Summary
Почки данио является домом для обеих почек и кроветворных стволовых / прогениторных клеток, и представляет собой отличную возможность для изучения этих типов клеток и их потомства в организме модель позвоночных. Здесь мы демонстрируем детальную процедуру вскрытия, которое позволяет исследователю выявить и хирургическим путем удалить почку взрослых данио, которая может быть использована для приложений, таких как изолятор, трансплантация, и выражение исследования почек и / или популяций клеток крови.
Protocol
1. Препарирование взрослых почки данио из незаписанных образец животных
- Выберите взрослых данио между 3-6 месяцев в возрасте рассечение.
- Усыпить рыбу, поместив его в блюдо с 0,2% Tricaine рН 7,0 в течение примерно 4-5 минут, следя внимательно посмотреть, что жабры прекратить движение и остановится сердце.
- Используя ложку, поднять рыбу из ванны Tricaine в небольшое количество раствора, перелить раствор и осторожно положите животное на бумажное полотенце.
- Используйте острый пару рассечение ножницами, чтобы удалить голову животного, делая разрез позади жаберной крышечки (рис. 1, путь). Отменить головой в контейнер для биологически опасных отходов.
- Используйте рассечение ножницами, чтобы открыть тело животного, сделав долгий вентральной разрез, начиная с головы и заканчивается на хвост у основания хвостового плавника (рис. 1, путь B).
- Удалить внутренние органы животного с помощью пары рассечение пинцет / щипцы, и поместите их в биологически опасных отходов. Будьте осторожны, чтобы не кистью спинной стенке тела, так как это расположение почек (рис. 2). Если вы выбрали женский рыбы, то вам нужно черпать развивающиеся яйца из полости тела, которое может быть наиболее легко сделать с помощью угловой пару щипцов или пинцета.
- Используйте рассечение иглы к контакту открытых теле стены рассечение лотка и угол вывода так, чтобы почки могут быть визуализированы. Почка будет обладать характерной формы (голова, туловище / седло, хвост) и цвет, будучи с вкраплениями черного оттенка пигментации (рис. 2). Вы также можете увидеть аорты заполнены периферическая кровь, которая спускается средней линии структуры органа.
- Используйте тонкий пинцет, чтобы отделить почки от дорсальной стенки тела, используя одну пару щипцов поднять почку, как вы отдельных органов из соединительной ткани, лежащие в основе этого.
- Аккуратно почек в нужное средство для дальнейшего исследования живых клеток, например, микроцентрифужных пробирку 1x PBS для подготовки СУИМ.
2. Подготовка и вскрытие почек взрослых данио из установленного образца животных
- Приготовить раствор из 4% PBST paraformaldehyde/1X. Кипятите решение о роспуске PFA в раствор, затем охладите смесь до 4 ° С и добавить 0,1% диметилсульфоксида. Мы имели наибольший успех с сохранением ткани использовать свежеприготовленный PFA решения, а не замороженные порции. Сделайте достаточное количество решений, чтобы погрузить взрослых данио во время вскрытия.
- Заполните рассечение лоток с достаточным решением фиксации погружаться взрослых данио во время вскрытия. Мы выполняем последующие шаги с этого лотка расположен под микроскоп, который может быть помещен в химической капот, чтобы минимизировать воздействие фиксации запахов.
- Выберите взрослых данио между 3-6 месяцев в возрасте рассечение.
- Усыпить рыбу, поместив его в блюдо с 0,2% Tricaine рН 7,0 в течение примерно 5 минут, внимательно следят, чтобы увидеть, что жабры и бьющееся сердце остановится.
- Используя ложку, поднять рыбу из ванны Tricaine в небольшое количество раствора, перелить раствор и осторожно положите животное на бумажное полотенце.
- Используйте острый пару рассечение ножницами, чтобы удалить голову животного, делая разрез позади жаберной крышечки (рис. 1, путь). Отменить головой в контейнер для биологически опасных отходов, и сразу же место животного в PFA-содержащих рассечение лоток.
- Используйте рассечение ножницами, чтобы открыть тело животного, сделав долгий вентральной разрез, начиная с головы и заканчивается на хвост у основания хвостового плавника (рис. 1, путь B), и держать тело частично погруженными в течение процедуры.
- Удалить внутренние органы животного с помощью пары рассечение пинцет / щипцы, и поместите их в биологически опасных отходов. Будьте осторожны, чтобы не кистью спинной стенке тела, так как это расположение почек (рис. 2).
