Summary
ゼブラフィッシュの腎臓は、腎臓および造血両方成人の幹細胞/前駆細胞の本拠地であり、これらの細胞型と脊椎動物のモデル生物でそれらの子孫を研究する優秀な機会を表しています。ここでは、このような細胞の単離、移植、および腎臓および/または血液細胞集団の発現の研究などのアプリケーションに使用することができる大人のゼブラフィッシュの腎臓を、特定し、外科的に除去する研究者を可能にする詳細な解剖の手順を示しています。
Abstract
成体幹細胞生物学の急成長分野で働く研究者は、通常のホメオスタシスと疾患状態の間に幹細胞の挙動と機能を調節するシグナルを理解しよう。成体幹細胞の理解は、再生医療1の将来のための広範な到達意味を持っています。例えば、成体幹細胞の生物学についてのよりよい知識は臓器が自分自身を癒したり、人間の1に移植することができるin vitroで成長している臓器のためのメソッドの作成 にトリガーされる治療戦略の設計を容易にすることができます。ゼブラフィッシュは、脊椎動物の細胞生物学2の研究のための強力な動物モデルとなっている。ゼブラフィッシュ3の胚発生の豊富なドキュメントと分析がなされている。成人の研究に本研究の生物の用途拡大をゼブラフィッシュコミュニティ内で進歩的な動きがあったとして、ごく最近になって、文書の成人の解剖学に求められる科学者や外科解剖の技法4を持っている。例えば、成体幹細胞集団の生物学を調査し、がんなど5のような疾患の洗練された大人のモデルを作るためにゼブラフィッシュを用いての関心をそこに展開しています。歴史的に、ゼブラフィッシュ成体の腎臓の分離は、腎臓が魚6,7の血液細胞の産生の解剖学的位置であるため、造血を研究するために尽力している。腎臓は、間にスペースを各所に分散している造血組織に囲まれ、樹状の手配に見られるネフロンの機能ユニットで構成されています。造血コンポーネントは、末端に8を差別化するまで、腎臓に生息している造血幹細胞（HSC）およびその子孫で構成されています。さらに、それは現在腎臓幹細胞/前駆細胞（RPC）のグループはまた、ゼブラフィッシュ腎臓の臓器に生息し、など、他の魚種9-11に見られるように、腎臓の再生と成長の両方を有効にすることが理解される。この新発見の光の中で、ゼブラフィッシュ腎臓は、成体幹細胞生物学研究のための2つのエキサイティングな機会の場所を収容するの臓器です。それは多くの未解決の質問はよくこの実験的なシステムで提供できることが明らかである。このフィールドの拡大を奨励するために、それは視覚化の詳細な方法を文書化してから、成人のゼブラフィッシュの腎臓の臓器を分離することは有益である。このプロトコルは、固定されていないと固定の両方の動物からの成体腎臓の解剖の詳細私たちの手順を。腎臓の臓器の解剖は、組織学、蛍光活性化細胞選別（FACS）11,12、発現プロファイリング13,14、および移植11,15として確立された技術を用いて造血と腎幹細胞とその子孫を分離し、特徴付けるために使用することができます。我々は、このプロトコルのその普及が最終的に人間のアプリケーションに変換できるゼブラフィッシュの研究のより広い使用を実装するための知識を研究者に提供することを願っています。
Protocol
1。固定されていない動物のサンプルから大人のゼブラフィッシュの腎臓の解剖
- 解剖のための年齢の3〜6ヵ月の間に大人のゼブラフィッシュを選択してください。
- エラが動いて停止し、心臓が鼓動を停止することを確認して慎重に見て、約4-5分の0.2％Tricaine pH 7.0の皿にそれを置くことによって魚を安楽死させる。
- スプーンを使用して、少量の溶液でTricaine槽から魚を持ち上げて、ソリューションをデカントし、軽くペーパータオル上で動物を置きます。
- ちょうど鰓蓋（図1、パス）の後ろにカットをする、動物の頭を削除するには、解剖ハサミを使用してください。バイオハザード廃棄物容器の頭部を捨てる。
- 頭から開始し、尾鰭（図1、経路B）の基部にある尾で終了、長い腹側切開を行うことによって、動物の身体を開くために解剖鋏を使用してください。
- 解剖ピンセット/鉗子のペアを使用して、動物の内臓を外し、バイオハザード廃棄物の中に置いてください。これは腎臓の位置（図2）であるとして、背側体壁を磨くように注意してください。あなたがメスの魚を選択した場合は、最も簡単に鉗子やピンセットの角度のペアを使用して行うことができます体腔、の開発卵をかき出すする必要があります。
