Summary
Le rein zebrafish abrite à la fois rénale et hématopoïétique adulte cellules souches / progénitrices, et représente une occasion exceptionnelle d'étudier ces types de cellules et de leur progéniture dans un organisme modèle vertébré. Ici, nous démontrons une procédure de dissection détaillé qui permet au chercheur d'identifier et d'enlever chirurgicalement le rein poisson zèbre adulte, qui peut être utilisé pour des applications telles que l'isolement cellulaire, la transplantation, et les études d'expression du rein et / ou des populations de cellules sanguines.
Abstract
Les chercheurs travaillant dans le domaine en plein essor de la biologie des cellules souches adultes cherchent à comprendre les signaux qui régulent le comportement et la fonction des cellules souches au cours homéostasie normale et d'états pathologiques. La compréhension des cellules souches adultes a de larges implications pour atteindre à l'avenir de la médecine régénérative 1. Par exemple, une meilleure connaissance de la biologie des cellules souches adultes peuvent faciliter la conception de stratégies thérapeutiques dans lesquelles les organes sont déclenchées pour guérir eux-mêmes ou même la création de méthodes d'organes de plus en plus in vitro qui peuvent être transplantés dans le corps humain 1. Le poisson zèbre est devenu un modèle animal puissant pour l'étude de la biologie cellulaire des vertébrés 2. Il a été abondante documentation et d'analyse du développement embryonnaire chez le poisson zèbre 3. Ce n'est que récemment que les scientifiques ont cherché à documenter l'anatomie adulte et techniques de dissection chirurgicale 4, comme il ya eu un mouvement progressiste au sein de la communauté zebrafish d'élargir les applications de cet organisme de recherche à des études pour adultes. Par exemple, il ya des intérêts en expansion utilisant le poisson zèbre pour étudier la biologie des populations de cellules souches adultes et de faire des modèles pour adultes sophistiqué de maladies comme le cancer 5. Historiquement, l'isolement du rein adulte poisson zèbre a été déterminant pour l'étude de l'hématopoïèse, comme le rein est la localisation anatomique de la production de cellules sanguines chez les poissons 6,7. Le rein est composé d'unités fonctionnelles néphron trouvés dans les arrangements arborisée, entourés par du tissu hématopoïétique qui est dispersée à travers les espaces intermédiaires. La composante hématopoïétiques se compose de cellules souches hématopoïétiques (CSH) et de leurs descendants qui habitent les reins en phase terminale jusqu'à ce qu'ils différencient 8. En outre, il est maintenant reconnu que d'un groupe d'rénale cellules souches / progénitrices (RPC) habitent également les organes rénaux poisson-zèbre et permettre une régénération du rein et de la croissance, comme observé dans les autres espèces de poissons 9-11. À la lumière de cette nouvelle découverte, le rein poisson zèbre est un organe qui abrite l'emplacement de deux opportunités passionnantes pour les études de biologie cellulaire souches adultes. Il est clair que de nombreuses questions en suspens pourraient être bien servis avec ce système expérimental. Pour encourager l'expansion de ce domaine, il est bénéfique pour documenter des méthodes détaillées de visualiser et ensuite isoler l'organe de poisson zèbre pour adultes du rein. Ce protocole de détails de notre procédure de dissection du rein adulte à partir d'animaux non fixés à la fois et fixes. La dissection de l'organe du rein peut être utilisé pour isoler et caractériser les cellules souches hématopoïétiques et rénales et de leurs descendants en utilisant des techniques établies, telles que l'histologie, tri cellulaire par fluorescence (FACS) 11,12, 13,14 profilage de l'expression, et la transplantation 11,15. Nous espérons que la diffusion de ce protocole permettra aux chercheurs des connaissances nécessaires pour mettre en œuvre plus large recours à des études qui ont finalement poisson zèbre peut être traduit par l'application humaine.
Protocol
1. Dissection du rein zèbre adulte à partir d'un échantillon d'animaux non fixés
- Sélectionnez un zèbre adulte entre 3-6 mois d'âge pour la dissection.
- Euthanasier le poisson en le plaçant dans un plat avec 0,2% 7,0 tricaïne pH d'environ 4-5 minutes, à regarder attentivement pour voir que les branchies arrêter de bouger et le cœur cesse de battre.
- Avec une cuillère, soulevez le poisson du bain tricaïne dans une petite quantité de solution, décanter la solution et placez doucement l'animal sur une serviette en papier.
- Utilisez une paire de ciseaux de dissection d'enlever la tête de l'animal, faire une coupe juste derrière l'opercule des branchies (Figure 1, voie A). Jeter la tête dans un conteneur pour déchets biologiques dangereux.
- Utilisez des ciseaux de dissection d'ouvrir le corps de l'animal, en faisant une longue incision ventrale, à partir de la tête et se terminant à la queue à la base de la nageoire caudale (figure 1, chemin B).
