Summary
El riñón del pez cebra es el hogar de los renales y hematopoyéticas adultas células madre / progenitoras, y representa una oportunidad excepcional para estudiar estos tipos de células y su progenie en un organismo modelo de vertebrados. En este sentido, demostrar un procedimiento de disección detallada que permite al investigador identificar y extirpar el riñón del pez cebra adulto, que puede ser utilizado para aplicaciones tales como el aislamiento de células, los trasplantes, y los estudios de expresión de los riñones y / o poblaciones de células sanguíneas.
Abstract
Los investigadores que trabajan en el floreciente campo de la biología de células madre adultas tratar de entender las señales que regulan el comportamiento y la función de las células madre durante la homeostasis normal y los estados de enfermedad. La comprensión de las células madre adultas tiene amplias implicaciones de largo alcance para el futuro de la medicina regenerativa 1. Por ejemplo, un mejor conocimiento sobre la biología de células madre adultas pueden facilitar el diseño de estrategias terapéuticas en las que los órganos se activan para curarse a sí mismos o incluso la creación de métodos de órganos en crecimiento in vitro que pueden ser transplantados a los humanos 1. El pez cebra se ha convertido en un modelo animal de gran alcance para el estudio de la biología de las células de vertebrados 2. Ha habido una amplia documentación y análisis del desarrollo embrionario en el pez cebra 3. Sólo recientemente los científicos han tratado de documentar la anatomía y técnicas quirúrgicas de adultos disección 4, ya que ha habido un movimiento progresista dentro de la comunidad de pez cebra para ampliar las aplicaciones de este organismo de investigación para los estudios en adultos. Por ejemplo, hay expansión de los intereses en el uso de pez cebra para investigar la biología de poblaciones de células madre adultas y hacer modelos sofisticados para adultos de enfermedades como el cáncer 5. Históricamente, el aislamiento del riñón en los adultos de pez cebra ha sido fundamental para el estudio de la hematopoyesis, como el riñón es la localización anatómica de la producción de células sanguíneas en el pescado 6,7. El riñón está compuesto de unidades nefrona funcional se encuentra en los acuerdos arborized, rodeado de tejido hematopoyético que se dispersa a través de los espacios intermedios. El componente hematopoyético se compone de células madre hematopoyéticas (HSC) y sus descendientes que habitan en el riñón hasta que diferenciar terminal 8. Además, ahora se aprecia que un grupo de la función renal células madre / progenitoras (RPC) también habitan en el órgano del riñón del pez cebra y permitir la regeneración del riñón y el crecimiento, como se observa en otras especies de peces 11.09. A la luz de este nuevo descubrimiento, el riñón del pez cebra es un órgano que alberga la ubicación de dos grandes oportunidades para los estudios de biología de células madre adultas. Está claro que muchas cuestiones pendientes podría ser un buen servicio con este sistema experimental. Para alentar la expansión de este campo, es beneficioso para documentar los métodos detallados de visualizar y luego aislar a los órganos del pez cebra riñón adulto. Este protocolo detalla nuestro procedimiento para la disección del riñón en los adultos tanto de animales no fijadas y fijo. La disección de los órganos renales se puede utilizar para aislar y caracterizar las células madre hematopoyéticas y renal y su descendencia mediante técnicas establecidas, como la histología, la fluorescencia de clasificación de células activadas (FACS) 11,12, 13,14 perfiles de expresión, y el trasplante 11,15. Esperamos que la difusión de este protocolo se proporcionará a los investigadores con los conocimientos necesarios para poner en práctica un uso más amplio de los estudios de pez cebra que en última instancia, puede ser traducido para la aplicación humana.
Protocol
1. La disección del riñón adultos de pez cebra a partir de una muestra de animales no fijadas
- Seleccione un pez cebra adultos entre los 3-6 meses de edad para la disección.
- La eutanasia a los peces mediante la colocación en un plato con tricaína 0,2% 7,0 pH de aproximadamente 4-5 minutos, observando cuidadosamente para ver que las branquias dejan de moverse y el corazón deja de latir.
- Con una cuchara, levantar los peces desde el baño tricaína en una pequeña cantidad de solución, se decanta la solución y suavemente coloque el animal en una toalla de papel.
- Use un par de tijeras afiladas para quitar la disección de la cabeza del animal, haciendo un corte justo detrás del opérculo branquial (Figura 1, la ruta A). Deseche la cabeza en un recipiente para residuos biológicos peligrosos.
- Use las tijeras para abrir la disección del cuerpo del animal, haciendo una incisión ventral largo, a partir de la cabeza y terminando en la cola en la base de la aleta caudal (Figura 1, B ruta).