- 解剖トレイに体の壁を開きピン、および腎臓が可視化できるようにピンを角度に解剖針を使用してください。腎臓には黒い色のついた色素（図2）に散在して、特徴的な形状（頭部、トランク/サドル、テール）と色を持つようになる。また、臓器の構造の正中線を下に実行される末梢血で満たされた大動脈を、表示されることがあります。
- あなたがそれを根底にある結合組織から臓器を分離するように腎臓を持ち上げるために鉗子の一組を使用して、背側体壁から腎臓をデタッチするには微細な鉗子を使用してください。
- 静かにそのようなFACSの調製のための1X PBSを含むマイクロチューブのようなさらに、生細胞の研究、のために必要な車両に腎臓を置きます。
2。固定動物サンプルから大人のゼブラフィッシュの腎臓の準備と解剖
- 4パーセントparaformaldehyde/1XのPBSTの溶液を調製します。溶液中にPFAを溶解するためのソリューションを沸騰させて、その後4℃に混合物を冷却し、0.1％ジメチルスルホキシドを追加します。我々は、冷凍アリコートとは対照的にたてPFAのソリューションを使用してから組織保存で最も成功を収めている。水没解剖時の大人ゼブラフィッシュのに十分なソリューションとなります。
- 水没解剖時の大人ゼブラフィッシュのに十分な固定液で解剖トレイを埋める。我々は、固定の匂いへの曝露を最小限に抑えるために、化学フードに置くことができる顕微鏡下に置かこのトレイ、後続の手順を実行します。
- 解剖のための年齢の3〜6ヵ月の間に大人のゼブラフィッシュを選択してください。
- エラと心臓の停止が鼓動ことを確認して慎重に見て、約5分間の0.2％Tricaine pH 7.0の皿にそれを置くことによって魚を安楽死させる。
- スプーンを使用して、少量の溶液でTricaine槽から魚を持ち上げて、ソリューションをデカントし、軽くペーパータオル上で動物を置きます。
- ちょうど鰓蓋（図1、パス）の後ろにカットをする、動物の頭を削除するには、解剖ハサミを使用してください。バイオハザード廃棄物容器の頭部を破棄し、そして即座にPFA含有解剖トレイに動物を配置。
- 頭から開始し、尾鰭（図1、経路B）の基部に尾で終了する、長い腹側切開を行うことによって、動物の身体を開くために解剖鋏を使用し、そして部分的に中に没水体を維持する手続き。
- 解剖ピンセット/鉗子のペアを使用して、動物の内臓を外し、バイオハザード廃棄物の中に置いてください。これは腎臓の位置（図2）であるとして、背側体壁を磨くように注意してください。
- 体の壁を開放ピン、および腎臓が可視化できるようにピンを角度に解剖針を使用してください。腎臓には黒い色のついた色素（図2）に散在して、特徴的な形状（ヘッド、サドル、テール）と色を持つようになる。また、臓器の構造の正中線を下に実行される末梢血で満たされた大動脈を、表示されることがあります。
- 4 ° Cあなたが希望するサンプルのアレンジで行われている時にトレイを置き、一晩サンプルを修正。
- 翌日、トレイからPFA液を除去し、1 × PBSTで交換してください。
- 慎重にあなたがそれを根底に、結合組織から臓器を分離するように腎臓を持ち上げるために鉗子の一組を使用して、背側体壁から腎臓をデタッチするには微細な鉗子を使用してください。腎組織は、それが可能な一体で全体の腎臓の臓器を分析すること、固定液中のDMSOから柔らかく、しなやかになります。
- 使用して、ワイドをマイクロ遠心チューブに腎臓を配置するボア転送ピペット。
- 腎臓は、今必要な調査に基づいて、 その場の遺伝子発現研究に組織学的または全体のマウントを行うためにさらに処 理することができます。
3。代表的な結果：
図1に図示されている手順では、解剖の手順を示している。図2に示すように、腎臓は、その特徴的な形と色合い、そして動物の体腔の背壁に解剖学的位置に基づいて識別することができます。固定腎標本の解剖した後、in situハイブリダイゼーション全体のマウントは、図3に示すように、目的の遺伝子の発現をローカライズするために使用することができます。
図1：ゼブラフィッシュ成体の腎臓を解剖するためのダイレクトアクセスを可能にする手順。 （A）安楽死ゼブラフィッシュは、研究者に完全な腎臓の臓器への簡単なアクセスを与えるために（数字と矢印で示される）段階的に解剖されています。腹腔内の画像の前に（B）と後（C）腹部臓器の除去。
