Summary
여기에 플라스미드 overexpression 화면 설명
Abstract
신진 효모, Saccharomyces cerevisiae의는 인간의 질병에 직접 관련성이있는 사람 등 많은 중요한 세포 과정의 기본 메커니즘을 정의하는 강력한 모델 시스템입니다. 워낙 짧은 세대 시간과 잘 특징 게놈의 효모 모델 시스템의 주요 실험 이점은 주어진 과정에 관련된 유전자 및 경로를 식별하는 유전자 화면을 수행할 수있는 능력입니다. 지난 30 년 동안 같은 유전자 화면은 세포주기, 분비 경로와 진핵 세포 생물학 1-5의 많은 높은 보존 측면을 명료하게하다하는 데 사용되었습니다. 지난 몇 년 동안, 효모 종자와 plasmids 여러 genomewide 라이브러리는 60-10을 생성되었습니다. 이 컬렉션은 이제 이득과 손실 함수 접근법 11-16을 사용하여 유전자 기능의 체계적인 심문을 위해 수 있습니다. 여기 우리는 5500 효모 plasmids의 못하였 느니라 라이브러리를 사용하여 플라스미드 overexpression 화면을 수행하는 액체 처리 로봇과 높은 처리량 효모 변환 프로토콜의 사용에 대한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 우리는 집합을 일으키는 인간 neurodegenerative 질병 단백질의 축적과 관련된 독성의 유전자 조절을 식별이 화면을 사용하고 있습니다. 여기에 제시 방법은 관심의 다른 세포 phenotypes의 연구에 쉽게 적용할 수 있습니다.
Protocol
1. 효모 변환을위한 준비
이 프로토콜은 열 96 - 웰 플레이트를 위해 설계되었습니다하지만, 이에 따라 위 또는 아래로 확장할 수 있습니다. 우리는이 프로토콜은 변화 라운드 당보다 20 96 - 웰 플레이트에 대해 제대로 작동하지 않는 것으로 확인되었습니다. 전체 변환 절차 (단계 I.3에서) 약 여덟 시간이나 걸립니다.
- 나누어지는 Biorobot의 RapidPlate 액체 처리기와 함께 96 - 웰 플레이트 왕복 아래의 각 우물에 효모 ORF FLEXGene 라이브러리에서 플라스미드 DNA (μl / 100 NG)의 5 10μL. 장소 건조 하룻밤 클린 벤치 펌 모자 96 - 웰 플레이트를 발견. 우리는 센와 2μ 효모의 plasmids과 유사한 변환 효율성을 발견했다.
- 500mL 당황하게 Erlenmeyer 플라스크에서 쿼리 변형과 효모 펩톤 덱스 트로 오스 (YPD) 미디어 (10g / L 효모 추출물, 20g / L 펩톤, 20g / L의 포도당)의 200mL의 예방. (200 RPM) 흔들림 30 ° C에서 밤새 품어. 필요한 경우, 선택적 미디어 이러한 스타터 문화 사용할 수 있습니다.
- 다음날 아침, = 0.1 YPD의 2L에서 OD 600 쿼리 긴장을 희석. 30 ° C (200 RPM) 문화 OD 600 = 0.8-1.0에 도달할 때까지에서 4-6시간 위해 흔들어. 최적의 성장을위한 별도의 2.8 L 당황하게 flasks 두 1L 문화를 성장. 필요한 경우, 선택적 미디어도 YPD 대신 사용할 수 있습니다.
2. 효모 변환
- 원심 분리하여 세포를 수확. 테이블탑 원심 분리기 5 분 (Eppendorf 5810R)에 대한 3000rpm (~ 1800 XG)에서 효모 문화와 스핀없이 네 일회용 225mL 원뿔 튜브를 입력합니다. 뜨는을 붓고 모든 세포를 수확 때까지 반복합니다.
- autoclaved 소주 H 2 O.의 200mL의 세포 와시 흔들어 또는 vortexing하여 Resuspend 세포 펠릿. 한 225mL 원뿔 튜브에 세포를 결합합니다. 5 분 3000rpm에서 스핀. 뜨는 제거합니다.
- 0.1MLiOAc/1XTE 솔루션 (0.1M LiOAc, 10mM 트리스, 1mM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), autoclaved 증류수에 산도 8) 준비합니다. 100mL 0.1MLiOAc/1XTE의 세포를 씻으십시오. 5 분 3000rpm에서 스핀. 뜨는 제거합니다.