- Quitar los órganos internos del animal con un par de pinzas de disección / fórceps, y colocarlos en los residuos de riesgo biológico. Tenga cuidado de no cepillar la pared dorsal del cuerpo, ya que este es el lugar de los riñones (Figura 2). Si ha seleccionado un pez hembra, será necesario para sacar los óvulos en desarrollo de la cavidad del cuerpo, que puede ser más fácil de hacer con un par de ángulo de fórceps o pinzas.
- Use agujas de disección para pin abrir las paredes del cuerpo a una bandeja de disección, y el ángulo de las patillas, para que el riñón se puede visualizar. El riñón posee una forma característica (cabeza, tronco / silla de montar, la cola) y el color, se mezcle con la pigmentación de tonalidades negro (Figura 2). También puede ver la aorta llena de sangre periférica, que corre por la línea media de la estructura de los órganos.
- Use unas pinzas finas para separar el riñón de la pared dorsal del cuerpo, utilizando un par de pinzas para levantar el riñón como órgano separado de los tejidos conectivos que lo sustentan.
- Con cuidado, coloque el riñón en el vehículo deseado para estudios de células vivas, tales como un tubo de microcentrífuga que contiene 1x PBS para la preparación de FACS.
2. Preparación y disección del riñón adultos de pez cebra a partir de una muestra de animales fijos
- Prepare una solución de 4% PBST paraformaldehyde/1X. Hervir la solución para disolver la PFA en la solución, dejar enfriar la mezcla a 4 ° C y añadir 0,1% dimetilsulfóxido. Hemos tenido el mayor éxito con la preservación del tejido recién el uso de soluciones de PFA en comparación con alícuotas congeladas. Hacer una solución suficiente para sumergir el pez cebra adulto durante la disección.
- Llenar una bandeja de disección con una solución de fijación suficiente para sumergir los adultos de pez cebra durante la disección. Llevamos a cabo los pasos siguientes con esta bandeja colocada bajo el microscopio, que puede ser colocado en una campana de productos químicos para minimizar la exposición a los olores de la fijación.
- Seleccione un pez cebra adultos entre los 3-6 meses de edad para la disección.
- La eutanasia a los peces mediante la colocación en un plato con tricaína 0,2% pH 7.0 durante aproximadamente 5 minutos, observando cuidadosamente para ver que las branquias y golpes parar el corazón.
- Con una cuchara, levantar los peces desde el baño tricaína en una pequeña cantidad de solución, se decanta la solución y suavemente coloque el animal en una toalla de papel.
- Use un par de tijeras afiladas para quitar la disección de la cabeza del animal, haciendo un corte justo detrás del opérculo branquial (Figura 1, la ruta A). Deseche la cabeza en un recipiente para residuos biológicos peligrosos, e inmediatamente colocar el animal en la bandeja de disección de PFA que contienen.
- Use las tijeras para abrir la disección del cuerpo del animal, haciendo una incisión ventral largo, a partir de la cabeza y terminando en la cola en la base de la aleta caudal (Figura 1, B itinerario circuito), y mantener el cuerpo parcialmente sumergido durante el procedimiento.
- Quitar los órganos internos del animal con un par de pinzas de disección / fórceps, y colocarlos en los residuos de riesgo biológico. Tenga cuidado de no cepillar la pared dorsal del cuerpo, ya que este es el lugar de los riñones (Figura 2).
- Use agujas de disección para pin abrir las paredes del cuerpo, y el ángulo de las patillas, para que el riñón se puede visualizar. El riñón posee una forma característica (la cabeza, silla de montar, la cola) y el color, se mezcle con la pigmentación de tonalidades negro (Figura 2). También puede ver la aorta llena de sangre periférica, que corre por la línea media de la estructura de los órganos.
- Fijar la muestra durante la noche, la colocación de la bandeja a 4 ° C cuando haya terminado con la organización de las muestras que desee.
- Al día siguiente, retire la solución de PFA de la bandeja y reemplazarla con 1x PBST.
- Use unas pinzas finas para separar cuidadosamente del riñón de la pared dorsal del cuerpo, usando un par de pinzas para levantar el riñón como órgano separado de los tejidos conectivos que lo sustentan. El tejido del riñón será suave y flexible del DMSO en la solución de fijación, por lo que es posible dividir el órgano del riñón entero en una sola pieza.
- Utilice un niveldio pipeta para colocar el riñón en un tubo de microcentrífuga.