図2：固定されていないサンプルのゼブラフィッシュ腎臓の可視化は、体腔内の臓器の除去に続いて、腎臓は、結合組織を介して背側体壁（）への付着である単一の統合器官として表示され、図式されています（B）、その解剖学的形状を示す。
図3：全体の成人の腎臓の臓器で実行サイチュハイブリダイゼーションの全マウント。 （）cadherin17転写物は、（'）で拡大し、成人の腎臓のネフロンの尿細管で検出されています。（B）mafbaの転写物が（パネル全体この中で尿細管と比較）成人腎臓における近位ネフロンの細胞型をローカライズしている。（B' ）mafba 式の拡大図は、その転写物は、特に血液フィルター（糸球体）と近位尿細管（PCT）の足細胞（P）を細胞に局在していることを示します。
Discussion
成体幹細胞は成人の体の形態1を維持する動的かつ不可欠なコンポーネントです。成体幹細胞はまた、疾患の状態の間に身体が被るそのダメージを打ち消すために役立つことができる、と成体幹細胞の機能不全または損失は、臓器機能の低下につながる可能性と癌の悪性腫瘍を促進し、老化に寄与することが示唆されている。成体幹細胞は分化した細胞型と区別する細胞の性質を示す。細胞分裂時には、成体幹細胞は自己複製し、順番に明確な差別化された子孫を生じさせることができる前駆細胞の製造が可能です。ために組織の恒常性1のそれらの重要な役割の成体幹細胞の細胞運命の決定及び効力を調節する経路を理解する上で大きな関心があります。例えば、多くの科学者は現在、ニッチの様々な成体幹細胞集団、または特殊な微小環境、そしてどのようにこのニッチは液性因子によって影響を受けるの維持信号を識別する為に使われます。
成人造血幹細胞（HSC）は、燃料、動物8の血液細胞の継続的な若返り多能性細胞である。造血は、成熟、分化血液細胞の種類は短命であり、そのために定期的に補充する必要があるため、脊椎動物の生物の寿命の間に絶えず継続されて活気のあるプロセスです。彼らは分けるように、造血幹細胞は自己再生すると赤血球、巨核球リンパ球と骨髄系の系統を生じさせる前駆細胞のシリーズを生産することによってこの重要な需要を供給する。これらの血液細胞型の各々は、組織への血餅形成の手段、または病原体の侵入に対する防御機構によって血管に傷害をシールするための方法をガス交換を提供するなど、循環のユニークな機能を実行します。造血幹細胞が長年にわたって認識されているが、魅惑的な質問の茄多は、これらの驚くべき細胞について未回答のままである。最近の研究では異なる長期的な自己複製のプロパティ、およびニッチの構成要素とHSC動作8を調節するシグナルの解明と造血幹細胞のサブクラスを同定した。ゼブラフィッシュは、この動物モデル8の遺伝子や分子属性に基づいて、造血の研究パラダイムの礎石の間で今である。ゼブラフィッシュを活用した研究は、魚の血液の調査8の生物医学的妥当性を強調し、哺乳類のような高等脊椎動物で保存されているHSC生物学についての小説洞察につながっている。
歴史的に、造血幹細胞についての知識は他の身体器官は成体幹細胞によって維持されているかどうかを調べるに求めて遠征するための道を開きました。多数の成体幹細胞集団は現在、脳から腸、皮膚、および骨格筋に多様な構造を介してまで、存在に感謝している。幹細胞分野における継続的な努力は、成体幹細胞、さらには他の分化細胞型は、様々な場面で強化された効力を表示する方法を識別する為に使われます。
腎臓に関しては、腎幹細胞が16存在するかどうかの腎臓専門医の間で大きな議論があった。独立した調査結果は、再生可能性の度合いを持つ哺乳類の腎臓細胞の集団を文書化しているが、これらの報告の凝集理解が達成されていない。興味深いことに、多くの魚種が確実に損傷ネフロンの再生に燃料を供給するだけでなく、成人期9中に全く新しいネフロンを育てることができる細胞を有しているという考えを支持する強い証拠がある。最近の研究は、ゼブラフィッシュ10,11で成人の腎臓の幹細胞の分子の特徴を識別し、これらのいわゆる腎幹細胞/前駆細胞（RPC）の11の自己再生能を実証した。今後の研究は、類似した腎細胞が哺乳類に存在するかどうかを確認するために必要とされる。それにもかかわらず、魚のRPCを調節する細胞および分子メカニズムに関する継続的な調査は、哺乳類の腎臓に刺激することができる方法回生偉業への洞察を提供することがあります。それは多くのRPCをについて理解することが残っている、とゼブラフィッシュの研究者に現在利用できる多くのツールがこれらの魅力的な疑問に取り組むために実装できることは明らかである。