- 70mL 0.1M LiOAc/1xTE에 Resuspend 세포 펠릿. 흔들어 및 / 또는 소용돌이 펠렛 완전히 resuspended되도록합니다.
- 30 분 (200 RPM) 30 ° C에서 잡고 알을 품다.
- 0.1M로 β - 메르 캅 토 에탄올을 추가합니다. 30 분 (200 RPM) 30 ° C에서 잡고 알을 품다. 참고 : β - 메르 캅 토 에탄올로 구분 효모 종자를 사용하는 경우이 단계는 생략할 수 있습니다. 우리는이 단계가 성공적으로 변환을 위해 필수적 있지 않은 것으로 나타났습니다, 그러나 그것은 변환 효율을 개선 않습니다.
- 15 분 동안 sonicated 연어 정자 DNA (10mg/mL)의 2mL를 삶아 후 얼음에 진정해.
- 세포 혼합물에 삶은 연어 정자 DNA의 2mL를 추가합니다. 주의 : 침전물은 세포의 혼합물로 연어 정자 DNA의 형태에 따라 또한 수 있습니다. pipetman 200 μl 팁을 사용하여, 신중하게이 하류 pipetting을 방해할 수 있기 때문에 어떤 형태의 침전물을 제거합니다.
- BioRobot의 Rapidplate를 사용하여 96 - 웰 플레이트의 각 잘하는 세포 혼합물 나누어지는의 50μL은 (또한 멀티 채널 피펫을 사용할 수 있습니다.) 혼합하지 마십시오.
- 떨지 않고 30 분 동안 상온에서 알을 품다.
- 200mL 40 %에게 PEG-3350/10 % DMSO/0.1M LiOAc을 (160mL 50 % PEG - 3350, 20mL DMSO, 20mL 1M LiOAc) 준비합니다. 바로 사용하기 전에 솔루션을 준비합니다.
- 각 잘하는 PEG / LioAc / DMSO 용액 125μL를 추가합니다. RapidPlate로 8 번 aspirating 및 세포 현탁액을 분배하여 섞는다.
- 떨지 않고 30 분 동안 상온에서 알을 품다.
- 열충격 42 세포 ° C 건조한 인큐베이터에서 15 분. 접시를 쌓아하지 마십시오. 참고 :이 열 충격 단계가 성공적으로 변환을 위해 필수적 있지 않은 것으로 나타났습니다. 특정 효모 종자 (예를 들어, 온도에 민감한 돌연변이)의 경우, 열 충격 해로운 것입니다. 우리는 이전에 1 분 정도 가열 충격 시간을 단축하고 성공적으로이 프로토콜을 사용하여 ypt1 온도에 민감한 돌연변을 품고 효모 긴장을 변환 할 수있다.
- 96 - 웰 플레이트를 수용하기 위해 원심 분리기 어댑터를 사용하여 5 분 2500rpm (~ 1100 XG)에서 번호판을 돌려. 폐기물 양동이를 통해 반전 접시로 PEG 용액을 제거합니다. 잔류 액체를 제거하기 위해 종이 타월에 반전 번호판을 가릴 (전지 우물의 바닥에 남아있게됩니다).
- RapidPlate 각 잘하는 (예를 들어 SD / - 우라) 최소 미디어 200μL를 추가하여 세포를 씻어.
- 5 분 2500rpm에서 번호판을 스핀과 반전을 통해 폐기물 양동이와 종이 타월에 모래 바닥에서 뜨는 제거합니다.
- RapidPlate 각 잘하는 최소한의 미디어 200μL (예 : SD / - 우라) 추가합니다.
- 떨지 않고 2 일 30 ° C에서 알을 품다. 이일 후, 세포의 작은 식민지를 성공적으로 잘 변형 각의 하단에있는 양식을 시작합니다.
3. 분석 구경하기
- 각 우물에 raffinose을 기반으로 최소한의 미디어 (예 : SRaf / - 우라)의 200μL를 분배새로운 평면 바닥 96 - 웰 플레이트.
- Rapidplate로 8 번 aspirating 및 세포 현탁액을 분배하여 변환 플레이트의 각 잘 섞는다.
- 변환 접시에서 세포 혼합물 5μL와 SRaf 접시의 예방.
- 하루 30 ° C에서 알을 품다. 작은 식민지 언젠가는 이후 각 우물의 하단에 제시해야합니다.
