oxidatieve stress. Hier hebben we ons gericht op een plasmide bibliotheek, de Gist FLEXGene bibliotheek 9. Echter, er zijn diverse andere gist plasmide bibliotheken beschikbaar, die ook kunnen worden gebruikt voor deze schermen 6,8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door een subsidie van het Packard Center voor ALS onderzoek in Johns Hopkins (ADG), Nieuw-Innovator een NIH Director's Award 1DP2OD004417-01 (ADG), NIH R01 NS065317 (ADG), de Rita Allen Foundation Scholar Award. ADG is een Pew Scholar in de Biomedische Wetenschappen, ondersteund door The Pew Charitable Trusts.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BioRobot RapidPlate | Qiagen | 9000490 | |
| 96 bolt replicator (frogger) | V&P Scientific | VP404 | |
| FLEXGene ORF Library | Institute of Proteomics, Harvard Medical School | ||
| Tabletop centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| 500mL baffled flask | Bellco Glass | 2543-00500 | |
| 2.8L triple-baffled Fernbach flask | Bellco Glass | 2551-02800 | |
| 100μL Rapidplate pipette tips | Axygen Scientific | ZT-100-R-S | |
| 200μL Rapidplate pipette tips | Axygen Scientific | ZT-200-R-S |
References
- Nurse, P. The Nobel Prize and beyond: an interview with Sir Paul Nurse. Interview by Susan R. Owens. EMBO Rep. 3, 204-206 (2002).
- Hartwell, L. H. Nobel Lecture. Yeast and cancer. Biosci Rep. 22, 373-394 (2002).
- Stevens, T., Esmon, B., Schekman, R. Early stages in the yeast secretory pathway are required for transport of carboxypeptidase Y to the vacuole. Cell. 30, 439-448 (1982).
- Novick, P., Ferro, S., Schekman, R. Order of events in the yeast secretory pathway. Cell. 25, 461-469 (1981).
- Novick, P., Field, C., Schekman, R. Identification of 23 complementation groups required for post-translational events in the yeast secretory pathway. Cell. 21, 205-215 (1980).
- Sopko, R. Mapping pathways and phenotypes by systematic gene overexpression. Mol Cell. 21, 319-330 (2006).
- Alberti, S., Gitler, A. D., Lindquist, S. A suite of Gateway((R)) cloning vectors for high-throughput genetic analysis in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 24, 913-919 (2007).
- Gelperin, D. M. Biochemical and genetic analysis of the yeast proteome with a movable ORF collection. Genes Dev. 19, 2816-2826 (2005).
- Hu, Y. Approaching a complete repository of sequence-verified protein-encoding clones for Saccharomyces cerevisiae. Genome Res. 17, 536-543 (2007).
- Giaever, G. Functional profiling of the Saccharomyces cerevisiae genome. Nature. 418, 387-391 (2002).
- Boone, C., Bussey, H., Andrews, B. J. Exploring genetic interactions and networks with yeast. Nat Rev Genet. 8, 437-449 (2007).
- Mnaimneh, S. Exploration of essential gene functions via titratable promoter alleles. Cell. 118, 31-44 (2004).
- Parsons, A. B. Integration of chemical-genetic and genetic interaction data links bioactive compounds to cellular target pathways. Nat Biotechnol. 22, 62-69 (2004).
- Schuldiner, M. Exploration of the function and organization of the yeast early secretory pathway through an epistatic miniarray profile. Cell. 123, 507-519 (2005).
- Tong, A. H. Systematic genetic analysis with ordered arrays of yeast deletion mutants. Science. 294, 2364-2368 (2001).
- Tong, A. H. Global mapping of the yeast genetic interaction network. Science. 303, 808-813 (2004).
- Neumann, M. Ubiquitinated TDP-43 in frontotemporal lobar degeneration and amyotrophic lateral sclerosis. Science. 314, 130-133 (2006).
- Johnson, B. S., McCaffery, J. M., Lindquist, S., Gitler, A. D. A yeast TDP-43 proteinopathy model: Exploring the molecular determinants of TDP-43 aggregation and cellular toxicity. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 6439-6444 (2008).
- Elden, A. C. Ataxin-2 intermediate-length polyglutamine expansions are associated with increased risk for ALS. Nature. 466, 1069-1075 (2010).
- Johnson, B. S. TDP-43 is intrinsically aggregation-prone, and amyotrophic lateral sclerosis-linked mutations accelerate aggregation and increase toxicity. J Biol Chem. 284, 20329-20339 (2009).
- Cooper, A. A. Alpha-synuclein blocks ER-Golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson's models. Science. 313, 324-328 (2006).
- Gitler, A. D. Beer and Bread to Brains and Beyond: Can Yeast Cells Teach Us about Neurodegenerative Disease? Neurosignals. 16, 52-62 (2008).
- Gitler, A. D. Alpha-synuclein is part of a diverse and highly conserved interaction network that includes PARK9 and manganese toxicity. Nat Genet. 41, 308-315 (2009).