このプロトコルでは、我々は大人のゼブラフィッシュの腎臓の解剖学的同定と郭清のための私達の方法を説明します。代替手順は、解剖用鋏を用いて腹部切開で腹腔を開くと、腎臓を解剖するために使用することができますが、我々は腹壁が開いて固定されているときに全体の腎臓へのアクセスで最も成功が発生しているとヘッドが削除されます。これらの細胞型と分離して作業したい問わず血液と腎臓の研究者が解剖の方法のいずれかを使用できます。なお、その単離及びワーキンために我々が記述する方法ゼブラフィッシュ成体の腎臓とgは確かにこの器官の解剖は、生理学から老化に至るまでのトピックの調査を追求するそれらの研究者のための研究を促進することができるように、成体幹細胞生物学の問題を追求する科学者に限定されません。さらに、この方法は分子的にラベル付けし、野生型または遺伝子変異ゼブラフィッシュ11から血液や腎臓の細胞の離散部分母集団を浄化して勉強するように、このような遺伝子組換えなどの他の技術と組み合わせて使用することができます。このような移植または前駆培養などの運用テストは、これらの細胞の効力とアイデンティティが定義されていることによって基礎を構成するように楽しみにして、幹細胞や前駆細胞型のような詳細な精製方法は、彼らの行動が規制される方法についての知識を得るために不可欠です。造血前駆細胞の培養法における最近の進歩は研究のための多くの新たな道を開き、腎人口17の培養に適合させることができる。ゼブラフィッシュの化学遺伝学は、さまざまなコンテキスト18-20に造血幹細胞および腎前駆細胞を調節する経路の同定に成功している、と上記の細胞生物学の技術と組み合わせてテストする便利な手段であり続けるだろう。一緒になって、ゼブラフィッシュモデルを使用して血液と腎臓の分野に画期的な貢献の数があった、とこれらの分野で研究を続け、今後数年間で振るうさらなる変革洞察することを約束。
Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
徐々に過去10年間に成人のゼブラフィッシュでこの解剖の技術を形成してきた戦略を開発する助けに彼らの無数の貢献のためゾンとデビッドソンの研究室のメンバーに感謝するRAW願い。さらに、我々はゼブラフィッシュのコロニーのための優秀な継続的な畜産のケアを提供するためのゼブラフィッシュ研究のためのノートルダムセンターのスタッフメンバーに感謝の意を申し上げます。 RAWは、NIH - NIDDK助成賞DK083512から研究資金を獲得し、そしてノートルダム大学からの寛大な研究室では、スタートアップ資金調達。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5882 | |
| Dissection forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5010 | |
| Dissection angled forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5058 | |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 19210 |
References
- Stocum, D. L., Zupanc, G. K. Stretching the limits: stem cells in regeneration science. Dev. Dyn. 237, 3648-3671 (2008).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat. Rev. Genet. 8, 353-367 (2007).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullman, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of organs from the adult zebrafish. J Vis Exp. (37), (2010).
