Summary
כאן אנו מתארים מסך overexpression פלסמיד ב
Abstract
נבגי שמרים, cerevisiae Saccharomyces, היא מערכת מודל עוצמה להגדרת המנגנונים הבסיסיים של תהליכים תאיים רבים חשובים, כולל אלה עם שייכות ישירה מחלות אנושיות. בגלל הזמן הקצר של הדור שלה היטב מאופיין הגנום, יתרון הניסוי העיקריים של מערכת מודל שמרים היא היכולת לבצע מסכי גנטית כדי לזהות גנים המסלולים המעורבים בתהליך נתון. במשך שלושים השנים האחרונות מסכי גנטי כזה כבר בשימוש על מנת להבהיר את מחזור התא, מסלול הפרשה, והיבטים רבים יותר שמור ביותר של ביולוגיה של התא אוקריוטים 1-5. בשנים האחרונות, ספריות genomewide מספר זני שמרים פלסמידים נוצרו 6-10. אוספים אלה מאפשרים כעת לחקירה שיטתית של תפקוד הגן באמצעות רווח, והפסד של פונקציה גישות 11-16. כאן אנו מספקים פרוטוקול מפורט לשימוש פרוטוקול תפוקה גבוהה טרנספורמציה שמרים עם רובוט טיפול הנוזל לבצע מסך overexpression פלסמיד, באמצעות ספריה ערוכים של 5500 פלסמידים שמרים. אנחנו משתמשים במסכים אלה כדי לזהות מכפילי הגנטי של רעילות הקשורות הצטברות של צבירה נוטה חלבונים אנושיים מחלות ניווניות. השיטות שהוצגו כאן הם להתאמה בקלות ללימוד פנוטיפים סלולריים אחרים בעלי עניין.
Protocol
1. ההכנות לשינוי שמרים
פרוטוקול זה מיועד עשר צלחות 96-טוב אבל יכול להיות scaled למעלה או למטה בהתאם. מצאנו כי פרוטוקול זה לא עובד טוב יותר מעשרים 96-היטב צלחות בכל סבב של טרנספורמציה. הליך השינוי כולו (משלב I.3) ייקח בערך שמונה שעות.
- Aliquot 5-10μL של DNA פלסמיד (100 ng / μl) מן הספרייה שמרים ORF FLEXGene לתוך הבאר התחתון של כל עיגול 96-גם צלחת עם המטפל RapidPlate Biorobot נוזלי. המקום חשפו צלחות 96-היטב מכסה המנוע ספסל נקי קטר לילה יבש. מצאנו יעילות טרנספורמציה דומה עם CEN ו פלסמידים 2μ שמרים.
- לחסן 200 מ"ל של שמרים peptone דקסטרוז (YPD) מדיה (10g / L תמצית שמרים, 20 גרם / L peptone, 20 גרם / גלוקוז L) עם זן שאילתה בקבוק Erlenmeyer 500ml מבולבל. דגירה לילה בשעה 30 ° C עם רועד (200 סל"ד). במידת הצורך, מדיה סלקטיבי יכול לשמש גם עבור אלו תרבויות המתנע.
- למחרת בבוקר, לדלל את המתח שאילתה OD 600 = 0.1 ב 2L של YPD. Shake עבור 4-6 שעות בקצב של 30 ° C (200 סל"ד) עד התרבות מגיע OD 600 = 0.8-1.0. לצמיחה אופטימלית, לגדול שתי התרבויות 1 ליטר ב 2.8 צלוחיות נפרדות L מבולבל. במידת הצורך, מדיה סלקטיבי יכול לשמש גם במקום YPD.
2. שמרים שינוי
- קציר תאים על ידי צנטריפוגה. מלאו ארבעה צינורות הפנויה חרוטי 225mL עם התרבות שמרים ספין על 3000rpm (~ 1800 XG) במשך 5 דקות בצנטריפוגה השולחן (Eppendorf 5810R). יוצקים את supernatant וחזור עד שכל התאים נקצרים.
- שטפו תאים 200 מ"ל של autoclaved מזוקקים H 2 O. Resuspend תא גלולה ידי ניעור או vortexing. שלב התאים הגליל האחד חרוט 225mL. ספין על 3000rpm במשך 5 דקות. הסר supernatant.