- Используйте рассечение иглы к контакту открытых стенки кузова, и угол вывода так, чтобы почки могут быть визуализированы. Почка будет обладать характерной формы (голова, седло, хвост) и цвет, будучи с вкраплениями черного оттенка пигментации (рис. 2). Вы также можете увидеть аорты заполнены периферическая кровь, которая спускается средней линии структуры органа.
- Fix образец за одну ночь, размещение лотка при 4 ° С, когда вы сделали с организацией желаемых образцов.
- На следующий день, удалить решение PFA из лотка и замените 1x PBST.
- Использование тонких щипцов тщательно отделить почки от дорсальной стенки тела, используя одну пару щипцов поднять почку, как вы отдельных органов из соединительной ткани, лежащие в основе этого. Почечной ткани будут мягкие и податливые от ДМСО в фиксирующий раствор, позволяющий анализировать весь орган почки в одной части.
- Использование широкогоотверстием передачи пипетки поместить почки в микроцентрифужных трубки.
- Почки могут теперь быть обработаны дальнейшего проведения гистологического или целые горы на месте экспрессии гена исследования, основанные на желаемый исследования.
3. Представитель результаты:
Шаги, которые схематически на рисунке 1 показывают, рассечение процедуры. Почки могут быть определены на основании его характерной формы и окраски, а также анатомического расположения на спинной стенке полости тела животного, как показано на рисунке 2. После вскрытия фиксированной почек образца, целые горы на месте гибридизация может быть использован для локализации выражение гена, как показано на рисунке 3.
Рисунок 1: процедуры, которая обеспечивает прямой доступ к рассекает данио почки взрослого человека. (А) эвтаназии данио изрезана в ступенчато (обозначается цифрами и стрелками), чтобы дать исследователю простой доступ к полному орган почки. Изображения брюшной полости до (B) и после (C) удаление органов брюшной полости.
Рисунок 2:. Визуализация данио почки в незаписанных образец После извлечения органов в полости тела, почки появляется как один, сплющенные органа, который является приверженцем спинной стенке тела с помощью соединительной ткани (А), и был схематизированными (B), чтобы показать свою анатомическую форму.
Рисунок 3: Всего монтировать на месте гибридизации производится на весь орган почки взрослого человека. (А) cadherin17 стенограммы обнаружены в трубочку взрослых нефронов почек, увеличенные в ('). (B) mafba стенограммы локализованы проксимальных нефрона типов клеток во взрослом почек (по сравнению с всего трубочку в панели). (В' ) увеличенный вид выражения mafba показывает, что стенограммы специально локализована подоцитов (P) клеток крови фильтр (клубочков) и проксимальных извитых канальцах (РСТ).
Discussion
Взрослые стволовые клетки являются динамичными и основные компоненты, которые поддерживают взрослую форму тела 1. Взрослые стволовые клетки также могут служить для противодействия ущерб, который несет тело во время болезненных состояний, а также дисфункции или потери взрослых стволовых клеток может привести к снижению функции органа, а был вовлечен на диске рака злокачественные опухоли и способствуют старению. Взрослые стволовые клетки выставке сотовой свойства, которые отличают их от дифференцированных типов клеток. После деления клетки, стволовые клетки способны к самообновлению и производство клеток-предшественников, которые в свою очередь может привести к различным дифференцированным потомство. Существует большой интерес к пониманию путей, которые регулируют ячейки судьба решения и потенции взрослых стволовых клеток из-за их важную роль в тканевого гомеостаза 1. Например, многие ученые в настоящее время стремятся идентифицировать сигналы, которые поддерживают различные взрослых стволовых клеточных популяций в своей нише, или специализированные микроокружения, и как эта ниша влияние гуморальных факторов.
