Summary
Burada bir plazmid aşırı ekspresyonu ekran tarif
Abstract
Saccharomyces cerevisiae, tomurcuklanan bir maya, insan hastalığı ile doğrudan ilgili olanlar da dahil olmak üzere birçok önemli hücresel süreçlerin temel mekanizmaları, tanımlamak için güçlü bir model sistem. Çünkü, kısa üretim süresi ve iyi karakterize genom, maya model sistem büyük bir deneysel avantajı, belirli bir süreç içinde yer genler ve yolları belirlemek için genetik ekranlar gerçekleştirmek için yeteneğidir. Son otuz yıl içinde bu tür genetik ekranlar hücre döngüsü, salgı yolağı ve ökaryotik hücre biyolojisi 1-5 çok daha yüksek oranda korunmuş yönlerini aydınlatmak için kullanılmaktadır . Son birkaç yıl içinde, maya suşları ve plazmid birkaç genomewide kütüphaneler 6-10 oluşturuldu. Bu koleksiyon, kazanç ve kayıp fonksiyon-yaklaşımları kullanarak 11-16 genin fonksiyonu ile sistematik bir sorgulama için izin verir. Burada dizilmiş 5.500 maya plazmid bir kütüphaneyi kullanarak, plazmid aşırı ekspresyonu ekranı gerçekleştirmek için bir sıvı taşıma robotu ile yüksek verimli bir maya dönüşüm protokolü kullanımı için ayrıntılı bir protokol sağlar. Biz kümeleme eğilimli insan nörodejeneratif hastalık proteinlerin birikimi ile ilişkili toksisite genetik nitelemeler tanımlamak için bu ekranlar kullanıyoruz. Burada sunulan yöntemler diğer ilgi hücre fenotipleri çalışma kolayca uyarlanabilir.
Protocol
1. Maya dönüşüm için hazırlıklar
Bu protokol on 96-kuyucuğu için tasarlanmıştır ancak bu doğrultuda yukarı veya aşağı ölçeklendirilebilir. Biz bu protokolü, dönüşüm yuvarlak başına yirmiden fazla 96 kuyucuğu için iyi olmadığını bulduk. Tüm dönüşüm prosedürü (adım I.3) yaklaşık sekiz saat sürer.
- Kısım yuvarlak bir alt her kuyuya Biorobot RapidPlate sıvı işleyici 96-plaka Maya FLEXGene ORF kütüphane plazmid DNA (100 ng / ul) 5-10μL. Place kuru geceleme temiz tezgah davlumbaz 96-kuyucuğu ortaya çıkardı. Biz CEN ve 2μ maya plazmid ile benzer dönüşüm verimliliği bulduk.
- Maya pepton dekstroz (YPD) medya (10g / L maya özü, 20g / L pepton, 20g / L glukoz) ve 200 ml 500ml şaşkın Erlenmeyer şişesinin sorgu suşu ile inoküle edin. Sallayarak (200 rpm) ile 30 ° C'de bir gece inkübe edin. Gerekirse, seçici medya bu starter kültürler için de kullanılabilir.
- Ertesi sabah, sorgu gerginlik OD 600 = 0.1 YPD, 2L sulandırmak. 30 ° C (200 rpm) kültürü OD 600 = 0.8-1.0 ulaşıncaya kadar 4-6 saat çalkalanır. Optimum büyüme için, iki ayrı 2.8 L şaşkın şişeler 1L kültürler büyüyorlar. Gerekirse, seçici medya da YPD yerine kullanılan olabilir.
2. Maya dönüşüm
- Hasat hücreler santrifüj yoluyla. 5 dakika masaüstü santrifüj (Eppendorf 5810R) 3000rpm (~ 1800 xg) maya kültürü ve spin ile dört tek 225mL konik tüpler doldurun. Süpernatant dökün ve tüm hücreleri hasat kadar tekrarlayın.
- Otoklavlanmış distile H 2 O. 200ml hücrelerin yıkayın Sallayarak veya vorteks yeniden süspanse hücre pelletini. 225mL konik bir tüp içinde hücreleri birleştirin. 5 dakika 3000rpm dönerler. Süpernatantı.