- הכן פתרון 0.1MLiOAc/1XTE (0.1M LiOAc, 10mm טריס, 1mm EDTA, pH 8 במים מזוקקים autoclaved). שטפו תאים 0.1MLiOAc/1XTE 100 מ"ל. ספין על 3000rpm במשך 5 דקות. הסר supernatant.
- Resuspend תא גלולה ב 70mL 0.1M LiOAc/1xTE. Shake ו / או מערבולת כדי להבטיח גלולה הוא resuspended לחלוטין.
- דגירה עם רועד ב 30 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות (200 סל"ד).
- הוסף β-mercaptoethanol ל 0.1M. דגירה עם רועד ב 30 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות (200 סל"ד). הערה: שלב זה ניתן להשמיט אם באמצעות זני שמרים הרגישים mercaptoethanol-β. מצאנו כי צעד זה אינו הכרחי לשינוי מוצלח, אולם הוא עושה לשפר את יעילות הטרנספורמציה.
- מרתיחים 2ml של ה-DNA זרע sonicated סלמון (10mg/mL) למשך 15 דקות ולאחר מכן לצנן על הקרח.
- הוסף 2ml של ה-DNA סלמון מבושל זרע לתערובת התא. זהירות: המשקע עלול להיווצר על תוספת של ה-DNA סלמון זרע לתערובת התא. שימוש pipetman ו -200 μl טיפ, להסיר בזהירות כל המשקע שנוצר, כי זה עלול להפריע pipetting במורד הזרם.
- 50μL Aliquot תערובת של התא היטב בכל צלחת 96-היטב באמצעות Rapidplate BioRobot (ניתן גם להשתמש מרובת ערוצים פיפטה). אל תערבב.
- דגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות בלי לרעוד.
- הכן 200 מ"ל של 40% PEG-3350/10% DMSO/0.1M LiOAc (160mL של 50% PEG-3350, DMSO 20mL, LiOAc 20mL 1M). הכן פתרון מיד לפני השימוש.
- הוסף 125μL הפתרון PEG / LioAc / DMSO היטב כל אחד. מערבבים על ידי aspirating מחלק ההשעיה תא שמונה פעמים עם RapidPlate.
- דגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות בלי לרעוד.
- הלם מחממים את התאים על 42 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות בתוך אינקובטור יבש. אל ערימת הצלחות. הערה: מצאנו כי צעד זה הלם חום אינו חיוני לשינוי מוצלח. עבור זני שמרים מסוימים (למשל, מוטציות רגישות טמפרטורה), הלם החום מזיקות. צמצמנו בעבר הזמן הלם החום דקה אחת הצליחו להפוך בהצלחה זן שמרים מחסה מוטציה ypt1 טמפרטורה רגיש בפרוטוקול זה.
- ספין צלחות על 2500rpm (~ 1100 XG) במשך 5 דקות, באמצעות מתאמים צנטריפוגות כדי להכיל 96-גם הצלחות. הסר הפתרון PEG על ידי צלחות היפוך מעל דלי פסולת. כתם צלחת הפוכה על מגבת נייר כדי להסיר את נוזל שיורי (תאים יישארו בתחתית בארות).
- יש לשטוף את התאים על ידי הוספת 200μL התקשורת מינימלי (למשל SD /-עורה) היטב עם כל RapidPlate.
- ספין צלחות ב 2500rpm במשך 5 דקות ולהסיר supernatant ידי דלי היפוך פסולת שוב על מגבות נייר סופג.
- הוסף 200μL התקשורת מינימלי (למשל SD /-עורה) היטב עם כל RapidPlate.
- לדגור על 30 מעלות צלזיוס למשך 2 ימים בלי לרעוד. אחרי 2 ימים, מושבות קטנות של תאים צריך להתחיל לגבש בתחתית כל טרנספורמציה בהצלחה היטב.
3. אכון assay
- לוותר 200μL התקשורת raffinose מינימלי מבוסס (כגון השרף /-עורה) לתוך הבאר אחדחדש שטוח 96-התחתונה גם צלחת.
- מערבבים היטב את כל הצלחת השינוי על ידי aspirating מחלק ההשעיה תא שמונה פעמים עם Rapidplate.
- לחסן צלחות השרף עם 5μL תערובת תא מהצלחת שינוי.
