Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Med hög kapacitet Jäst Plasmid Överuttryck skärm

Published: July 27, 2011 doi: 10.3791/2836

Summary

Här beskriver vi en plasmid överuttryck skärm

Abstract

Den spirande jäst, Saccharomyces cerevisiae, är en kraftfull modell för att definiera grundläggande mekanismer i många viktiga cellulära processer, inklusive de med direkt relevans för mänskliga sjukdomar. På grund av dess korta generationstid och väldefinierad genomet, är en stor experimentell fördel med jäst modellsystem förmågan att utföra genetiska skärmar för att identifiera gener och signalvägar som är involverade i en viss process. Under de senaste trettio åren sådana genetiska skärmar har använts för att belysa cellcykeln, Utsöndringsvägarna, och många fler starkt konservativa delar av eukaryota cellbiologiska 1-5. Under de senaste åren har flera genomewide bibliotek av jäststammar och plasmider genererats 6-10. Dessa samlingar kan nu för systematisk förhör av geners funktion med hjälp av vinst-och förlust-av-funktionen metoder 11-16. Här ger vi ett detaljerat protokoll för användning av en hög genomströmning jäst omvandling protokoll med ett vätskehantering robot att utföra en plasmid överuttryck skärmen med en klädd bibliotek med 5500 jäst plasmider. Vi har använt dessa skärmar att identifiera genetiska modifierare av toxicitet i samband med ackumulering av aggregering som ofta drabbas människor neurodegenerativa sjukdomar proteiner. Metoderna som presenteras här är lätt att anpassa till studiet av andra cellulära fenotyper av intresse.

Protocol

1. Förberedelser för jäst omvandling

Detta protokoll är avsedd för tio 96-brunnar, men kan skalas upp eller ner därefter. Vi har funnit att detta protokoll inte fungerar bra för mer än tjugo plattor med 96 brunnar per runda av transformation. Hela förvandlingen förfarandet (från steg I.3) tar cirka åtta timmar.

  1. Alikvotera 5-10μL av plasmid-DNA (100 ng / l) från jästen FLEXGene ORF bibliotek i varje brunn i en rundbottnad 96-brunnar med Biorobot RapidPlate vätska handler. Placera avslöjade 96-brunnar i sterilbänk dragskåp över natten för att torka. Vi har funnit liknande förändring effektivitet med CEN och 2μ plasmider jäst.
  2. Inokulera 200ml av jäst pepton dextros (YPD) media (10g / L jästextrakt, 20 g / L pepton, 20 g / l glukos) med frågan stam i ett förvånat 500ml Erlenmeyerkolv. Inkubera över natten vid 30 ° C med skakningar (200 rpm). Vid behov kan selektiva medier också användas för dessa startkulturer.
  3. Följande morgon, späd frågan stammen till OD 600 = 0,1 i 2L för YPD. Skaka i 4-6 timmar vid 30 ° C (200 rpm) tills kulturen når OD 600 = 0,8 till 1,0. För optimal tillväxt, växa upp två 1L kulturer i separata 2,8 förbryllad L flaskor. Vid behov kan selektiva medier också användas i stället för YPD.