- Enlever les organes internes de l'animal à l'aide d'une pincette de dissection / forceps, et les placer dans des déchets biologiques dangereux. Soyez prudent de ne pas frôler la paroi du corps dorsale, comme cela est l'emplacement du rein (Figure 2). Si vous avez choisi un poisson femelle, vous aurez besoin de ramasser les œufs en développement à sortir de la cavité du corps, qui peut être plus facilement fait en utilisant une paire d'angles de forceps ou de pincettes.
- Utiliser des aiguilles de dissection à la broche ouverte les parois du corps d'un plateau de dissection, et l'angle des broches pour que les reins peuvent être visualisées. Le rein doit posséder une forme caractéristique (tête, tronc / selle, la queue) et la couleur, la pigmentation étant entrecoupées de teintes noires (figure 2). Vous pouvez également voir l'aorte rempli de sang périphérique, qui descend de la ligne médiane de la structure d'organes.
- Utilisez une pince fine pour détacher le rein de la paroi dorsale du corps, en utilisant une paire de pince pour soulever le rein que vous vous séparez de l'orgue à partir des tissus conjonctifs qui sous-tendent.
- Placez délicatement le rein dans le véhicule désiré pour des études de cellules vivantes, comme un microtube contenant du PBS 1x pour la préparation de FACS.
2. Préparation et la dissection du rein zèbre adulte auprès d'un échantillon d'animaux fixes
- Préparer une solution de PBST paraformaldehyde/1X 4%. Faire bouillir la solution pour dissoudre la PFA dans la solution, puis refroidir le mélange à 4 ° C et ajouter 0,1% de diméthylsulfoxyde. Nous avons eu le plus de succès avec la préservation des tissus d'utiliser des solutions fraîchement préparées PFA, par opposition à aliquotes congelées. Faire suffisamment de solution pour immerger le poisson zèbre adulte lors de la dissection.
- Remplissez un bac de dissection avec une solution de fixation assez pour immerger le poisson zèbre adulte lors de la dissection. Nous effectuons les étapes suivantes avec ce bac placé sous le microscope, qui peuvent être placés dans une hotte chimique pour réduire l'exposition aux odeurs de fixation.
- Sélectionnez un zèbre adulte entre 3-6 mois d'âge pour la dissection.
- Euthanasier le poisson en le plaçant dans un plat avec 0,2% 7,0 tricaïne pH pendant environ 5 minutes, à regarder attentivement pour voir que les branchies et les coups d'arrêt cardiaque.
- Avec une cuillère, soulevez le poisson du bain tricaïne dans une petite quantité de solution, décanter la solution et placez doucement l'animal sur une serviette en papier.
- Utilisez une paire de ciseaux de dissection d'enlever la tête de l'animal, faire une coupe juste derrière l'opercule des branchies (Figure 1, voie A). Jeter la tête dans un conteneur pour déchets biologiques dangereux, et placer immédiatement l'animal dans le bac de dissection PFA contenant.
- Utilisez des ciseaux de dissection d'ouvrir le corps de l'animal, en faisant une longue incision ventrale, à partir de la tête et se terminant à la queue à la base de la nageoire caudale (figure 1, chemin B), et garder le corps partiellement immergé pendant la procédure.
- Enlever les organes internes de l'animal à l'aide d'une pincette de dissection / forceps, et les placer dans des déchets biologiques dangereux. Soyez prudent de ne pas frôler la paroi du corps dorsale, comme cela est l'emplacement du rein (Figure 2).
- Utiliser des aiguilles de dissection à la broche ouverte les parois du corps, et l'angle des broches pour que les reins peuvent être visualisées. Le rein doit posséder une forme caractéristique (tête, la selle, la queue) et la couleur, la pigmentation étant entrecoupées de teintes noires (figure 2). Vous pouvez également voir l'aorte rempli de sang périphérique, qui descend de la ligne médiane de la structure d'organes.
- Fixer l'échantillon pendant la nuit, plaçant la barre à 4 ° C lorsque vous avez terminé avec l'organisation les échantillons souhaités.
- Le lendemain, retirez la solution IFP dans le bac et remplacez avec 1x PBST.
- Utilisez une pince fine pour détacher soigneusement les reins de la paroi dorsale du corps, en utilisant une paire de pince pour soulever le rein que vous vous séparez de l'orgue à partir des tissus conjonctifs qui sous-tendent. Le tissu rénal sera molle et souple de la DMSO dans la solution de fixation, ce qui permet de disséquer les organes rénaux entière en un seul morceau.
- Utiliser une échellepipette de transfert alésage de placer le rein dans un tube à centrifuger.
- Le rein peut maintenant être traitées ultérieurement de procéder à monter histologique ou toute in situ des études d'expression génique basée sur l'étude souhaitée.
