Summary
Nous décrivons ici un écran surexpression plasmide dans
Abstract
Le bourgeonnement de levure Saccharomyces cerevisiae, est un système puissant modèle pour définir les mécanismes fondamentaux de nombreux processus cellulaires importants, y compris ceux en rapport direct avec la maladie humaine. En raison de son temps de génération court et bien caractérisés génome, un avantage majeur d'expérimentation du système modèle la levure est la capacité à effectuer des criblages génétiques pour identifier les gènes et les voies qui sont impliquées dans un processus donné. Au cours des trente dernières années tels cribles génétiques ont été utilisés pour élucider le cycle cellulaire, voie de sécrétion, et de nombreux autres aspects de la biologie hautement conservée cellule eucaryote 1-5. Au cours des dernières années, plusieurs bibliothèques genomewide des souches de levures et plasmides ont été générés 6-10. Ces collections permettent maintenant de l'interrogation systématique de la fonction des gènes en utilisant gain et la perte de fonction des approches 11-16. Ici nous fournissons un protocole détaillé pour l'utilisation d'un protocole de haut débit de la levure de transformation avec un robot de manipulation de liquides pour effectuer un écran surexpression plasmidique, en utilisant une bibliothèque de 5.500 vêtu plasmides de levure. Nous avons utilisé ces écrans pour identifier modificateurs génétiques de la toxicité associée à l'accumulation de l'agrégation des protéines humaines exposées aux maladies neurodégénératives. Les méthodes présentées ici sont facilement adaptables à l'étude d'autres phénotypes cellulaires d'intérêt.
Protocol
1. Les préparatifs pour la transformation de la levure
Ce protocole est conçu pour les dix plaques de 96 puits, mais peut être agrandie ou réduite en conséquence. Nous avons trouvé que ce protocole ne fonctionne pas bien depuis plus de vingt plaques de 96 puits par tour de transformation. La procédure de transformation complète (de l'étape I.3) prendra environ huit heures.
- Aliquote de 5-10 ul d'ADN plasmidique (100 ng / uL) de la bibliothèque de levure FLEXGene ORF dans chaque puits d'un fond rond-plaque de 96 puits avec gestionnaire Biorobot RapidPlate liquide. Placez découverts plaques de 96 puits dans le capot banc propre fumées sécher une nuit. Nous avons trouvé des efficacités de transformation similaire avec le CEN et plasmides de levure 2μ.
- Inoculer 200ml de levure, peptone et de dextrose (YPD) médias (extrait de levure 10g / L, 20g / L de peptone, 20 g / L de glucose) avec la souche de requête dans un erlenmeyer de 500 ml dérouté. Incuber une nuit à 30 ° C avec agitation (200 rpm). Si nécessaire, des milieux sélectifs peuvent également être utilisés pour ces ferments.
- Le lendemain matin, diluer la souche de requête à DO600 = 0,1 en 2L de YPD. Agiter pendant 4-6 heures à 30 ° C (200 rpm) jusqu'à ce que la culture atteint DO600 = 0,8 à 1,0. Pour une croissance optimale, grandir entre deux cultures séparées de 1L 2,8 L flacons dérouté. Si nécessaire, des milieux sélectifs peuvent également être utilisés au lieu de YPD.
2. Transformation de la levure
- Récolte des cellules par centrifugation. Remplissez quatre jetables 225ml tubes coniques avec la culture de levures et de spin à 3000rpm (~ 1800 xg) pendant 5 minutes dans la centrifugeuse de table (Eppendorf 5810R). Décanter le surnageant et répéter jusqu'à ce que toutes les cellules sont récoltées.
- Laver les cellules dans 200 ml d'autoclave distillée H 2 O. Resuspendre le culot cellulaire en secouant ou en vortex. Combinez les cellules dans un tube conique 225ml. Spin à 3000rpm pendant 5 minutes. Retirer le surnageant.
- Préparer la solution 0.1MLiOAc/1XTE (0,1 M LiOAc, 10 mM Tris, 1mM EDTA, pH 8 dans l'eau distillée à l'autoclave). Laver les cellules dans 0.1MLiOAc/1XTE 100mL. Spin à 3000rpm pendant 5 minutes. Retirer le surnageant.