2. Jäst omvandling

  1. Harvest celler genom centrifugering. Fyll fyra disponibel 225mL koniska rör med jäst kultur och snurra på 3000rpm (~ 1800 xg) i 5 minuter i tabletop centrifug (Eppendorf 5810R). Häll bort supernatanten och upprepa tills alla celler skördas.
  2. Tvätta cellerna i 200 ml autoklaveras destillerat H 2 O. Resuspendera cellpelleten genom skakning eller vortexa. Kombinera celler i ett 225mL koniska rör. Spin vid 3000rpm i 5 minuter. Avlägsna supernatanten.
  3. Förbered 0.1MLiOAc/1XTE lösning (0,1 miljoner LiOAc, 10mm Tris, 1mm EDTA, pH 8 i autoklaveras destillerat vatten). Tvätta cellerna i 100 mL 0.1MLiOAc/1XTE. Spin vid 3000rpm i 5 minuter. Avlägsna supernatanten.
  4. Resuspendera cellpelleten i 70ml 0,1 miljoner LiOAc/1xTE. Skaka och / eller vortex för att se till pellets är helt återsuspenderade.
  5. Inkubera med skakning vid 30 ° C i 30 minuter (200 rpm).
  6. Lägg β-merkaptoetanol till 0,1 miljoner. Inkubera med skakning vid 30 ° C i 30 minuter (200 rpm). OBS: Detta steg är valfritt om du använder jäststammar som är känsliga för β-merkaptoetanol. Vi har funnit att detta steg är inte nödvändigt för en lyckad förändring, men det blir bättre omvandlingseffektiviteten.
  7. Koka 2 ml sonicated lax spermiens DNA (10mg/mL) i 15 minuter och sedan kyla på is.
  8. Tillsätt 2 ml kokt lax spermiens DNA till cell blandning. Varning: En fällning kan bildas vid tillsättning av lax spermiens DNA till cellen blandningen. Med hjälp av en pipetman och 200 l spets, försiktigt bort eventuell fällning som bildas, eftersom detta kan störa nedströms pipettering.
  9. Alikvotera 50μL av cell blandningen till varje brunn på 96-brunnar med BioRobot Rapidplate (kan också använda flera kanaler pipett). Blanda inte.
  10. Inkubera vid rumstemperatur i 30 minuter utan att skaka.
  11. Förbered 200ml 40% PEG-3350/10% DMSO/0.1M LiOAc (160mL 50% PEG-3350, 20ml DMSO, 20ml 1M LiOAc). Bered omedelbart före användning.
  12. Tillsätt 125μL av PEG / LioAc / DMSO-lösning till varje brunn. Blanda genom aspirera och utlämning cellsuspension åtta gånger med RapidPlate.
  13. Inkubera vid rumstemperatur i 30 minuter utan att skaka.
  14. Heat shock cellerna vid 42 ° C i 15 minuter i en torr inkubator. Stapla inte plattorna. OBS: Vi har funnit att detta heat shock steg är inte avgörande för en framgångsrik omvandling. För vissa jäststammar (t.ex. temperatur känsliga mutanter) är heat shock skadliga. Vi har tidigare minskat tiden värme chock för en minut och har lyckats med att förvandla en jäst stam hyser en ypt1 temperaturkänsliga mutation med detta protokoll.
  15. Spin plattorna vid 2500rpm (~ 1100 xg) i 5 minuter, med hjälp av centrifug adaptrar för att rymma 96-hålsplattor. Ta bort PEG-lösning genom att vända plattor över avfall hink. Blot inverterade plattan mot en pappersnäsduk för att avlägsna rester av vätska (celler blir kvar på botten av brunnar).
  16. Skölj celler genom att tillsätta 200μL av minimal media (t.ex. SD /-Ura) till varje brunn med RapidPlate.
  17. Spin plattorna vid 2500rpm i 5 minuter och avlägsna supernatanten genom att vända över avfall hink och blotting av på hushållspapper.
  18. Tillsätt 200μL av minimal media (t.ex. SD /-Ura) till varje brunn med RapidPlate.
  19. Inkubera vid 30 ° C i 2 dagar utan att skaka. Efter 2 dagar, bör små kolonier av celler börjar bildas längst ner i varje framgångsrikt förvandlats väl.

3. Spotting analys

  1. Tillsätt 200μL av raffinos baserade minimal media (t.ex. SRaf /-Ura) i varje brunnen ny flat botten 96-brunnar.
  2. Blanda varje brunn på omvandling tallrik med aspirera och utlämning cellsuspension åtta gånger med Rapidplate.
  3. Inokulera SRaf plattor med 5μL av cell blandning från omvandling plattan.
  4. Inkubera vid 30 ° C för en dag. Små kolonier bör vara närvarande i botten av varje brunn efter en dag.
  5. Spot kolonier på SD /-Ura och SGal /-Ura plattor i huva. Sterilisera 96-bult Replicator (Frogger) genom flambering. Blanda kolonier med Frogger innan fläckar på selektiva medier tallrikar. Efter spotting, låt plattorna torka i huv i 5-10 minuter.
  6. Inkubera vid 30 ° C i 2-3 dagar.