Взрослые гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) в плюрипотентные клетки, которые способствуют постоянному обновлению клеток крови у животных 8. Кровотворение является динамичной процесс, который постоянно текущие в течение жизни организма позвоночных, потому зрелых дифференцированных типов клеток крови являются короткоживущими и, следовательно, должны быть пополнены на регулярной основе. Как они делят, ГСК поставки этого важнейшего спрос самообновлению и производству серии предшественников, которые приводят к эритроидных, мегакариоцитов, лимфоидной и миелоидной линий. Каждый из этих типов клеток крови выполняет уникальные функции в обращении, включая обеспечение газообмена в тканях, путь для герметизации травмы кровеносных сосудов путем образования тромба, или механизмы защиты от вторжения патогенных микроорганизмов. Хотя ГСК были признаны на протяжении многих лет, множество увлекательных вопросы остаются без ответа об этих удивительных клетках. Недавние исследования выявили подклассы ГСК с различными долгосрочных самообновлению свойств и выяснение нишу компонентов, а также сигналы, которые модулируют HSC поведения 8. Данио в настоящее время среди краеугольных камней парадигм кроветворения исследования, основанные на генетических и молекулярных признаков данной животной модели 8. Исследование использования данио привели к новым более глубокое представление о биологии HSC, которые сохраняются с высших позвоночных, как млекопитающие, подчеркивая биомедицинских актуальность исследования крови рыб 8.
Исторически сложилось, что знания о ГСК проложила путь для экспедиций, стремящихся обнаружить, если другие органы тела поддерживаются взрослыми стволовыми клетками. Многочисленные популяции взрослых стволовых клетка сейчас оценили свое существование, начиная в самых разных структур мозга в кишечник, кожу и скелетные мышцы. Продолжение усилий в области стволовых клеток пытаются определить, как взрослые стволовые клетки и даже других дифференцированных типов клеток может отображать расширение потенции в различных условиях.
Что касается почек, было большой дискуссии среди нефрологов, является ли почечные стволовые клетки существуют 16. Независимые результаты зафиксировали популяций клеток почек у млекопитающих, которые обладают различной степенью регенеративный потенциал, но сплоченная пониманием этих докладов до сих пор не достигнуто. Интересно, что имеются убедительные доказательства, подтверждающие мнение, что многие виды рыб обладают клетки, которые могут энергично топлива регенерацию поврежденных нефронов, а также растут совершенно новых нефронов в зрелом возрасте 9. Недавняя работа выявила молекулярные признаки взрослых стволовых клеток почек в данио 10,11, и продемонстрировала самообновлению потенции так называемые почечные стволовых / прогениторных клеток (RPC) 11. Будущие исследования необходимы, чтобы установить, является ли аналогичные клетки почек присутствуют в организме млекопитающих. Тем не менее, продолжил исследования о клеточных и молекулярных механизмов, которые регулируют рыбу RPC, могут дать представление о том, как регенеративные подвиги может стимулироваться в млекопитающих почки. Очевидно, что многое еще предстоит понять о RPC, и что много инструментов, теперь доступны для рыбок данио исследователь может быть реализован для решения этих интригующих вопросов.
В этом протоколе, мы описываем наш метод для идентификации и анатомическое вскрытие почек взрослых рыбок данио. Альтернативные шаги могут быть использованы, чтобы рассекать почек, таких как открытие брюшной полости с использованием вентральный вырез рассечение ножницами, однако, мы столкнулись с самым успех в получении всей почки, когда брюшная стенка закреплена открытым и голова будет удален. Кровь и почек исследователей, так, желающие, чтобы изолировать и работы с этими типами клеток можно использовать как метод вскрытия. Следует отметить, что метод описан для изоляции и Workinг с данио почек взрослых, конечно, не ограничивается ученых, которые хотели бы продолжить вопросы взрослых биологии стволовых клеток, а рассечение этого органа может способствовать исследований для тех исследователей, проводит исследования по темам, начиная от физиологии к старению. Кроме того, этот метод может использоваться в сочетании с другими технологиями, такими как трансгенных, таким образом, чтобы молекулярно этикетку, а затем очистить и исследование дискретных субпопуляций крови и клетках почек от дикого типа или генетически мутанта данио 11. Заглядывая вперед, такие детальные процедуры очистки типов стволовых клеток-предшественников и имеет важное значение для получения знаний о том, как их поведение регулируется в качестве оперативных тестов, таких как трансплантация или прародитель культивирования составляют основу которой потенции и идентичность этих клеток определяется. Последние достижения в области культуры методами гемопоэтических предшественников откроет множество новых возможностей для исследования, и могут быть адаптированы для культивирования почечной населения 17. Данио рерио химической генетики добились успеха в выявлении путей, которые модулируют ГСК и почечной прародителей в различных контекстах 18-20, и будет продолжать быть полезными проспект для проверки в сочетании с выше методы клеточной биологии. Взятые вместе, было число новаторский вклад в области гематологии и нефрология использованием модели данио рерио, и продолжил исследования в этих аренах обещает обладать дальнейшего преобразующую идеи в ближайшие годы.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
RAW хотел бы поблагодарить членов Зон и Дэвидсон научно-исследовательские лаборатории для своих бесчисленных вклад в оказание помощи в разработке стратегий, которые постепенно форме это рассечение технику у взрослых данио за последнее десятилетие. Кроме того, мы хотели бы выразить нашу благодарность сотрудникам Нотр-Дам Центр исследований данио рерио за предоставление отличной постоянного ухода хозяйства для нашей данио колонии. RAW получил финансирование научных исследований из NIH-NIDDK гранта до DK083512, и щедрый лаборатории начального финансирования из Университета Нотр-Дам.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5882 | |
| Dissection forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5010 | |
| Dissection angled forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5058 | |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 19210 |
References
- Stocum, D. L., Zupanc, G. K. Stretching the limits: stem cells in regeneration science. Dev. Dyn. 237, 3648-3671 (2008).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat. Rev. Genet. 8, 353-367 (2007).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullman, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of organs from the adult zebrafish. J Vis Exp. (37), (2010).