- El riñón puede ahora ser tratados posteriormente para llevar a cabo montaje histológicos o en su totalidad in situ estudios de expresión génica basada en el estudio deseado.
3. Los resultados representativos:
Los pasos que se esquematiza en la figura 1 indican el procedimiento de disección. El riñón puede ser identificado en base a su característica forma y coloración, y la localización anatómica en la pared dorsal de la cavidad del cuerpo del animal, como se muestra en la Figura 2. Después de la disección de una muestra fija de riñón, montar toda la hibridación in situ se puede utilizar para localizar la expresión de un gen de interés, como se muestra en la Figura 3.
Figura 1: Procedimiento que permite el acceso directo para la disección del riñón adulto pez cebra. (A) pez cebra eutanasia se diseca en forma escalonada (indicado por los números y las flechas) para dar al investigador el acceso más fácil a los órganos riñón completo. Las imágenes de la cavidad abdominal antes (B) y después (C) la extracción de los órganos abdominales.
Figura 2:. Visualización del riñón del pez cebra en una muestra no fijadas Tras la eliminación de órganos en la cavidad del cuerpo, el riñón aparece como un solo órgano, aplanado que se adhiere a la pared dorsal del cuerpo a través de los tejidos conectivos (A), y ha sido esquematizado (B) para mostrar su forma anatómica.
Figura 3: Todo el montaje hibridaciones in situ realizadas en el órgano renal del adulto entero. (A) cadherin17 transcripciones se detectan en los túbulos de las nefronas del riñón adulto, ampliada en (A) (B). Transcripciones mafba se localizan proximal tipos de células nefrona en el riñón adulto (en comparación con los túbulos todo en el panel A). (B ' ) Una visión ampliada de expresión mafba revela que las transcripciones son específicamente localizada en el podocito (P), las células de la sangre del filtro (glomérulo) y túbulo contorneado proximal (PCT).
Discussion
Las células madre adultas son componentes dinámicos y esenciales que mantienen la forma del cuerpo adulto 1. Las células madre adultas también pueden servir para contrarrestar los daños en que incurra el cuerpo durante los estados de enfermedad y la disfunción o pérdida de las células madre adultas pueden llevar a la disminución de la función del órgano y se ha implicado a la unidad de neoplasias malignas y contribuyen al envejecimiento. Las células madre adultas tienen propiedades celulares que los distinguen de otros tipos de células diferenciadas. Tras la división celular, las células madre adultas son capaces de auto-renovación y la producción de células progenitoras que, a su vez puede dar lugar a la descendencia diferenciada distintas. Existe un gran interés en la comprensión de las vías que regulan las decisiones del destino celular y la potencia de las células madre adultas, debido a su importante papel en la homeostasis del tejido 1. Por ejemplo, muchos científicos en la actualidad tratan de identificar las señales que mantienen diferentes poblaciones de células madre adultas en su nicho o microambiente especializado, y cómo este lugar se ve afectada por factores humorales.
Adulto las células madre hematopoyéticas (HSC) son células pluripotentes que impulsan la renovación continua de las células de la sangre en los animales 8. La hematopoyesis es un proceso dinámico que está constantemente en curso durante la vida de un organismo vertebrado por la madurez tipos diferenciados de células sanguíneas son de corta duración y por lo tanto deben ser reemplazados regularmente. Cuando se dividen, HSCs satisfacer esta demanda fundamental de auto-renovación y la producción de una serie de células progenitoras que dan origen a los eritrocitos, los linajes de megacariocitos, linfoides y mieloides. Cada uno de estos tipos de células sanguíneas realiza funciones únicas en la circulación, incluido el suministro de gas a cambio de tejido, una forma para el sellado de las lesiones de los vasos sanguíneos a través de la formación de coágulos, o los mecanismos de defensa contra los patógenos invasores. Mientras que las CMH se han reconocido durante muchos años, una gran cantidad de preguntas fascinantes siguen sin respuesta acerca de estas células increíble. Estudios recientes han identificado las subclases de HSCs con distintas a largo plazo de renovación de auto-propiedades, y el esclarecimiento de los componentes del nicho de mercado y las señales que modulan el comportamiento de HSC 8. El pez cebra es ahora uno de los pilares de la hematopoyesis paradigmas de la investigación, en base a los atributos genéticos y moleculares de este modelo animal 8. Investigación utilizando el pez cebra ha dado lugar a nuevos conocimientos sobre la biología de HSC que se conservan en los vertebrados superiores como los mamíferos, destacando la relevancia de las investigaciones biomédicas sangre de pescado 8.