- לדגור על 30 מעלות צלזיוס למשך יום אחד. מושבות קטנים צריכים להיות נוכחים בחלק התחתון של כל טוב אחרי יום אחד.
- ספוט מושבות על SD /-עורה ואת SGal /-עורה צלחות מכסה המנוע. לעקר 96-הבריח משכפל (Frogger) על ידי בוערים. מערבבים עם מושבות Frogger לפני תצפית על צלחות התקשורת סלקטיבית. לאחר תצפית, לאפשר צלחות לייבוש מכסה המנוע למשך 5-10 דקות.
- לדגור על 30 מעלות צלזיוס במשך 2-3 ימים.
צלחות צילום עם מצלמה דיגיטלית, ו חזותית להשוות צמיחה של מושבות על SGal /-עורה צלחות למצוא מושבות שבהן רעילות זן שאילתה משופרים (צמיחה איטית / מושבות פחות צפוף) או מודחקים (צמיחה מהיר / במושבות צפופות יותר).
4. נציג התוצאות:
באיור 1. Overexpression פלסמיד שמרים המסך כדי לזהות מדכאי ו משפרי של רעילות TDP-43. TDP-43 הוא חלבון אנושי כי היה מעורב בפתוגנזה של טרשת לרוחב amyotrophic (מחלת לו גריג). אגרגטים cytoplasmic של TDP-43 להצטבר במוח הנוירונים בחוט השדרה של חולי ALS 17. הבעת TDP-43 תוצאות בתאי שמרים צבירה cytotoxicity 18. השתמשנו במערכת זו מודל להגדיר מנגנוני הרעילות TDP-43 19,20. מוצגות דוגמאות של צלחות repesentative מן השמרים שלנו TDP-43 משנה מסך רעילות. לוחות אלה מציגים מושבות עם משולבת גלקטוז ועין מתנהלת-TDP-43 פלסמיד והפך גם עם פלסמידים מהספריה ביטוי FLEXGene ORF. צלחת בצד שמאל מכיל גלוקוז, אשר מדכא ביטוי TDP-43 או פלסמידים FLEXGene. צלחת בצד ימין מכיל גלקטוז, אשר מעוררת את הביטוי של TDP-43 ואת ORFs של פלסמידים FLEXGene. החץ הירוק מצביע על המושבה הפכה עם פלסמיד זה מדכא את הרעילות של TDP-43. החץ האדום מצביע על המושבה הפכה עם פלסמיד זה משפר את הרעילות של TDP-43.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן אנו מציגים פרוטוקול לבצע המסך תפוקה גבוהה overexpression פלסמיד בשמרים. גישה זו מאפשרת להקרנה מהירה משוחדת עבור מכפילי הגנטי של פנוטיפים רבים סלולריים שונים. שימוש בגישה זו, חוקר יכול המסך חלק ניכר של הגנום שמרים ב עניין של שבועות. גישה זו משוחדת גם מאפשר זיהוי של מכפילי, אשר לא יכול היה לנבא מבוסס על ממצאים קודמים. השתמשנו בגישה זו כדי לזהות מכפילי של רעילות הקשורות אגרגציה של חלבונים אנושיים למחלות ניווניות 19,21-23. עם זאת, בשל כושר ההסתגלות של פרוטוקול זה ללמוד תהליכים תאיים אחרים, פרוטוקול זה יהיה שימושי לחוקרים מענה למגוון רחב של שאלות ביולוגיות חשובות. לדוגמה, מצאנו גם גישה זו ההקרנה שימושי לזיהוי גנים המעורבים בעיבוד מסלולים ללחצים סביבתיים, לרבות מתכות כבדות סטרס חמצוני. כאן יש לנו התמקדו בספריה אחת פלסמיד, הספרייה שמרים FLEXGene 9. עם זאת, יש כמה ספריות שמרים אחרים פלסמיד זמין, אשר יכול לשמש גם עבור אלו מסכי 6,8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענק מטעם המרכז Packard עבור ALS מחקר באוניברסיטת ג'ונס הופקינס (ADG), פרס ממציא ניו מנהל NIH 1DP2OD004417-01 (ADG), NIH R01 NS065317 (ADG), אלן ריטה פרס קרן Scholar. ADG הוא חוקר Pew במדעי ביו, נתמך על ידי Pew Charitable Trusts.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BioRobot RapidPlate | Qiagen | 9000490 | |
| 96 bolt replicator (frogger) | V&P Scientific | VP404 | |
| FLEXGene ORF Library | Institute of Proteomics, Harvard Medical School | ||
| Tabletop centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| 500mL baffled flask | Bellco Glass | 2543-00500 | |
| 2.8L triple-baffled Fernbach flask | Bellco Glass | 2551-02800 | |
| 100μL Rapidplate pipette tips | Axygen Scientific | ZT-100-R-S | |
| 200μL Rapidplate pipette tips | Axygen Scientific | ZT-200-R-S |
References
- Nurse, P. The Nobel Prize and beyond: an interview with Sir Paul Nurse. Interview by Susan R. Owens. EMBO Rep. 3, 204-206 (2002).