Fotografera plattor med digitalkamera och visuellt jämföra tillväxten av kolonier på SGal /-Ura plattor för att hitta kolonier där frågan stammen toxicitet ökar (långsammare tillväxt / mindre tät kolonier) eller döljas (snabbare tillväxt / tätare kolonier).

4. Representativa resultat:

Figur 1
Figur 1. Jäst plasmid överuttryck skärmen för att identifiera stötvågsfilter och medel för TDP-43 toxicitet. TDP-43 är ett humant protein som har varit inblandad i patogenesen av amyotrofisk lateralskleros (Lou Gehrig sjukdom). Cytoplasmiska aggregat av TDP-43 ansamlas i hjärnan och ryggmärgen nervceller sladd av ALS-patienterna 17. Att uttrycka TDP-43 i jästceller ger aggregation och cytotoxicitet 18. Vi har använt denna modell för att definiera mekanismer TDP-43 toxicitet 19,20. Här visas repesentative exempel på plattor från vår jäst TDP-43 toxicitet modifierare skärmen. Dessa skyltar visar kolonier med en integrerad galaktos-inducerbara TDP-43 plasmid och förvandlas med plasmider från FLEXGene ORF uttrycket bibliotek. Skylten till vänster innehåller glukos, som undertrycker uttryck för TDP-43 eller FLEXGene plasmider. Skylten till höger innehåller galaktos, vilket leder till uttryck av TDP-43 och ORFS i FLEXGene plasmider. Den gröna pilspets indikerar en koloni omvandlas med en plasmid som dämpar toxiciteten av TDP-43. Den röda pilspets indikerar en koloni omvandlas med en plasmid som ökar toxiciteten av TDP-43.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Här presenterar vi ett protokoll för att utföra en hög genomströmning plasmid överuttryck skärm i jäst. Detta tillvägagångssätt möjliggör snabb och objektiva screening för genetiska modifierare av många olika cellulära fenotyper. Med denna metod kan en forskare visa en betydande del av jästgenomet inom några veckor. Detta objektiva tillvägagångssätt gör det möjligt även för identifiering av modifierare, vilket inte kan ha förutsett på grundval av tidigare fynd. Vi har använt denna metod för att identifiera modifierare av toxicitet i samband med aggregering av mänskliga neurodegenerativa sjukdomar proteiner 19,21-23. På grund av anpassningsförmågan av detta protokoll för att studera andra cellulära processer kommer protokollet vara till nytta för forskare att ta itu med ett brett spektrum av viktiga biologiska frågeställningar. Till exempel har vi funnit även denna screening användbara för att identifiera gener och är involverade i anpassningen till miljöpåverkande faktorer, bland annat tungmetaller och oxidativ stress. Här har vi fokuserat på en plasmid som bibliotek, jästen FLEXGene biblioteket 9. Det finns dock flera andra jäst plasmiden bibliotek tillgängliga, vilket också skulle kunna användas för dessa skärmar 6,8.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Inga intressekonflikter deklareras.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av ett bidrag från Packard Centrum för ALS-forskning vid Johns Hopkins (ADG), en NIH direktörens Nya Innovator Award 1DP2OD004417-01 (ADG), NIH R01 NS065317 (ADG), den Rita Allen Foundation Scholar Award. ADG är en Pew Scholar i Biomedicinsk vetenskap, som stöds av The Pew Charitable Trusts.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BioRobot RapidPlate Qiagen 9000490
96 bolt replicator (frogger) V&P Scientific VP404
FLEXGene ORF Library Institute of Proteomics, Harvard Medical School
Tabletop centrifuge Eppendorf 5810R
500mL baffled flask Bellco Glass 2543-00500
2.8L triple-baffled Fernbach flask Bellco Glass 2551-02800
100μL Rapidplate pipette tips Axygen Scientific ZT-100-R-S
200μL Rapidplate pipette tips Axygen Scientific ZT-200-R-S