Históricamente, el conocimiento sobre las CEH ha allanado el camino para las expediciones que buscan descubrir si otros órganos del cuerpo son mantenidos por las células madre adultas. Numerosas poblaciones de células madre adultas están apreciado que existen, que van a través de diversas estructuras del cerebro con el intestino, la piel y el músculo esquelético. Continuos esfuerzos en el campo de células madre tratan de determinar cómo las células madre adultas y los tipos diferenciados hasta otras células pueden mostrar mayor potencia en diversos entornos.
Con respecto a los riñones, no ha habido un gran debate entre los nefrólogos en cuanto a si las células madre existen renal 16. Investigaciones independientes han documentado poblaciones de células de riñón de los mamíferos que poseen distintos grados de potencial regenerativo, pero una comprensión coherente de estos informes aún no se ha logrado. Curiosamente, hay pruebas sólidas para apoyar la idea de que muchas especies de peces poseen células que pueden alimentar con firmeza la regeneración de las nefronas dañadas, así como crecer nefronas totalmente nuevo en la edad adulta 9. Trabajos recientes han identificado las características moleculares de las células del riñón adulto madre en el pez cebra 10,11, y demostró la potencia de auto-renovación de los llamados renal células madre / progenitoras (RPC) 11. Se necesitan más estudios para determinar si las células del riñón análogos están presentes en los mamíferos. Sin embargo, continuaban las investigaciones sobre los mecanismos celulares y moleculares que regulan la RPC de pescado puede dar una idea de cómo hazañas regenerativa puede ser estimulada en el riñón de mamífero. Es evidente que aún queda mucho por comprender acerca de RPC, y que las muchas herramientas disponibles para el investigador del pez cebra pueden ser implementadas para abordar estas cuestiones intrigantes.
En este protocolo, que describe nuestro método para la identificación anatómica y la disección del riñón adultos de pez cebra. Medidas alternativas se pueden utilizar para analizar el riñón, como la apertura de la cavidad abdominal con una incisión ventral con tijeras de disección, sin embargo, nos hemos encontrado con más éxito en el acceso a todo el riñón cuando la pared abdominal se fija abierta y la cabeza se retira. Investigadores de la sangre y son del mismo tipo que desean aislar y trabajar con estos tipos de células pueden utilizar cualquiera de los métodos de disección. Cabe señalar que el método se describe para el aislamiento y working con el riñón en los adultos de pez cebra no se limita a los científicos que deseen realizar preguntas de la biología de células madre adultas, como la disección de este órgano puede facilitar los estudios a los investigadores llevar a cabo investigaciones sobre temas que van desde la fisiología del envejecimiento. Además, este método puede ser complementado con otras tecnologías como los transgénicos, con el fin de la etiqueta molecular y luego purificar y estudiar las subpoblaciones discretas de células sanguíneas o de riñón de tipo salvaje o genéticamente pez cebra mutante 11. Mirando hacia el futuro, como los procesos de purificación detallada de los tipos de células madre y progenitoras es vital para obtener conocimiento acerca de cómo se regula su comportamiento, como las pruebas de funcionamiento, tales como el trasplante de progenitores o cultivo constituyen la base sobre la cual la potencia y la identidad de estas células se define. Los avances recientes en métodos progenitoras hematopoyéticas cultura abrir muchas nuevas vías de estudio, y puede ser adaptado para el cultivo de las poblaciones renal 17. Pez cebra genética química han tenido éxito en la identificación de las vías que modulan HSCs y progenitores renal en diversos contextos 18-20, y seguirá siendo una vía útil para poner a prueba en combinación con las técnicas de biología por encima de la celda. En su conjunto, ha habido una serie de aportaciones innovadoras en los campos de la hematología y la nefrología con el modelo de pez cebra, y continuó la investigación en estos ámbitos se compromete a ejercer otras ideas de transformación en los próximos años.
Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Deseos RAW agradecer a los miembros de la Zon y Davidson laboratorios de investigación de sus innumerables contribuciones a ayudar a desarrollar estrategias que han ido dado forma a esta técnica de disección en el pez cebra adulto en la última década. Además, deseamos expresar nuestra gratitud a los miembros del personal del Centro de Notre Dame para la Investigación de pez cebra para proporcionar una excelente atención permanente para la cría de nuestra colonia de pez cebra. RAW obtuvo financiación de la investigación de la adjudicación NIH NIDDK conceder DK083512 y de laboratorio generosa financiación inicial de la Universidad de Notre Dame.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5882 | |
| Dissection forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5010 | |
| Dissection angled forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5058 | |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 19210 |
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