- SD / - 우라와 모자 SGal / - 우라 플레이트에 스팟 식민지. 불타는하여 96 볼트 복제 (frogger)을 소독. 선택적 미디어 접시에 야생 전에 frogger과 식민지를 섞습니다. 관찰 후, 플레이트 5-10 분 동안 모자 건조 수 있습니다.
- 2-3 일동안은 30 ° C에서 알을 품다.
디지털 카메라와 사진의 접시는 시각 쿼리 스트레인 독성이 (빠른 성장 / 더 밀도 식민지) (느린 성장 / 이하 밀도 식민지) 또는 표시되지 향상된되는 식민지를 찾을 수 SGal / - 우라 플레이트에 식민지의 성장을 비교합니다.
4. 대표 결과 :
그림 1. 효모 플라스미드 overexpression 화면 TDP - 43 독성의 진압 및 강화를 식별합니다. TDP - 43은 루게릭병 (루게릭 병)의 pathogenesis에 연루되어있는 인간의 단백질이다. TDP - 43의 세포질 집계는 두뇌와 ALS 환자 17 척수 신경에 축적. 집계 및 세포 독성 18 효모 세포 결과에 TDP - 43를 표현. 우리는 TDP - 43 19,20 독성의 메커니즘을 정의하기 위해이 모델 시스템을 사용하고 있습니다. 그림은 우리의 누룩 TDP - 43 독성 수정자 화면에서 접시의 repesentative 예입니다. 이 번호판은 FLEXGene ORF 표현 라이브러리에서 plasmids과 통합 갈락토 오스 - inducible TDP - 43 플라스미드 또한 변형과 식민지를 표시합니다. 왼쪽에있는 플레이트는 TDP - 43 또는 FLEXGene의 plasmids의 표현을 represses 포도당을 포함하고 있습니다. 오른쪽 접시는 TDP - 43의 표현과 FLEXGene의 plasmids의 ORFs를 유도 갈락토 오스를 포함하고 있습니다. 녹색 화살촉은 TDP - 43의 독성을 억제하는 플라스미드로 변환 식민지를 나타냅니다. 빨간 화살촉은 TDP - 43의 독성을 강화하는 플라스미드로 변환 식민지를 나타냅니다.
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Discussion
여기 우리는 효모에서 높은 처리량 플라스미드 overexpression 화면을 수행하는 프로토콜을 제시한다. 이러한 접근 방식은 여러 세포 phenotypes의 유전자 조절에 대한 신속하고 불편 검사 수 있습니다. 이 방법을 사용하여 연구원이 주 만에 효모 게놈의 상당 부분을 스크린 수 있습니다. 이러한 불편 접근법은 또한 이전의 연구 결과에 따라 예측되지 않았을 수 있습니다 수정자의 식별을 위해 수 있습니다. 우리는 인간의 neurodegenerative 질병 단백질 19,21-23의 집합과 관련된 독성의 수정자를 식별하는이 방법을 사용했습니다. 그러나, 때문에 다른 세포 프로세스를 연구하기 위해이 프로토콜의 적응성에,이 프로토콜은 중요한 생물 학적 질문 다양한 해결 연구자들에게 유용한 것입니다. 예를 들어, 우리는 중금속 및 산화 스트레스를 포함하여 환경 스트레스에 적응에 관련된 유전자 및 경로를 식별이 심사 방식 유용한 발견했다. 여기 하나의 플라스미드 도서관, 효모 FLEXGene 라이브러리 9 초점을 맞추고있다. 그러나, 이러한 스크린 6,8 사용할 수있는 사용 가능한 여러 가지 다른 효모 플라스미드 도서관이 있습니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 존스 홉킨스에서 ALS 연구 팩커드 센터 (ADG), NIH 원장의 새로운 이노 수상 1DP2OD004417 - 01 (ADG), NIH R01 NS065317 (ADG), 리타 앨런 재단 학술 상에서 교부금에 의해 지원되었다. ADG는 퓨 자선 트러스트가 지원하는 의생명 과학 퓨 학술 있습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BioRobot RapidPlate | Qiagen | 9000490 | |
| 96 bolt replicator (frogger) | V&P Scientific | VP404 | |
| FLEXGene ORF Library | Institute of Proteomics, Harvard Medical School | ||
| Tabletop centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| 500mL baffled flask | Bellco Glass | 2543-00500 | |
| 2.8L triple-baffled Fernbach flask | Bellco Glass | 2551-02800 | |
| 100μL Rapidplate pipette tips | Axygen Scientific | ZT-100-R-S | |
| 200μL Rapidplate pipette tips | Axygen Scientific | ZT-200-R-S |
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