- Resuspendre le culot cellulaire dans 70 mL 0,1 M LiOAc/1xTE. Agiter et / ou vortex pour assurer culot est resuspendu complètement.
- Incuber sous agitation à 30 ° C pendant 30 minutes (200 rpm).
- Ajouter β-mercaptoéthanol à 0,1 M. Incuber sous agitation à 30 ° C pendant 30 minutes (200 rpm). Remarque: Cette étape peut être omise si l'aide des souches de levure qui sont sensibles aux β-mercaptoéthanol. Nous avons constaté que cette étape n'est pas essentielle pour la transformation réussie, mais il ne améliorer l'efficacité de transformation.
- Faites bouillir 2 mL de l'ADN de sperme de saumon soniqué (10mg/ml) pendant 15 minutes, puis réfrigérer sur la glace.
- Ajouter 2 mL de l'ADN de sperme de saumon cuit au mélange de la cellule. Attention: Un précipité peut se former lors de l'addition de l'ADN de sperme de saumon dans le mélange de cellules. L'utilisation d'un Pipetman et 200 ul pointe, retirez soigneusement tout précipité qui se forme, car cela pourrait interférer avec le pipetage en aval.
- 50 pl aliquote de mélange de cellules dans chaque puits de la plaque à 96 puits en utilisant la Rapidplate BioRobot (peut également utiliser une pipette multi-canaux). Ne pas mélanger.
- Incuber à température ambiante pendant 30 minutes sans agitation.
- Préparer 200ml de 40% PEG-3350/10% DMSO/0.1M LiOAc (160ml de 50% de PEG-3350, le DMSO 20mL, 20mL LiOAc 1M). Préparer la solution immédiatement avant utilisation.
- Ajouter 125μL de PEG / LioAc / DMSO solution à chaque puits. Mélanger en aspirant et la distribution suspension cellulaire à huit reprises avec RapidPlate.
- Incuber à température ambiante pendant 30 minutes sans agitation.
- Choc thermique des cellules à 42 ° C pendant 15 minutes dans un incubateur sec. Ne pas empiler les assiettes. Note: Nous avons constaté que cette étape de choc thermique n'est pas essentielle pour la transformation réussie. Pour certaines souches de levures (par exemple, des mutants sensibles à la température), le choc thermique est délétère. Nous avons déjà réduit le temps de choc thermique à une minute et ont été capables de transformer avec succès une souche de levure présentant une mutation ypt1 sensibles à la température en utilisant ce protocole.
- Spin plaques à 2500rpm (~ 1100 xg) pendant 5 minutes, en utilisant des adaptateurs centrifugeuse pour accueillir les plaques 96 puits. Retirer la solution de PEG par des plaques inversant avec godet déchets. Blot plaque retournée sur du papier absorbant pour enlever le liquide résiduel (cellules restera sur fond de puits).
- Rincer les cellules en ajoutant 200 pl d'un milieu minimal (par exemple SD /-Ura) pour chaque puits avec RapidPlate.
- Spin plaques à 2500rpm pendant 5 minutes et retirez surnageant par seau de déchets et plus inversant buvard sur du papier absorbant.
- Ajouter 200 ul de milieu minimal (par exemple SD /-Ura) pour chaque puits avec RapidPlate.
- Incuber à 30 ° C pendant 2 jours sans agitation. Après 2 jours, de petites colonies de cellules devrait commencer à se former au bas de chaque transformé avec succès bien.
3. Spotting test
- Distribuer 200 pl de raffinose médias basés sur un minimum (par exemple SRAF /-Ura) dans chaque puits deun nouveau fond plat plaque de 96 puits.
- Mélanger chaque puits de la plaque de transformation par l'aspiration et la distribution de cellules en suspension à huit reprises avec Rapidplate.
- Inoculer plaques SRAF avec 5uL de mélange de cellules de la plaque de transformation.
- Incuber à 30 ° C pendant une journée. Les petites colonies doivent être présents au fond de chaque puits après une journée.
- Colonies spot sur carte SD /-Ura et SGal / Ura-plaques dans le capot. Stériliser 96-boulons réplicateur (Frogger) par flambage. Mélanger les colonies avec Frogger, avant de taches sur les plaques des milieux sélectifs. Après avoir repéré, permet de sécher les plaques dans la hotte pendant 5-10 minutes.
