Dissekering av vuxna Zebrafish Kidney

Summary

Den zebrafisk njure är hem för både njur-och hematopoetisk stamceller från vuxna / progenitorceller, och representerar ett enastående tillfälle att studera dessa celltyper och deras avkomma i ett ryggradsdjur modell organism. Här visar vi en utförlig dissektion förfarande som gör det möjligt för forskare att identifiera och kirurgiskt ta bort den vuxna zebrafisk njure, som kan användas för applikationer såsom cell isolering, transplantation och studier uttryck för njur-och / eller blod populationer cell.

Abstract

Forskare som arbetar inom den växande området för vuxna stamcellsbiologi försöka förstå de signaler som reglerar beteende och funktion av stamceller under normal homeostas och stater sjukdom. Förståelsen av vuxna stamceller har bred vittgående konsekvenser för framtiden för regenerativ medicin ^1. Till exempel kan bättre kunskap om vuxna stamcellsbiologi underlätta utformningen av behandlingsstrategier, där organ utlöses att läka sig själva eller till och med skapandet av metoder för att odla organ in vitro som kan transplanteras till människor ^1. Den zebrafisk har blivit en kraftfull djurmodell för studier av ryggradsdjur cellbiologi ^2. Det har varit omfattande dokumentation och analys av embryonal utveckling i zebrafisk ^3. Först nyligen har forskare försökt att dokumentera vuxna anatomi och kirurgiska tekniker dissekering ^4, eftersom det har skett en progressiv rörelse i zebrafisk samfundet för att bredda tillämpningar av denna forskning organism till vuxenstudier. Till exempel är det växande intresse i att använda zebrafisk att undersöka biologi vuxna populationer stamceller och gör sofistikerade vuxna modeller av sjukdomar som cancer ^5. