Summary
Hier beschreiben wir ein Plasmid Überexpression Bildschirm in
Abstract
Die Bierhefe, Saccharomyces cerevisiae, ist ein leistungsfähiges Modell für die Definition grundlegenden Mechanismen von vielen wichtigen zellulären Prozessen, einschließlich solcher mit unmittelbarer Relevanz für menschliche Krankheiten. Wegen seiner kurzen Generationszeit und gut charakterisierten Genoms, ist ein großer experimenteller Vorteil der Hefe Modellsystem die Fähigkeit, genetische Screens durchgeführt, um Gene und Signalwege, die in einem bestimmten Prozess beteiligt sind zu identifizieren. Im Laufe der letzten 30 Jahre solche genetischen Screens wurden verwendet, um den Zellzyklus, Sekretionsweg, und viele weitere hochkonservierte Aspekte der eukaryotischen Zelle Biologie 1-5 aufzuklären. In den letzten Jahren haben mehrere genomweiten Bibliotheken Hefestämme und Plasmide wurden 6-10 generiert. Diese Sammlungen erlauben nun für die systematische Befragung der Genfunktion mit Gewinn-und Verlust-of-function Ansätze 11-16. Hier bieten wir Ihnen ein detailliertes Protokoll für den Einsatz eines High-Throughput-Hefe-Transformation-Protokoll mit einem Liquid-Handling-Roboter ein Plasmid Überexpression Bildschirm durchführen, mit einem Array-Bibliothek von 5.500 Hefeplasmide. Wir verwenden diese Bildschirme zu genetischen Modifikatoren der Toxizität mit der Akkumulation von Aggregation neigende menschliche neurodegenerative Erkrankung Proteinen assoziiert zu identifizieren. Die hier vorgestellten Methoden sind leicht an das Studium der anderen zellulären Phänotypen von Interesse.
Protocol
1. Die Vorbereitungen für die Hefe-Transformation
Dieses Protokoll wird für zehn 96-Well-Platten ausgelegt, kann jedoch vergrößert oder verkleinert entsprechend. Wir haben festgestellt, dass dieses Protokoll nicht gut funktioniert seit mehr als zwanzig 96-Well-Platten pro Runde der Transformation. Die gesamte Transformation Verfahren (aus Schritt I.3) dauert ca. 8 Stunden.
- Aliquot 5-10 &mgr; l von Plasmid-DNA (100 ng / ul) aus der Hefe FLEXGene ORF-Bibliothek in jede Vertiefung einer Rundboden-96-well-Platte mit Biorobot RapidPlate Liquid Handler. Legen Sie entdeckt 96-Well-Platten in Sterilbank Abzug über Nacht trocknen lassen. Wir haben ähnliche Transformation Wirkungsgrade bei CEN und 2μ Hefeplasmide gefunden.
- Impfen 200ml Hefe Pepton Dextrose (YPD) Medien (10 g / L Hefeextrakt, 20 g / l Pepton, 20 g / L Glucose) mit Abfrage-Stammes in einem 500 ml Erlenmeyerkolben ratlos. Inkubieren über Nacht bei 30 ° C unter Schütteln (200 rpm). Falls erforderlich, können selektive Medien auch für diese Starterkulturen verwendet werden.
- Am nächsten Morgen, verdünnte die Abfrage Stamm OD 600 = 0,1 in 2L YPD. Schütteln für 4-6 Stunden bei 30 ° C (200 rpm), bis die Kultur erreicht OD 600 = 0,8 bis 1,0. Für ein optimales Wachstum, wachsen zwei Kulturen 1L in separaten 2,8 L Flaschen ratlos. Falls erforderlich, können selektive Medien auch anstelle von YPD verwendet werden.
2. Hefe-Transformation
- Ernten Sie die Zellen durch Zentrifugation. Füllen Sie vier Einweg-225ml konische Röhrchen mit Hefekulturen und drehen sich mit 3000rpm (~ 1800 xg) für 5 Minuten in Tischzentrifuge (Eppendorf 5810R). Überstand abgießen und wiederholen, bis alle Zellen geerntet werden.
- Wash-Zellen in 200 ml autoklaviert destilliertem H 2 O. Resuspendieren Zellpellet durch Schütteln oder Vortexen. Kombinieren Sie Zellen in einer 225ml konischen Rohr. Spin bei 3000rpm für 5 Minuten. Überstand entfernen.
- Bereiten 0.1MLiOAc/1XTE-Lösung (0,1 M LiOAc, 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8 in autoklaviert destilliertes Wasser). Wash-Zellen in 100ml 0.1MLiOAc/1XTE. Spin bei 3000rpm für 5 Minuten. Überstand entfernen.
- Resuspendieren Zellpellet in 70mL 0,1 M LiOAc/1xTE. Schütteln und / oder Wirbel um sicherzustellen, Pellet vollständig resuspendiert.
- Inkubieren unter Schütteln bei 30 ° C für 30 Minuten (200 rpm).
- Add β-Mercaptoethanol bis 0,1. Inkubieren unter Schütteln bei 30 ° C für 30 Minuten (200 rpm). Hinweis: Dieser Schritt kann entfallen, wenn durch Hefestämme, die empfindlich auf β-Mercaptoethanol werden. Wir haben festgestellt, dass dieser Schritt nicht notwendig für eine erfolgreiche Transformation, aber es verbessert die Transformationseffizienz.
- Boil 2mL beschallte Lachssperma-DNA (10mg/ml) für 15 Minuten, und dann kalt auf dem Eis.
- Add 2 ml gekochtem Lachs-Sperma-DNA der Zelle Mischung. Achtung: Ein Niederschlag kann durch Zugabe des Lachssperma-DNA in die Zelle Gemisch bilden. Mit einem Pipetman und 200 ul Spitze, entfernen Sie vorsichtig ausfallen, weil diese mit nachgeschaltetem Pipettieren stören können Formen.
- Aliquot 50 ul Zellgemisch in jede Vertiefung der 96-Well-Platte mit dem BioRobot Rapidplate (können auch Mehrkanal-Pipette). Nicht mischen.
- Inkubieren bei Raumtemperatur für 30 Minuten ohne Schütteln.
- Bereiten Sie 200 mL 40% PEG-3350/10% DMSO/0.1M LiOAc (160ml von 50% PEG-3350, 20 mL DMSO, 20 ml 1M LiOAc). Bereiten Lösung unmittelbar vor Gebrauch.
- Fügen Sie 125μL der PEG / LiOAc / DMSO-Lösung in jede Vertiefung. Mix von Aufnahme und Abgabe Zellsuspension achtmal mit RapidPlate.
- Inkubieren bei Raumtemperatur für 30 Minuten ohne Schütteln.
- Hitzeschock der Zellen bei 42 ° C für 15 Minuten in einem trockenen Inkubator. Stapeln Sie nicht Platten. Hinweis: Wir haben festgestellt, dass diese Hitzeschock Schritt ist nicht notwendig für eine erfolgreiche Transformation. Für bestimmte Hefestämme (zB temperaturempfindliche Mutanten), ist Hitzeschock schädlich. Wir haben zuvor die Hitzeschock-Zeit bis zu einer Minute reduziert und konnten erfolgreich verwandeln einen Hefestamm enthaltend ein ypT1 temperaturempfindliche Mutation dieses Protokoll verwenden.
- Spin-Platten bei 2500rpm (~ 1100 xg) für 5 Minuten, mit Zentrifuge Adapter auf 96-Well-Platten aufnehmen. Entfernen PEG-Lösung durch Invertieren Platten über Abfalleimer. Blot umgekehrten Platte auf Küchenpapier, um restliche Flüssigkeit zu entfernen (Zellen am Boden der Vertiefungen verbleiben).
- Rinse-Zellen durch Zugabe von 200 ul von minimal Medien (zB SD /-Ura) in jede Vertiefung mit RapidPlate.
- Spin-Platten bei 2500rpm für 5 Minuten und entfernen Sie durch Umdrehen über Abfallbehälter und Blotting auf Küchenpapier Überstand.
- Add 200 ul von minimal Medien (zB SD /-Ura) in jede Vertiefung mit RapidPlate.
- Inkubation bei 30 ° C für 2 Tage ohne Schütteln. Nach 2 Tagen sollten kleine Kolonien von Zellen beginnen, am Ende jeder erfolgreich transformiert und zu bilden.
3. Spotting-Test
- Dispense 200 ul von Raffinose Basis minimal Medien (zB SRaf /-Ura) in jedes Well dereine neue flachem Boden 96-Well-Platte.
- Mix jede Vertiefung der Transformation Platte durch Aufnahme und Abgabe Zellsuspension achtmal mit Rapidplate.
- Impfen SRaf Platten mit 5μL der Zelle Mischung aus Transformation Platte.
- Inkubation bei 30 ° C für einen Tag. Kleine Kolonien sollte am unteren Rand jeder gut präsentieren nach einem Tag.
- Spot Kolonien auf SD /-Ura und SGal /-Ura-Platten in der Kapuze. Sterilisieren 96-Bolzen-Replikator (frogger) durch Abflammen. Mix Kolonien mit frogger vor Spotting auf selektiven Medien Platten. Nach Spotting, erlauben Platten in der Kapuze für 5-10 Minuten trocknen lassen.
- Inkubation bei 30 ° C für 2-3 Tage.
Foto-Platten mit Digitalkamera und visuell vergleichen Wachstum von Kolonien auf SGal /-Ura Platten Kolonien, in denen Abfrage Belastung Toxizität erhöht (langsamere Wachstum / weniger dichten Kolonien) oder unterdrückt (schnelleres Wachstum / dichter Kolonien) zu finden.
4. Repräsentative Ergebnisse:
Abbildung 1. Hefeplasmid Überexpression Bildschirm, um Suppressoren und Enhancer von TDP-43 Toxizität identifizieren. TDP-43 ist ein menschliches Protein, das in der Pathogenese der Amyotrophe Lateralsklerose (Lou-Gehrig-Krankheit) eine Rolle spielt. Zytoplasmatischen Aggregate von TDP-43 sammeln sich im Gehirn und Rückenmark Neuronen von ALS-Patienten 17. Ausdruck TDP-43 in Hefezellen führt zur Aggregation und Zytotoxizität 18. Wir haben dieses Modell verwendet, um Mechanismen der TDP-43 Toxizität 19,20 definieren. Dargestellt sind repesentative Beispiele von Platten aus unserem Hefe TDP-43 Toxizität modifier Bildschirm. Diese Platten Display Kolonien mit einem integrierten Galaktose-induzierbaren TDP-43-Plasmid und auch transformiert mit Plasmiden aus der FLEXGene ORF Expressions-Bibliothek. Die Platte auf der linken Seite enthält Glucose, welche die Expression von TDP-43 oder die FLEXGene Plasmide verdrängt. Die Platte auf der rechten Seite enthält Galaktose, die die Expression von TDP-43 und die ORFs in der FLEXGene Plasmide induziert. Der grüne Pfeil zeigt eine Kolonie mit einem Plasmid, dass die Toxizität von TDP-43 unterdrückt umgewandelt. Der rote Pfeil zeigt eine Kolonie mit einem Plasmid, dass die Toxizität von TDP-43 erhöht umgewandelt.
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Discussion
Hier präsentieren wir ein Protokoll zu einem High-Throughput-Plasmid-Überexpression in der Hefe Bildschirm ausführen. Dieser Ansatz ermöglicht die schnelle und unvoreingenommene Screening auf genetische Modifikatoren von vielen verschiedenen zellulären Phänotypen. Mit diesem Ansatz kann ein Forscher einen bedeutenden Teil des Hefe-Genoms in einer Angelegenheit von Wochen-Bildschirm. Diese unvoreingenommene Herangehensweise ermöglicht auch die Identifizierung von Modifikatoren, die nicht vorhergesagt basierend auf bisherigen Erkenntnissen haben. Wir haben diesen Ansatz verwendet, um Modifikatoren der Toxizität mit der Aggregation von menschlichen neurodegenerativen Erkrankung Proteine 19,21-23 verbunden zu identifizieren. Doch aufgrund der Anpassungsfähigkeit dieses Protokolls an andere zelluläre Prozesse zu untersuchen, wird dieses Protokoll nützlich sein, um Forscher zu einem breiten Spektrum von wichtigen biologischen Fragen. Zum Beispiel haben wir fanden auch diese Screening-Ansatz nützlich für die Identifizierung von Genen und Bahnen in Anpassung an die Umwelt-Stressoren, darunter Schwermetalle und oxidativen Stress beteiligt. Hier haben wir auf einem Plasmid-Bibliothek, die Hefe FLEXGene Bibliothek 9 fokussiert. Es gibt jedoch mehrere andere Hefeplasmid Bibliotheken zur Verfügung, die auch für diese Bildschirme 6,8 verwendet werden könnten.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss aus dem Packard Zentrum für ALS-Forschung an der Johns Hopkins (ADG), ein NIH Director des New Innovator Award 1DP2OD004417-01 (ADG), NIH R01 NS065317 (ADG), der Rita Allen Foundation Scholar Award unterstützt. ADG ist ein Pew Scholar in der Biomedizin, von The Pew Charitable Trusts unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BioRobot RapidPlate | Qiagen | 9000490 | |
| 96 bolt replicator (frogger) | V&P Scientific | VP404 | |
| FLEXGene ORF Library | Institute of Proteomics, Harvard Medical School | ||
| Tabletop centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| 500mL baffled flask | Bellco Glass | 2543-00500 | |
| 2.8L triple-baffled Fernbach flask | Bellco Glass | 2551-02800 | |
| 100μL Rapidplate pipette tips | Axygen Scientific | ZT-100-R-S | |
| 200μL Rapidplate pipette tips | Axygen Scientific | ZT-200-R-S |
References
- Nurse, P. The Nobel Prize and beyond: an interview with Sir Paul Nurse. Interview by Susan R. Owens. EMBO Rep. 3, 204-206 (2002).
- Hartwell, L. H. Nobel Lecture. Yeast and cancer. Biosci Rep. 22, 373-394 (2002).
- Stevens, T., Esmon, B., Schekman, R. Early stages in the yeast secretory pathway are required for transport of carboxypeptidase Y to the vacuole. Cell. 30, 439-448 (1982).
- Novick, P., Ferro, S., Schekman, R. Order of events in the yeast secretory pathway. Cell. 25, 461-469 (1981).
- Novick, P., Field, C., Schekman, R. Identification of 23 complementation groups required for post-translational events in the yeast secretory pathway. Cell. 21, 205-215 (1980).
- Sopko, R. Mapping pathways and phenotypes by systematic gene overexpression. Mol Cell. 21, 319-330 (2006).
- Alberti, S., Gitler, A. D., Lindquist, S. A suite of Gateway((R)) cloning vectors for high-throughput genetic analysis in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 24, 913-919 (2007).
- Gelperin, D. M. Biochemical and genetic analysis of the yeast proteome with a movable ORF collection. Genes Dev. 19, 2816-2826 (2005).
- Hu, Y. Approaching a complete repository of sequence-verified protein-encoding clones for Saccharomyces cerevisiae. Genome Res. 17, 536-543 (2007).
- Giaever, G. Functional profiling of the Saccharomyces cerevisiae genome. Nature. 418, 387-391 (2002).
- Boone, C., Bussey, H., Andrews, B. J. Exploring genetic interactions and networks with yeast. Nat Rev Genet. 8, 437-449 (2007).
- Mnaimneh, S. Exploration of essential gene functions via titratable promoter alleles. Cell. 118, 31-44 (2004).
- Parsons, A. B. Integration of chemical-genetic and genetic interaction data links bioactive compounds to cellular target pathways. Nat Biotechnol. 22, 62-69 (2004).
- Schuldiner, M. Exploration of the function and organization of the yeast early secretory pathway through an epistatic miniarray profile. Cell. 123, 507-519 (2005).
- Tong, A. H. Systematic genetic analysis with ordered arrays of yeast deletion mutants. Science. 294, 2364-2368 (2001).
- Tong, A. H. Global mapping of the yeast genetic interaction network. Science. 303, 808-813 (2004).
- Neumann, M. Ubiquitinated TDP-43 in frontotemporal lobar degeneration and amyotrophic lateral sclerosis. Science. 314, 130-133 (2006).
- Johnson, B. S., McCaffery, J. M., Lindquist, S., Gitler, A. D. A yeast TDP-43 proteinopathy model: Exploring the molecular determinants of TDP-43 aggregation and cellular toxicity. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 6439-6444 (2008).
- Elden, A. C. Ataxin-2 intermediate-length polyglutamine expansions are associated with increased risk for ALS. Nature. 466, 1069-1075 (2010).
- Johnson, B. S. TDP-43 is intrinsically aggregation-prone, and amyotrophic lateral sclerosis-linked mutations accelerate aggregation and increase toxicity. J Biol Chem. 284, 20329-20339 (2009).
- Cooper, A. A. Alpha-synuclein blocks ER-Golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson's models. Science. 313, 324-328 (2006).
- Gitler, A. D. Beer and Bread to Brains and Beyond: Can Yeast Cells Teach Us about Neurodegenerative Disease? Neurosignals. 16, 52-62 (2008).
- Gitler, A. D. Alpha-synuclein is part of a diverse and highly conserved interaction network that includes PARK9 and manganese toxicity. Nat Genet. 41, 308-315 (2009).