- Mione, M. C., Trede, N. S. The zebrafish as a model for cancer. Dis. Model Mech. 3, 517-523 (2010).
- Zon, L. I. Developmental biology of hematopoiesis. Blood. 86, 2876-2891 (1995).
- Davidson, A. J., Zon, L. I. The 'definitive' (and 'primitive') guide to zebrafish hematopoiesis. Oncogene. 23, 7233-7246 (2004).
- Orkin, S. H., Zon, L. I. Hematopoiesis: an evolving paradigm for stem cell biology. Cell. 132, 631-644 (2008).
- Reimschuessel, R. A fish model of renal regeneration and development. ILAR J. 42, 285-291 (2001).
- Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebrafish. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 299, F1040-F1047 (2010).
- Diep, C. Q., Ma, D., Holm, T., Naylor, R., Arora, N., Wingert, R., Bollig, F., Djordjevic, G., Lichman, B., Zhu, H. Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish. Nature. 470, 95-100 (2011).
- Traver, D., Paw, B. H., Poss, K. D., Penberthy, W. T., Lin, S., Zon, L. I. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nat. Immunol. 4, 1238-1246 (2003).
- Weber, G. J., Choe, S. E., Dooley, K. A., Paffett-Lugassy, N. N., Zhou, Y., Zon, L. I. Mutant-specific gene programs in the zebrafish. Blood. 106, 521-530 (2005).
- Sumanas, S., Jorniak, T., Lin, S. Identification of novel vascular endothelial-specific genes by the microarray analysis of the zebrafish cloche mutants. Blood. 106, 534-541 (2005).
- Burns, C. E., Traver, D., Mayhall, E., Shepard, J. L., Zon, L. I. Hematopoietic stem cell fate is established by the Notch-Runx pathway. Genes Dev. 19, 2331-2342 (2005).
- Little, M. H., Bertram, J. F. Is there such a thing as a renal stem cell. J. Am. Soc. Nephrol. 20, 2112-2117 (2009).
- Stachura, D. L., Reyes, J. R., Bartunek, P., Paw, B. H., Zon, L. I., Traver, D. Zebrafish kidney stromal cell lines support multilineage hematopoiesis. Blood. 114, 279-289 (2009).
- North, T. E., Goessling, W., Walkley, C. R., Lengerke, C., Kopani, K. R., Lord, A. M., Weber, G. J., Bowman, T. V., Jang, I. H., Grosser, T. Prostaglandin E2 regulates vertebrate haematopoietic stem cell homeostasis. Nature. 447, 1007-1011 (2007).
- Wingert, R. A., Selleck, R., Yu, J., Song, H. D., Chen, Z., Song, A., Zhou, Y., Thisse, B., Thisse, C., McMahon, A. P., Davidson, A. J. The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros. PLoS Genet. 3, 1922-1938 (2007).
- de Groh, E. D., Swanhart, L. M., Cosentino, C. C., Jackson, R. L., Dai, W., Kitchens, C. A., Day, B. W., Smithgall, T. E., Hukriede, N. A. Inhibition of histone deacetylase expands the renal progenitor cell population. J. Am. Soc. Nephrol. 21, 794-802 (2010).