- 0.1MLiOAc/1XTE çözüm (0.1M LiOAc, 10mM Tris, 1mm EDTA, otoklavlanmış distile su, pH 8) hazırlayın. 100 ml 0.1MLiOAc/1XTE hücrelerin yıkayın. 5 dakika 3000rpm dönerler. Süpernatantı.
- 70mL 0.1M LiOAc/1xTE yeniden süspanse hücre pelletini. Shake ve / veya vorteks pelet tamamen yeniden süspanse sağlamak için.
- 30 ° C'de 30 dakika (200 rpm) sallayarak inkübe edin.
- 0.1M için β-mercaptoethanol ekleyin. 30 ° C'de 30 dakika (200 rpm) sallayarak inkübe edin. Not: beta-mercaptoethanol duyarlı maya suşu kullanılarak, bu adım atlanabilir. Biz bu adımı başarılı bir dönüşüm için zorunlu olduğunu bulduk, ancak dönüşüm verimliliği artırmak.
- Sonicated somon sperm DNA (10mg/ml) 2mL 15 dakika boyunca kaynatın ve ardından buz üzerinde soğutun.
- 2mL haşlanmış somon sperm DNA hücre karışımı ekleyin. Dikkat: hücre karışımı somon sperm DNA eklenmesi halinde bir çökelti. Pipetman ve 200 ul ucu kullanarak, dikkatli bir şekilde bu mansap pipetleme engel olabilir çünkü formları herhangi bir çökelti kaldırın.
- 96-plaka BioRobot Rapidplate kullanarak her bir kuyunun hücre karışımı kısım 50μL (aynı zamanda çok kanallı pipet kullanabilirsiniz). Karışmaz.
- Sallayarak 30 dakika oda sıcaklığında inkübe edin.
- 200ml 40% PEG-3350/10% DMSO/0.1M LiOAc (160mL% 50 PEG-3350, 20ml DMSO, 20ml 1M LiOAc) hazırlayın. Kullanımdan hemen önce çözüm hazırlayın.
- Her iyi PEG / LioAc / DMSO çözüm 125μL ekleyin. RapidPlate ile sekiz kez aspire ve hücre süspansiyonu dağıtım karıştırın.
- Sallayarak 30 dakika oda sıcaklığında inkübe edin.
- Isı şok hücreleri 42 ° C 15 dakika boyunca kuru bir inkübatör. Plakalar koymayın. Not: Bu ısı şok adım başarılı bir dönüşüm için gerekli olduğunu bulduk. Bazı maya suşları (örneğin, ısıya duyarlı mutantlar), ısı şok zararlı. Daha önce bir dakika ısı şok süresini azalttı ve bu protokolü kullanarak ypt1 ısıya duyarlı mutasyon barındıran bir maya suşu başarıyla dönüştürmek mümkün olmuştur.
- 96-kuyucuğu karşılamak için santrifüj adaptörleri kullanarak, 5 dakika için 2500rpm (~ 1100 xg) plakaları Spin. Atık kovası üzerinde tersini plakaları ile PEG çözüm çıkarın. Kalan sıvı kaldırmak için kağıt havlu üzerine ters plaka Blot (hücreleri kuyu altında kalacaktır).
- RapidPlate her iyi minimal medya 200μL ekleyerek (örneğin SD /-Ura) hücreleri durulayın.
- 2500rpm az 5 dakika boyunca plakalar Spin ve tersini üzerinde atık kovası ve kağıt havlu üzerinde blot süpernatant kaldırmak.
- RapidPlate ile her kuyuya 200μL minimal medya (örneğin SD /-Ura) ekleyin.
- Titreme olmadan 2 gün boyunca 30 ° C'de inkübe edin. 2 gün sonra, hücre başarıyla iyi dönüştürülmüş her altındaki küçük koloniler oluşturmak için başlamalıdır.
3. Tahlil Spotting
- Her kuyuya raffinose tabanlı minimal medya (örneğin SRaf /-Ura) 200μL Uygulamayeni bir düz-alt 96-plaka.
- Rapidplate ile sekiz kez aspire ve hücre süspansiyonu dağıtım dönüşüm plaka her iyi karıştırın.
- Dönüşüm plaka hücre karışımı 5μL ile SRaf plakalarını aşılamak.
- Bir gün için 30 ° C'de inkübe edin. Küçük kolonileri bir gün sonra, her bir kuyunun dibinde mevcut olmalıdır.
