Summary
Aqui nós descrevemos uma tela superexpressão plasmídeo em
Abstract
A levedura de brotamento, Saccharomyces cerevisiae, é um sistema poderoso modelo para a definição de mecanismos fundamentais de muitos processos celulares importantes, incluindo aquelas com relevância direta para a doença humana. Por causa de seu tempo de geração curto e bem caracterizadas do genoma, uma grande vantagem experimental do sistema de modelo de levedura é a capacidade de realizar triagem genética para identificar genes e caminhos que estão envolvidos em um determinado processo. Nos últimos 30 anos como telas genética têm sido usadas para elucidar o ciclo celular, via de excreção, e muitos outros aspectos altamente conservadas da biologia das células eucarióticas 1-5. No últimos anos, diversas bibliotecas do genoma de cepas de leveduras e plasmídeos foram gerados 6-10. Estas colecções permitem agora para o interrogatório sistemático da função do gene usando-ganho e perda de função abordagens 11-16. Aqui nós fornecemos um protocolo detalhado para o uso de um protocolo de transformação de alto rendimento fermento com um robô para manipulação de líquidos para executar uma tela superexpressão plasmídeo, usando uma biblioteca de vestidos de 5.500 plasmídeos de levedura. Temos vindo a utilizar estas telas para identificar modificadores genéticos de toxicidade associado ao acúmulo de agregação propensas proteínas humanas doença neurodegenerativa. Os métodos aqui apresentados são facilmente adaptáveis para o estudo de outros fenótipos celulares de interesse.
Protocol
1. Preparações para a transformação de levedura
Este protocolo é projetado para dez placas de 96 poços, mas podem ser ampliados ou reduzidos em conformidade. Descobrimos que este protocolo não funciona bem por mais de vinte placas de 96 poços por rodada de transformação. O procedimento de transformação inteira (a partir do passo I.3) levará cerca de oito horas.
- Alíquota de 5 10μL de DNA plasmídeo (100 ng / mL) a partir da levedura biblioteca ORF FLEXGene em todos os poços de fundo redondo-96-bem placa com Biorobot manipulador RapidPlate líquido. Lugar descoberto placas de 96 poços na capa da bancada limpa fume durante a noite para secar. Nós descobrimos que a eficiência de transformação semelhante com o CEN e plasmídeos de levedura 2μ.
- Inocular 200 ml de levedura peptona dextrose (YPD) media (10g / L de extrato de levedura, 20g / L de peptona, 20g / L de glicose) com a tensão de consulta em um Erlenmeyer de 500mL perplexo. Incubar durante a 30 ° C com agitação (200 rpm). Se necessário, meios seletivos também pode ser usado para essas culturas starter.
- Na manhã seguinte, dilua a tensão consulta para OD 600 = 0,1 em 2L de YPD. Agitar durante 4-6 horas a 30 ° C (200 rpm) até que a cultura atinge OD 600 = 0,8-1,0. Para o crescimento ideal, crescem duas culturas separadas na 1L 2,8 L frascos perplexo. Se necessário, meios seletivos também pode ser usado em vez de YPD.
2. Transformação de levedura
- Colheita de células por centrifugação. Encher quatro descartáveis 225mL tubos cônicos com cultura de levedura, girando em 3000rpm (~ xg 1800) por 5 minutos em centrífuga de mesa (Eppendorf 5810R). Deitar fora o sobrenadante e repetir até que todas as células são colhidas.
- Lavar as células em 200ml de autoclavado destilada H 2 O. Ressuspender pellet celular por agitação ou vórtex. Combine as células em um tubo cônico 225mL. Giram a 3000rpm por 5 minutos. Remover o sobrenadante.
- Preparar a solução 0.1MLiOAc/1XTE (0,1 M LiOAc, 10mM Tris, 1mM EDTA, pH 8 em água destilada autoclavada). Lavar as células 0.1MLiOAc/1XTE 100mL. Giram a 3000rpm por 5 minutos. Remover o sobrenadante.