3. Les résultats représentatifs:
Les étapes qui sont schématisés à la figure 1 indique la procédure de dissection. Le rein peut être identifié grâce à sa forme caractéristique et la coloration, et la localisation anatomique de la paroi dorsale de la cavité du corps de l'animal, comme le montre la figure 2. Après dissection d'un échantillon de rein fixés, monter toute l'hybridation in situ peut être utilisé pour localiser l'expression d'un gène d'intérêt, comme le montre la figure 3.
Figure 1: Procédure qui permet un accès direct pour disséquer le rein adulte poisson zèbre. (A) est disséqué le poisson-zèbre euthanasiés de manière progressive (indiqué par des chiffres et des flèches) pour donner le chercheur le plus simple d'accès à l'organe de rein complet. Images de la cavité abdominale avant (B) et après (C) la suppression des organes abdominaux.
Figure 2:. Visualisation du rein poisson zèbre dans un échantillon non fixé Après le retrait d'organes dans la cavité du corps, le rein apparaît comme un seul organe aplati qui est adhérente à la paroi dorsale du corps par l'intermédiaire des tissus conjonctifs (A), et a été schématisé (B) pour montrer sa forme anatomique.
Figure 3: mount entier hybridations in situ réalisées sur l'organe rein adulte entier. (A) sont détectés cadherin17 transcriptions dans le tubule de néphrons rein adulte, agrandie en (A ') (B). Transcriptions mafba sont localisés proximale types de cellules du néphron dans le rein adulte (comparer à tubule ensemble dans le panneau A). (B' ) Une vue agrandie de l'expression mafba révèle que les transcriptions sont spécifiquement localisées à l'podocyte (P), les cellules du sang (glomérule) filtre et tubule contourné proximal (PCT).
Discussion
Les cellules souches adultes sont des éléments dynamiques et essentielles qui maintiennent la forme du corps adulte 1. Les cellules souches adultes peuvent aussi servir à contrer les dommages qu'il engage corps pendant les états pathologiques, et le dysfonctionnement ou la perte de cellules souches adultes peuvent conduire à la diminution du fonctionnement des organes et a été impliqué à conduire des tumeurs malignes du cancer et de contribuer au vieillissement. Les cellules souches adultes présentent des propriétés cellulaires qui les distinguent des types de cellules différenciées. Après la division cellulaire, les cellules souches adultes sont capables d'auto-renouvellement et la production de cellules progénitrices qui peuvent à leur tour donner naissance à leur progéniture différenciées distinctes. Il ya un grand intérêt dans la compréhension des voies qui régulent les décisions du destin cellulaire et la puissance des cellules souches adultes en raison de leur rôle important dans une homéostasie tissulaire. Par exemple, de nombreux scientifiques cherchent actuellement à identifier les signaux qui maintiennent les différentes populations de cellules souches adultes dans leur niche, ou microenvironnement spécialisé, et comment cette niche est impacté par des facteurs humoraux.
Adulte cellules souches hématopoïétiques (CSH) sont des cellules pluripotentes qui alimentent le rajeunissement continu de cellules sanguines chez les animaux 8. L'hématopoïèse est un processus dynamique qui est constamment en cours durant la vie d'un organisme des vertébrés parce que la maturité différenciées types de cellules sanguines sont de courte durée et doit donc être réapprovisionné régulièrement. Comme elles se divisent, CSH répondre à cette demande cruciale par auto-renouvellement et la production d'une série de progéniteurs qui donnent lieu à des cellules érythroïdes, lignées mégacaryocytaire, lymphoïdes et myéloïdes. Chacun de ces types de cellules sanguines exerce des fonctions uniques de la circulation, notamment en fournissant des échanges gazeux aux tissus, une manière pour l'étanchéité des blessures aux vaisseaux sanguins par des moyens de formation de caillot, ou des mécanismes de défense contre les pathogènes envahisseurs. Alors que les CSH ont été reconnus depuis de nombreuses années, une pléthore de questions restent sans réponse au sujet fascinant ces cellules incroyable. Des études récentes ont identifié des sous-classes de CSH avec différents à long terme des propriétés d'auto-renouvellement, et l'élucidation des composants de niche et les signaux qui modulent le comportement HSC 8. Le poisson zèbre est maintenant parmi les pierres angulaires des paradigmes de recherche de l'hématopoïèse, sur la base des attributs génétiques et moléculaires de ce modèle 8 animaux. Recherche utilisant le poisson zèbre a conduit à des informations nouvelles sur la biologie HSC qui sont conservées avec les vertébrés supérieurs comme les mammifères, en soulignant la pertinence des enquêtes biomédicales sang de poisson 8.