- SD / Ura ve kaputu SGal /-Ura plakaları Spot koloniler. 96-cıvata çoğaltıcı (Frogger) alev tarafından sterilize edin. Frogger ile seçici besiyerleri plakaları lekelenme önce koloniler karıştırın. Lekelenme sonra, tabak, 5-10 dakika kaputu kurumasını bekleyin.
- 2-3 gün boyunca 30 ° C'de inkübe edin.
Dijital kamera ile fotoğraf plakaları ve görsel SGal /-Ura plakaları sorgu gerginlik toksisite (hızlı büyüme / daha yoğun koloniler) (daha yavaş büyüme / daha az yoğun koloniler) ya da bastırılmış gelişmiş olduğu koloniler bulmak için kolonilerin büyüme karşılaştırmak.
4. Temsilcisi sonuçları:
Şekil 1. Maya plazmid aşırı ekspresyonu TDP-43 toksisite bastırıcılarının ve arttırıcılar tanımlamak için ekran. TDP-43 Amyotrofik lateral skleroz (Lou Gehrig hastalığı) patogenezinde sorumlu olan bir insan proteini. TDP-43 Sitoplazmik agrega ALS hastası 17 beyin ve omurilik nöronlarının birikir. Agregasyonu ve sitotoksisite 18 maya hücreleri sonuçları ifade TDP-43. Biz TDP-43 toksisite 19,20 mekanizmaları tanımlamak için bu model sistem kullandık. Gösterilen bizim maya TDP-43 toksisite değiştirici ekran plaka repesentative örnekler. Bu plakalar FLEXGene ORF ifade kütüphane plazmid ile entegre bir galaktoz-indüklenebilir TDP-43 plazmid ve aynı zamanda dönüştürülmüş koloniler gösterilecek. Soldaki plaka TDP-43 veya FLEXGene plazmid ifade bastıran glikoz içerir. Sağdaki plaka TDP-43 ekspresyonu ve FLEXGene plazmid Orfs neden olur galaktoz içerir. Yeşil ok ucu TDP-43 toksisite bastırır bir plazmid ile dönüştürülmüş bir koloni gösterir. Kırmızı ok ucu TDP-43 toksisitesini arttırır bir plazmid ile dönüştürülmüş bir koloni gösterir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada maya yüksek verimli bir plazmid aşırı ekspresyonu ekran gerçekleştirmek için bir protokol mevcut. Bu yaklaşım, birçok farklı hücre fenotipleri genetik nitelemeler için hızlı ve tarafsız bir tarama sağlar. Bu yaklaşımı kullanarak, bir araştırmacı, birkaç hafta içinde maya genomu önemli bir bölümünü ekrana. Bu tarafsız bir yaklaşım aynı zamanda, önceki bulgulara göre tahmin edilmiş olabilir değiştirici belirlenmesi için olanak sağlar. Biz insan nörodejeneratif hastalık proteinlerin 19,21-23 toplama ile ilişkili toksisite değiştiriciler tanımlamak için bu yaklaşımı kullandık. Ancak, bu protokolün diğer hücresel süreçleri incelemek için adaptasyon nedeniyle, bu protokol önemli biyolojik sorular geniş bir yelpazede ele araştırmacılara yararlı olacaktır. Örneğin, biz de, çevresel stres, ağır metaller ve oksidatif stres de dahil olmak üzere uyum içinde ilgili genlerin ve yolların belirlenmesi için bu tarama yaklaşımı yararlı bulduk. Burada bir plazmid kütüphane, Maya FLEXGene kütüphane 9 odaklanmıştır. Ancak, 6,8 bu ekranlar için de olabilir, diğer birkaç maya plazmid kütüphaneler, vardır .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma, Johns Hopkins ALS Araştırma Packard Merkezi (ADG), NIH Müdürü Yenilikçisi Ödülü 1DP2OD004417-01 (ADG), NIH R01 NS065317 (ADG), Rita Allen Vakfı Scholar Ödülü bir hibe ile desteklenmiştir. ADG Pew Charitable Ortaklıkları tarafından desteklenen Biyomedikal Bilimler Pew Scholar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BioRobot RapidPlate | Qiagen | 9000490 | |
| 96 bolt replicator (frogger) | V&P Scientific | VP404 | |
| FLEXGene ORF Library | Institute of Proteomics, Harvard Medical School | ||
| Tabletop centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| 500mL baffled flask | Bellco Glass | 2543-00500 | |
| 2.8L triple-baffled Fernbach flask | Bellco Glass | 2551-02800 | |
| 100μL Rapidplate pipette tips | Axygen Scientific | ZT-100-R-S | |
| 200μL Rapidplate pipette tips | Axygen Scientific | ZT-200-R-S |
References
- Nurse, P. The Nobel Prize and beyond: an interview with Sir Paul Nurse. Interview by Susan R. Owens. EMBO Rep. 3, 204-206 (2002).