- Incuber à 30 ° C pendant 2-3 jours.
Plaques photographie avec un appareil photo numérique, et de comparer visuellement la croissance des colonies sur SGal / Ura-plaques de trouver des colonies dans lesquelles la toxicité souche requête est renforcée (ralentissement de la croissance / colonies moins denses) ou supprimée (une croissance plus rapide / plus de colonies denses).
4. Les résultats représentatifs:
Figure 1. Surexpression d'écran plasmide de levure pour identifier des suppresseurs et exhausteurs de TDP-43 toxicité. TDP-43 est une protéine humaine a été impliquée dans la pathogenèse de la sclérose latérale amyotrophique (maladie de Lou Gehrig). Agrégats cytoplasmiques de TDP-43 s'accumulent dans le cerveau et les neurones de la moelle épinière des patients SLA 17. Exprimant TDP-43 dans les résultats des cellules de levure dans l'agrégation et la cytotoxicité 18. Nous avons utilisé ce modèle pour définir les mécanismes de la toxicité de TDP-43 19,20. Présents sont des exemples de plaques repesentative de nos levures TDP-43 modificateur de l'écran de toxicité. Ces plaques d'affichage des colonies avec un système intégré de galactose-inductible TDP-43 plasmide et transformées avec les plasmides d'expression de la bibliothèque FLEXGene ORF. La plaque sur la gauche contient du glucose, qui réprime l'expression de la protéine TDP-43 ou les plasmides FLEXGene. La plaque de droite contient du galactose, qui induit l'expression de TDP-43 et l'ORF dans les plasmides FLEXGene. La flèche verte indique une colonie transformée avec un plasmide qui supprime la toxicité de la protéine TDP-43. La flèche rouge indique une colonie transformée avec un plasmide qui augmente la toxicité de TDP-43.
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Discussion
Nous présentons ici un protocole pour effectuer un écran haut débit surexpression plasmide dans la levure. Cette approche permet le criblage rapide et impartiale pour les modificateurs génétiques de beaucoup de différents phénotypes cellulaires. En utilisant cette approche, un chercheur peut filtrer une partie importante du génome de la levure dans une affaire de semaines. Cette approche impartiale permet également d'identifier les modificateurs, qui peuvent ne pas avoir été prédit sur la base des conclusions précédentes. Nous avons utilisé cette approche pour identifier les modificateurs de la toxicité associée à l'agrégation des protéines humaines maladie neurodégénérative 19,21-23. Toutefois, en raison de l'adaptabilité de ce protocole d'étudier d'autres processus cellulaires, ce protocole sera utile aux chercheurs abordant un large éventail d'importantes questions d'ordre biologique. Par exemple, nous avons également constaté que cette approche de dépistage utile pour identifier les gènes et les voies impliquées dans l'adaptation aux stress environnementaux, notamment les métaux lourds et le stress oxydatif. Ici nous nous sommes concentrés sur une banque plasmidique, la bibliothèque de levure FLEXGene 9. Cependant, il existe plusieurs bibliothèques de la levure autre plasmide disponibles, ce qui pourrait également être utilisé pour ces 6,8 écrans.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par une subvention du Centre pour la recherche sur la SLA Packard à la Johns Hopkins (ADG), Prix d'un directeur des NIH Innovateur Nouveau 1DP2OD004417-01 (ADG), NIH R01 NS065317 (ADG), la Fondation Rita Allen Scholar Award. ADG est une bourse d'études Pew dans les sciences biomédicales, soutenu par le Pew Charitable Trusts.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BioRobot RapidPlate | Qiagen | 9000490 | |
| 96 bolt replicator (frogger) | V&P Scientific | VP404 | |
| FLEXGene ORF Library | Institute of Proteomics, Harvard Medical School | ||
| Tabletop centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| 500mL baffled flask | Bellco Glass | 2543-00500 | |
| 2.8L triple-baffled Fernbach flask | Bellco Glass | 2551-02800 | |
| 100μL Rapidplate pipette tips | Axygen Scientific | ZT-100-R-S | |
| 200μL Rapidplate pipette tips | Axygen Scientific | ZT-200-R-S |
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