- Ressuspender celular em 70ml 0,1 M LiOAc/1xTE. Agitar e / ou vortex para garantir pellet ressuspenso é completamente.
- Incube com agitação a 30 ° C por 30 minutos (200 rpm).
- Adicionar β-mercaptoetanol a 0,1 M. Incube com agitação a 30 ° C por 30 minutos (200 rpm). Nota: Este passo pode ser omitido se estiver usando cepas de leveduras que são sensíveis à β-mercaptoetanol. Descobrimos que este passo não é essencial para a transformação bem-sucedida, no entanto, faz melhorar a eficiência de transformação.
- Ferva 2 ml de DNA sonicado salmão esperma (10mg/mL) por 15 minutos, e depois relaxar no gelo.
- Adicionar 2 ml de DNA de esperma de salmão cozido à mistura de células. Atenção: A precipitação pode formar com a adição do DNA do esperma de salmão com a mistura de células. Usando um Pipetman e 200 mL ponta, retire cuidadosamente qualquer precipitado que se forma, pois isso poderá interferir com pipetagem a jusante.
- 50μL alíquota da mistura de células para cada poço da placa de 96 poços usando o Rapidplate BioRobot (também pode usar multi-canal de pipeta). Não se misturam.
- Incubar à temperatura ambiente por 30 minutos sem agitar.
- Prepare 200mL de 40% PEG-3350/10% DMSO/0.1M LiOAc (160ml de 50% PEG-3350, DMSO 20mL, 20mL LiOAc 1M). Preparar a solução imediatamente antes da utilização.
- Adicionar 125μL de PEG / LioAc / DMSO solução para cada poço. Mix, aspirando e dispensando suspensão de células oito vezes com RapidPlate.
- Incubar à temperatura ambiente por 30 minutos sem agitar.
- Choque térmico das células a 42 ° C por 15 minutos em uma incubadora de seca. Não empilhar chapas. Nota: Nós descobrimos que essa etapa de choque térmico não é essencial para a transformação bem sucedida. Para certas cepas de leveduras (por exemplo, os mutantes sensíveis à temperatura), choque térmico é deletéria. Nós já reduziu o tempo de choque de calor para um minuto e ter sido capaz de transformar uma cepa de levedura abrigar uma mutação sensível a temperatura ypt1 usando esse protocolo.
- Placas giram em 2500rpm (~ xg 1100) por 5 minutos, usando adaptadores centrífuga para acomodar placas de 96 poços. Remoção da solução de PEG por placas de inversão da caçamba de resíduos. Blot placa invertida sobre papel toalha para remover o líquido residual (células permanecerão no fundo de poços).
- Enxágüe células adicionando 200μL de meio mínimo (por exemplo SD /-Ura) para cada poço com RapidPlate.
- Girar placas a 2500rpm por 5 minutos e retire sobrenadante por inversão balde de lixo ao longo e nas toalhas de papel mata-borrão.
- Adicionar 200μL de meio mínimo (por exemplo SD /-Ura) para cada poço com RapidPlate.
- Incubar a 30 ° C por 2 dias sem agitar. Depois de dois dias, pequenas colônias de células deve começar a se formar na parte inferior de cada transformado com sucesso também.
3. Spotting ensaio
- Dispensar 200μL de rafinose mídia baseada mínima (por exemplo SRAF /-Ura) em cada poço deuma placa de fundo chato de 96 poços novos.
- Mix cada poço da placa de transformação, aspirando e dispensando suspensão de células oito vezes com Rapidplate.
- Inocular placas SRAF com 5μL da mistura de células de placa transformação.
- Incubar a 30 ° C por um dia. Pequenas colônias devem estar presentes na parte inferior de cada poço depois de um dia.
- Colônias Spot on SD /-Ura e / Ura-SGAL placas no capô. Esterilizar 96-parafuso replicador (frogger) por chamas. Mix colônias com frogger antes de spotting em placas de meios seletivo. Depois de spotting, permitem que as placas para secar na capa por 5-10 minutos.