Historiquement, les connaissances sur les CSH a ouvert la voie à des expéditions qui cherchent à découvrir si d'autres organes du corps sont entretenus par les cellules souches adultes. De nombreuses populations de cellules souches adultes sont désormais appréciées à exister, allant à travers diverses structures du cerveau à l'intestin, la peau et le muscle squelettique. La poursuite des efforts dans le domaine des cellules souches cherchent à déterminer comment les cellules souches adultes et même d'autres types de cellules différenciées peut afficher la puissance améliorée dans divers milieux.
En ce qui concerne le rein, il ya eu un grand débat parmi les néphrologues de savoir si les cellules souches rénales existent 16. Conclusions indépendantes ont documenté les populations de cellules rénales chez les mammifères qui possèdent des degrés variables de potentiel régénératif, mais une compréhension cohérente de ces rapports n'a pas encore été atteint. Fait intéressant, il existe des preuves solides pour soutenir l'idée que les nombreuses espèces de poissons possèdent des cellules de carburant qui peut robuste régénération des néphrons endommagés, ainsi que développer néphrons entièrement nouvelle à l'âge adulte 9. Des travaux récents ont identifié les caractéristiques moléculaires des cellules souches adultes du rein dans le poisson zèbre 10,11, et démontré la puissance d'auto-renouvellement de ces soi-disant rénale cellules souches / progénitrices (RPC) 11. De futures études sont nécessaires pour déterminer si des cellules de rein analogues sont présents chez les mammifères. Néanmoins, des investigations ont continué sur les mécanismes cellulaires et moléculaires qui régulent les RPC poissons peuvent fournir un aperçu de la manière dont exploits régénérative peut être stimulée dans les reins de mammifères. Il est évident qu'il reste beaucoup à apprendre sur les RPC, et que les nombreux outils disponibles pour le chercheur de poisson zèbre peut être mis en œuvre pour s'attaquer à ces questions intrigantes.
Dans ce protocole, nous décrivons notre méthode pour l'identification et la dissection anatomique du rein poisson zèbre adulte. Étapes alternatives peuvent être utilisées pour disséquer les reins, comme l'ouverture de la cavité abdominale par une incision ventrale avec des ciseaux de dissection, cependant, nous avons rencontré le plus de succès dans l'accès du rein entier lorsque la paroi abdominale est épinglé ouverte et la tête est enlevée. Chercheurs de sang et les reins, qui souhaitent isoler et travailler avec ces types de cellules peuvent utiliser la méthode de dissection soit. Il faut noter que la méthode que nous décrivons pour isoler et working avec le rein adulte poisson zèbre n'est certainement pas limité à des scientifiques qui souhaitent poursuivre des questions de biologie des cellules souches adultes, comme la dissection de cet organe peut faciliter les études pour ceux des chercheurs qui poursuivent des enquêtes sur des sujets allant de la physiologie du vieillissement. En outre, cette méthode peut être couplée avec d'autres technologies telles que les transgéniques, afin de moléculairement étiquette, puis de purifier et d'étude des sous-populations distinctes de globules ou de rein de type sauvage ou génétiquement mutant de poisson zèbre 11. Pour l'avenir, de telles procédures de purification détaillée des types de cellules souches et progénitrices est vitale pour acquérir la connaissance sur la façon dont leur comportement est réglementée, comme les tests opérationnels tels que la transplantation ou la culture de progéniteurs constituent la base par laquelle la puissance et l'identité de ces cellules est définie. Les progrès récents dans hématopoïétiques progénitrices des méthodes de culture ouvrent de nombreuses voies nouvelles pour l'étude, et peuvent être adaptés à la culture des populations rénale 17. Zebrafish la génétique chimique ont été couronnés de succès dans l'identification des voies qui modulent les CSH et les progéniteurs rénale dans divers contextes 18-20, et continuera d'être un moyen utile de tester en combinaison avec les techniques de biologie cellulaire ci-dessus. Pris ensemble, il ya eu un certain nombre de contributions novatrices aux domaines de l'hématologie et néphrologie en utilisant le modèle de poisson zèbre, et a continué la recherche dans ces arènes promet de manier encore aperçus de transformation dans les années à venir.
Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Souhaite RAW à remercier les membres de la Zon et Davidson laboratoires de recherche pour leurs innombrables contributions à aider à développer des stratégies qui ont progressivement façonné cette technique de dissection chez le poisson zèbre adulte au cours des dix dernières années. En outre, nous tenons à exprimer notre gratitude aux membres du personnel du Centre Notre-Dame pour la recherche de poisson zèbre pour fournir d'excellents soins élevage en cours pour notre colonie de poisson zèbre. RAW recueilli des fonds de recherche de l'attribution de subvention NIH-NIDDK DK083512, et le laboratoire généreux fonds de démarrage de l'Université de Notre-Dame.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5882 | |
| Dissection forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5010 | |
| Dissection angled forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5058 | |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 19210 |
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