- Hartwell, L. H. Nobel Lecture. Yeast and cancer. Biosci Rep. 22, 373-394 (2002).
- Stevens, T., Esmon, B., Schekman, R. Early stages in the yeast secretory pathway are required for transport of carboxypeptidase Y to the vacuole. Cell. 30, 439-448 (1982).
- Novick, P., Ferro, S., Schekman, R. Order of events in the yeast secretory pathway. Cell. 25, 461-469 (1981).
- Novick, P., Field, C., Schekman, R. Identification of 23 complementation groups required for post-translational events in the yeast secretory pathway. Cell. 21, 205-215 (1980).
- Sopko, R. Mapping pathways and phenotypes by systematic gene overexpression. Mol Cell. 21, 319-330 (2006).
- Alberti, S., Gitler, A. D., Lindquist, S. A suite of Gateway((R)) cloning vectors for high-throughput genetic analysis in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 24, 913-919 (2007).
- Gelperin, D. M. Biochemical and genetic analysis of the yeast proteome with a movable ORF collection. Genes Dev. 19, 2816-2826 (2005).
- Hu, Y. Approaching a complete repository of sequence-verified protein-encoding clones for Saccharomyces cerevisiae. Genome Res. 17, 536-543 (2007).
- Giaever, G. Functional profiling of the Saccharomyces cerevisiae genome. Nature. 418, 387-391 (2002).
- Boone, C., Bussey, H., Andrews, B. J. Exploring genetic interactions and networks with yeast. Nat Rev Genet. 8, 437-449 (2007).
- Mnaimneh, S. Exploration of essential gene functions via titratable promoter alleles. Cell. 118, 31-44 (2004).
- Parsons, A. B. Integration of chemical-genetic and genetic interaction data links bioactive compounds to cellular target pathways. Nat Biotechnol. 22, 62-69 (2004).
- Schuldiner, M. Exploration of the function and organization of the yeast early secretory pathway through an epistatic miniarray profile. Cell. 123, 507-519 (2005).
- Tong, A. H. Systematic genetic analysis with ordered arrays of yeast deletion mutants. Science. 294, 2364-2368 (2001).
- Tong, A. H. Global mapping of the yeast genetic interaction network. Science. 303, 808-813 (2004).
- Neumann, M. Ubiquitinated TDP-43 in frontotemporal lobar degeneration and amyotrophic lateral sclerosis. Science. 314, 130-133 (2006).
- Johnson, B. S., McCaffery, J. M., Lindquist, S., Gitler, A. D. A yeast TDP-43 proteinopathy model: Exploring the molecular determinants of TDP-43 aggregation and cellular toxicity. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 6439-6444 (2008).
- Elden, A. C. Ataxin-2 intermediate-length polyglutamine expansions are associated with increased risk for ALS. Nature. 466, 1069-1075 (2010).
- Johnson, B. S. TDP-43 is intrinsically aggregation-prone, and amyotrophic lateral sclerosis-linked mutations accelerate aggregation and increase toxicity. J Biol Chem. 284, 20329-20339 (2009).
- Cooper, A. A. Alpha-synuclein blocks ER-Golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson's models. Science. 313, 324-328 (2006).
- Gitler, A. D. Beer and Bread to Brains and Beyond: Can Yeast Cells Teach Us about Neurodegenerative Disease? Neurosignals. 16, 52-62 (2008).
- Gitler, A. D. Alpha-synuclein is part of a diverse and highly conserved interaction network that includes PARK9 and manganese toxicity. Nat Genet. 41, 308-315 (2009).