- Incubar a 30 ° C por 2-3 dias.
Placas de fotografia com câmera digital, e visualmente comparar o crescimento das colônias em SGAL /-Ura placas para encontrar colônias em que a toxicidade tensão consulta é melhorada (um crescimento mais lento / colônias menos densas) ou suprimido (um crescimento mais rápido / mais densas colônias).
4. Resultados representativos:
Figura 1. Yeast tela superexpressão plasmídeo para identificar supressores e estimuladores da TDP-43 toxicidade. TDP-43 é uma proteína humana que tem sido implicado na patogênese da esclerose lateral amiotrófica (doença de Lou Gehrig). Agregados citoplasmáticos de TDP-43 acumula no cérebro e neurônios da medula espinhal de pacientes com ELA 17. Expressando TDP-43 em células de levedura resultados na agregação e citotoxicidade 18. Temos usado este sistema modelo para definir mecanismos de toxicidade TDP-43 19,20. Mostrados são exemplos de placas representativo de nossa levedura TDP-43 tela do modificador de toxicidade. Estas placas mostrar colônias com um sistema integrado de galactose induzível-TDP-43 plasmídeo e também transformada com os plasmídeos da biblioteca expressão FLEXGene ORF. A placa do lado esquerdo contém glicose, que reprime a expressão de TDP-43 ou os plasmídeos FLEXGene. A placa da direita contém galactose, que induz a expressão de TDP-43 e as ORFs na plasmídeos FLEXGene. A seta verde indica uma colônia transformada com um plasmídeo que suprime a toxicidade da TDP-43. A seta vermelha indica uma colônia transformada com um plasmídeo que aumenta a toxicidade da TDP-43.
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Discussion
Aqui apresentamos um protocolo para realizar um alto throughput tela superexpressão plasmídeo em levedura. Esta abordagem permite a detecção rápida e imparcial de modificadores genéticos de diferentes fenótipos celulares. Usando essa abordagem, um pesquisador pode selecionar uma porção significativa do genoma da levedura em questão de semanas. Esta abordagem imparcial também permite a identificação de modificadores, que podem não ter sido previsto com base em resultados anteriores. Nós temos usado essa abordagem para identificar modificadores de toxicidade associada com a agregação de proteínas humanas, doença neurodegenerativa 19,21-23. No entanto, devido à adaptabilidade deste protocolo para estudar outros processos celulares, este protocolo vai ser útil para pesquisadores abordando um vasto leque de importantes questões biológicas. Por exemplo, nós temos também que este enfoque triagem útil para identificar genes e caminhos envolvidos na adaptação ao estresse ambiental, incluindo metais pesados e estresse oxidativo. Aqui nós temos focado em uma biblioteca de plasmídeo, o fermento biblioteca FLEXGene 9. No entanto, existem várias bibliotecas outra levedura plasmídeo disponíveis, que também poderia ser usada para esses 6,8 telas.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado por uma doação do Centro de Packard de Investigação em ALS Johns Hopkins (ADG), um diretor Award NIH Innovator New 1DP2OD004417-01 (ADG), R01 NIH NS065317 (ADG), a Rita Allen Foundation Scholar Award. ADG é um Scholar Pew em Ciências Biomédicas, apoiado pelo Pew Charitable Trusts.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BioRobot RapidPlate | Qiagen | 9000490 | |
| 96 bolt replicator (frogger) | V&P Scientific | VP404 | |
| FLEXGene ORF Library | Institute of Proteomics, Harvard Medical School | ||
| Tabletop centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| 500mL baffled flask | Bellco Glass | 2543-00500 | |
| 2.8L triple-baffled Fernbach flask | Bellco Glass | 2551-02800 | |
| 100μL Rapidplate pipette tips | Axygen Scientific | ZT-100-R-S | |
| 200μL Rapidplate pipette tips | Axygen Scientific | ZT-200-R-S |
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