- Mione, M. C., Trede, N. S. The zebrafish as a model for cancer. Dis. Model Mech. 3, 517-523 (2010).
- Zon, L. I. Developmental biology of hematopoiesis. Blood. 86, 2876-2891 (1995).
- Davidson, A. J., Zon, L. I. The 'definitive' (and 'primitive') guide to zebrafish hematopoiesis. Oncogene. 23, 7233-7246 (2004).
- Orkin, S. H., Zon, L. I. Hematopoiesis: an evolving paradigm for stem cell biology. Cell. 132, 631-644 (2008).
- Reimschuessel, R. A fish model of renal regeneration and development. ILAR J. 42, 285-291 (2001).
- Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebrafish. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 299, F1040-F1047 (2010).
- Diep, C. Q., Ma, D., Holm, T., Naylor, R., Arora, N., Wingert, R., Bollig, F., Djordjevic, G., Lichman, B., Zhu, H. Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish. Nature. 470, 95-100 (2011).
- Traver, D., Paw, B. H., Poss, K. D., Penberthy, W. T., Lin, S., Zon, L. I. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nat. Immunol. 4, 1238-1246 (2003).
- Weber, G. J., Choe, S. E., Dooley, K. A., Paffett-Lugassy, N. N., Zhou, Y., Zon, L. I. Mutant-specific gene programs in the zebrafish. Blood. 106, 521-530 (2005).
- Sumanas, S., Jorniak, T., Lin, S. Identification of novel vascular endothelial-specific genes by the microarray analysis of the zebrafish cloche mutants. Blood. 106, 534-541 (2005).
- Burns, C. E., Traver, D., Mayhall, E., Shepard, J. L., Zon, L. I. Hematopoietic stem cell fate is established by the Notch-Runx pathway. Genes Dev. 19, 2331-2342 (2005).
- Little, M. H., Bertram, J. F. Is there such a thing as a renal stem cell. J. Am. Soc. Nephrol. 20, 2112-2117 (2009).
- Stachura, D. L., Reyes, J. R., Bartunek, P., Paw, B. H., Zon, L. I., Traver, D. Zebrafish kidney stromal cell lines support multilineage hematopoiesis. Blood. 114, 279-289 (2009).
- North, T. E., Goessling, W., Walkley, C. R., Lengerke, C., Kopani, K. R., Lord, A. M., Weber, G. J., Bowman, T. V., Jang, I. H., Grosser, T. Prostaglandin E2 regulates vertebrate haematopoietic stem cell homeostasis. Nature. 447, 1007-1011 (2007).
- Wingert, R. A., Selleck, R., Yu, J., Song, H. D., Chen, Z., Song, A., Zhou, Y., Thisse, B., Thisse, C., McMahon, A. P., Davidson, A. J. The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros. PLoS Genet. 3, 1922-1938 (2007).
- de Groh, E. D., Swanhart, L. M., Cosentino, C. C., Jackson, R. L., Dai, W., Kitchens, C. A., Day, B. W., Smithgall, T. E., Hukriede, N. A. Inhibition of histone deacetylase expands the renal progenitor cell population. J. Am. Soc. Nephrol. 21, 794-802 (2010).