- Hartwell, L. H. Nobel Lecture. Yeast and cancer. Biosci Rep. 22, 373-394 (2002).
- Stevens, T., Esmon, B., Schekman, R. Early stages in the yeast secretory pathway are required for transport of carboxypeptidase Y to the vacuole. Cell. 30, 439-448 (1982).
- Novick, P., Ferro, S., Schekman, R. Order of events in the yeast secretory pathway. Cell. 25, 461-469 (1981).
- Novick, P., Field, C., Schekman, R. Identification of 23 complementation groups required for post-translational events in the yeast secretory pathway. Cell. 21, 205-215 (1980).
- Sopko, R. Mapping pathways and phenotypes by systematic gene overexpression. Mol Cell. 21, 319-330 (2006).
- Alberti, S., Gitler, A. D., Lindquist, S. A suite of Gateway((R)) cloning vectors for high-throughput genetic analysis in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 24, 913-919 (2007).
- Gelperin, D. M. Biochemical and genetic analysis of the yeast proteome with a movable ORF collection. Genes Dev. 19, 2816-2826 (2005).
- Hu, Y. Approaching a complete repository of sequence-verified protein-encoding clones for Saccharomyces cerevisiae. Genome Res. 17, 536-543 (2007).
- Giaever, G. Functional profiling of the Saccharomyces cerevisiae genome. Nature. 418, 387-391 (2002).
- Boone, C., Bussey, H., Andrews, B. J. Exploring genetic interactions and networks with yeast. Nat Rev Genet. 8, 437-449 (2007).
- Mnaimneh, S. Exploration of essential gene functions via titratable promoter alleles. Cell. 118, 31-44 (2004).
- Parsons, A. B. Integration of chemical-genetic and genetic interaction data links bioactive compounds to cellular target pathways. Nat Biotechnol. 22, 62-69 (2004).
- Schuldiner, M. Exploration of the function and organization of the yeast early secretory pathway through an epistatic miniarray profile. Cell. 123, 507-519 (2005).
- Tong, A. H. Systematic genetic analysis with ordered arrays of yeast deletion mutants. Science. 294, 2364-2368 (2001).
- Tong, A. H. Global mapping of the yeast genetic interaction network. Science. 303, 808-813 (2004).
- Neumann, M. Ubiquitinated TDP-43 in frontotemporal lobar degeneration and amyotrophic lateral sclerosis. Science. 314, 130-133 (2006).
- Johnson, B. S., McCaffery, J. M., Lindquist, S., Gitler, A. D. A yeast TDP-43 proteinopathy model: Exploring the molecular determinants of TDP-43 aggregation and cellular toxicity. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 6439-6444 (2008).
- Elden, A. C. Ataxin-2 intermediate-length polyglutamine expansions are associated with increased risk for ALS. Nature. 466, 1069-1075 (2010).
- Johnson, B. S. TDP-43 is intrinsically aggregation-prone, and amyotrophic lateral sclerosis-linked mutations accelerate aggregation and increase toxicity. J Biol Chem. 284, 20329-20339 (2009).
- Cooper, A. A. Alpha-synuclein blocks ER-Golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson's models. Science. 313, 324-328 (2006).
- Gitler, A. D. Beer and Bread to Brains and Beyond: Can Yeast Cells Teach Us about Neurodegenerative Disease? Neurosignals. 16, 52-62 (2008).
- Gitler, A. D. Alpha-synuclein is part of a diverse and highly conserved interaction network that includes PARK9 and manganese toxicity. Nat Genet. 41, 308-315 (2009).