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nurse, P. The Nobel Prize and beyond: an interview with Sir Paul Nurse. Interview by Susan R. Owens. EMBO Rep. 3, 204-206 (2002).
  2. Hartwell, L. H. Nobel Lecture. Yeast and cancer. Biosci Rep. 22, 373-394 (2002).
  3. Stevens, T., Esmon, B., Schekman, R. Early stages in the yeast secretory pathway are required for transport of carboxypeptidase Y to the vacuole. Cell. 30, 439-448 (1982).
  4. Novick, P., Ferro, S., Schekman, R. Order of events in the yeast secretory pathway. Cell. 25, 461-469 (1981).
  5. Novick, P., Field, C., Schekman, R. Identification of 23 complementation groups required for post-translational events in the yeast secretory pathway. Cell. 21, 205-215 (1980).
  6. Sopko, R. Mapping pathways and phenotypes by systematic gene overexpression. Mol Cell. 21, 319-330 (2006).
  7. Alberti, S., Gitler, A. D., Lindquist, S. A suite of Gateway((R)) cloning vectors for high-throughput genetic analysis in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 24, 913-919 (2007).
  8. Gelperin, D. M. Biochemical and genetic analysis of the yeast proteome with a movable ORF collection. Genes Dev. 19, 2816-2826 (2005).
  9. Hu, Y. Approaching a complete repository of sequence-verified protein-encoding clones for Saccharomyces cerevisiae. Genome Res. 17, 536-543 (2007).
  10. Giaever, G. Functional profiling of the Saccharomyces cerevisiae genome. Nature. 418, 387-391 (2002).
  11. Boone, C., Bussey, H., Andrews, B. J. Exploring genetic interactions and networks with yeast. Nat Rev Genet. 8, 437-449 (2007).
  12. Mnaimneh, S. Exploration of essential gene functions via titratable promoter alleles. Cell. 118, 31-44 (2004).
  13. Parsons, A. B. Integration of chemical-genetic and genetic interaction data links bioactive compounds to cellular target pathways. Nat Biotechnol. 22, 62-69 (2004).
  14. Schuldiner, M. Exploration of the function and organization of the yeast early secretory pathway through an epistatic miniarray profile. Cell. 123, 507-519 (2005).
  15. Tong, A. H. Systematic genetic analysis with ordered arrays of yeast deletion mutants. Science. 294, 2364-2368 (2001).
  16. Tong, A. H. Global mapping of the yeast genetic interaction network. Science. 303, 808-813 (2004).
  17. Neumann, M. Ubiquitinated TDP-43 in frontotemporal lobar degeneration and amyotrophic lateral sclerosis. Science. 314, 130-133 (2006).
  18. Johnson, B. S., McCaffery, J. M., Lindquist, S., Gitler, A. D. A yeast TDP-43 proteinopathy model: Exploring the molecular determinants of TDP-43 aggregation and cellular toxicity. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 6439-6444 (2008).
  19. Elden, A. C. Ataxin-2 intermediate-length polyglutamine expansions are associated with increased risk for ALS. Nature. 466, 1069-1075 (2010).
  20. Johnson, B. S. TDP-43 is intrinsically aggregation-prone, and amyotrophic lateral sclerosis-linked mutations accelerate aggregation and increase toxicity. J Biol Chem. 284, 20329-20339 (2009).
  21. Cooper, A. A. Alpha-synuclein blocks ER-Golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson's models. Science. 313, 324-328 (2006).
  22. Gitler, A. D. Beer and Bread to Brains and Beyond: Can Yeast Cells Teach Us about Neurodegenerative Disease? Neurosignals. 16, 52-62 (2008).
  23. Gitler, A. D. Alpha-synuclein is part of a diverse and highly conserved interaction network that includes PARK9 and manganese toxicity. Nat Genet. 41, 308-315 (2009).

Tags

Cellbiologi Jäst plasmid omvandling PEG / LioAc hög genomströmning skärm
Med hög kapacitet Jäst Plasmid Överuttryck skärm
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fleming, M. S., Gitler, A. D.More

Fleming, M. S., Gitler, A. D. High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen. J. Vis. Exp. (53), e2836, doi:10.3791/2836 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter