Summary
在这里，我们描述了一个质粒的过度表达屏幕
Abstract
芽殖酵母， 酿酒酵母 ，是一个强大的模型系统，用于定义许多重要的细胞过程，包括那些与人类疾病直接相关的基本机制。由于其短的一代人的时间和特点是基因组，实验酵母模型系统的一个主要优势是能够进行遗传筛选，以确定基因和途径，是在一个给定的过程中涉及的。在过去的三十多年，这种遗传屏幕已被用来阐明细胞周期，分泌途径，以及更高度保守的许多方面的真核细胞生物学1-5。在过去的几年里中，几个酵母菌株和质粒基因组库已产生 6-10 。这些藏品现在允许对基因功能的系统，使用增益和损失功能的方法11-16的审讯。在这里，我们提供了一个详细的协议，与液体处理机器人执行质粒的过度表达屏幕使用一种高通量的酵母转化协议使用5500酵母质粒摆着库。我们一直在使用这些画面，找出容易发生聚集人类神经退行性疾病的蛋白质的积累相关的遗传毒性修饰符。这里介绍的方法很容易适应其他感兴趣的细胞表型的研究。
Protocol
1。酵母转化的筹备工作
此协议是专为10个96孔板，但可以向上或向下扩展。我们发现，这个协议不超过二96孔盘每一轮的转型工作。整个改造过程（步骤I.3），将需要约8小时。
- 分装到每一个圆底96孔板Biorobot RapidPlate液体处理程序以及FLEXGene从酵母的ORF库的质粒DNA（为100 ng /μL）5 -10μL。放置在洁净工作台，通风柜一夜之间干破获96孔板。我们已经发现类似与CEN和2μ酵母质粒转化效率。
- 查询应变，在500毫升莫名其妙锥形瓶中，接种酵母葡萄糖蛋白胨（YPD）媒体（10G / L酵母提取物，20G / L蛋白胨，20G / L葡萄糖）的200毫升。在30 ° C孵育过夜用颤抖的（200转）。如果需要，有选择性的媒体也可以被用于这些起动的文化。
- 翌日清晨，淡化查询应变外径600 = 0.1的YPD 2L。摇4-6小时，在30 ° C（200转），直到文化达到外径600 = 0.8-1.0。为最佳生长，长大了两个独立的2.8大号莫名其妙烧瓶1L文化。如果需要，选择性的媒体也可以被用来代替YPD。
2。酵母转化
- 离心收集细胞。在3000RPM（〜1800 XG）填写四个一次性225mL锥形管与酵母培养和自旋为5分钟在台式离心机（Eppendorf公司5810R）。倒掉上清液，重复，直到所有的细胞都收获。
- 在200毫升灭菌蒸馏水H 2 O洗细胞悬浮细胞沉淀，摇晃或震荡。结合在一个225mL的锥形管的细胞。在3000RPM旋转5分钟。去除上清液。
- 准备0.1MLiOAc/1XTE溶液（0.1M LiOAc，10MM三，为1mM EDTA，灭菌蒸馏水的pH值在8）。在100毫升0.1MLiOAc/1XTE清洗细胞。在3000RPM旋转5分钟。去除上清液。
- 悬浮细胞沉淀在70mL 0.1M LiOAc/1xTE。 Shake和/或涡流，以确保完全重悬沉淀。
- 孵育30分钟（200转）在30 ° C震动。
- 添加β-巯基乙醇0.1M。孵育30分钟（200转）在30 ° C震动。注意：此步骤可以省略，如果使用比较敏感的β-巯基乙醇的酵母菌株。我们发现，这一步是成功转型的重要，但它确实提高转化效率。
- 2ML超声鲑鱼精子DNA（10mg/ml的），煮沸15分钟，然后在冰上寒意。
- 将水煮鲑鱼精子DNA 2ML添加到细胞的混合物。注意：沉淀，可能会形成另外的鲑鱼精子DNA的细胞混合物后。使用pipetman和200μL提示，小心地取出任何沉淀的形式，因为这可能会干扰下游吹打。
- 分装50μL细胞的混合物以及每96孔板使用BioRobot Rapidplate（也可以使用多通道移液器）。不要混用。
- 在室温30分钟孵育无晃动。
- 准备200毫升的40％PEG-3350/10％DMSO/0.1M LiOAc（160毫升50％的PEG - 3350，二甲基亚砜20ML，20ML 1M LiOAc）。使用前准备的解决方案。
- 添加PEG / LioAc / DMSO溶液，每孔125μL。混合吸气和配药细胞悬液与RapidPlate八次。
- 在室温30分钟孵育无晃动。
- 热休克的细胞在42℃，在干燥的孵化器15分钟。请勿堆叠板。注：我们发现，这种热休克步骤是没有成功转型的必要条件。对于某些酵母菌株（例如，温度敏感突变体），热休克是有害的。我们以前已减少了热休克时间一分钟，已经能够成功地改造了窝藏一个ypt1使用此协议的温度敏感突变的酵母菌株。
- 转速2500RPM（〜1100 XG）板5分钟，用离心机适配器，以适应96孔板。卸下的废物桶反相板PEG解决方案。纸巾吸干倒板除去残留的液体（细胞将保持井底）。
- 冲洗细胞，加入200μL最小的媒体（如SD / -市建局）与RapidPlate每口井。
- 转速2500RPM板5分钟，取出上清液反相的废物桶和纸巾印迹。
- 基本培养基中加入200μL（例如SD /浦），每孔RapidPlate。
- 在30℃培养2天，无晃动。术后第2天，小菌落的细胞应该在每个成功转型以及的底部开始形成。
3。合模检测
- 棉子糖的基本培养基（如SRaf /市建局）免除到每个井200μL一个新的平底96孔板。
- 混合吸气和配药细胞悬液与Rapidplate八次每个改造板以及。
- 接种细胞的混合物5μL改造板SRaf板。
- 在30 ° C孵育一天。一天后的小菌落，应在每口井的底部。
- SD / -市建局和SGal /市建局在罩板现货殖民地。消毒燃烧96螺栓复制（青蛙过河）。混合前斑点选择性培养基平板上的菌落与青蛙过河。察觉后，允许在5-10分钟的防护罩板干。
- 在30 ° C培养2-3天。
板与数码相机的照片，并直观地比较SGal /浦板菌落生长菌落查询菌株毒性增强（增长放缓/密度较小的菌落）或抑制（增长更快/更密集的殖民地）。
4。代表性的成果：
图1。酵母质粒过度表达屏幕的TDP - 43的毒性，以确定抑制器和增强剂。 TDP - 43已在肌萎缩性脊髓侧索硬化症（卢伽雷氏症）的发病机制有牵连的人类蛋白质。 TDP - 43的细胞质体积累在大脑和脊髓神经元的ALS患者17。在酵母细胞聚集和细胞毒性18中表达TDP - 43 。我们用这个模型系统的机制来定义的TDP - 43的毒性19,20。 repesentative板的例子，从我们的酵母TDP - 43的毒性修饰符屏幕显示。这些板块显示一个综合的半乳糖诱导的TDP - 43质粒与FLEXGene ORF表达文库的质粒也改变殖民地。左边的板含有葡萄糖，压抑TDP - 43或FLEXGene质粒的表达。在右边的板块包含半乳糖诱导的TDP - 43的表达和FLEXGene质粒的ORF。绿色箭头表示抑制TDP - 43的毒性与质粒转化殖民地。红色箭头表示增强TDP - 43的毒性质粒转化的一个殖民地。
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Discussion
在这里，我们提出了一个协议来执行一种高通量质粒在酵母中的过度表达屏幕。这种方法可以让许多不同的细胞表型的遗传修饰词的迅速和公正的筛选。使用这种方法，研究人员可以在几个星期内屏幕的酵母基因组中的一个重要部分。这种不偏不倚的方式也可以修饰词的识别，预测基于以前的研究结果可能没有被。我们已经用这种方法来确定与人类神经退行性疾病的蛋白质的聚集 19,21-23相关的毒性修饰符。然而，由于本议定书的适应性研究其他细胞的过程，这个协议将有助于解决一个重要的生物学问题的广泛的研究人员。举例来说，我们也发现了这种筛选方法有助于确定基因和适应环境的压力，包括重金属及氧化应激参与的途径。在这里，我们都集中在一个质粒文库，酵母FLEXGene库9。不过，也有其他几个酵母质粒库，也可使用这些屏幕6,8。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作是由惠普ALS研究中心的约翰霍普金斯（ADG），美国国立卫生研究院主任的新的创新奖1DP2OD004417 - 01（ADG），美国国立卫生研究院R01 NS065317（ADG），丽塔艾伦基金会学者奖授予的支持。助理总干事，是由皮尤慈善信托基金支持的“皮尤研究中心的学者，在生物医学科学”。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BioRobot RapidPlate | Qiagen | 9000490 | |
| 96 bolt replicator (frogger) | V&P Scientific | VP404 | |
| FLEXGene ORF Library | Institute of Proteomics, Harvard Medical School | ||
| Tabletop centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| 500mL baffled flask | Bellco Glass | 2543-00500 | |
| 2.8L triple-baffled Fernbach flask | Bellco Glass | 2551-02800 | |
| 100μL Rapidplate pipette tips | Axygen Scientific | ZT-100-R-S | |
| 200μL Rapidplate pipette tips | Axygen Scientific | ZT-200-R-S |
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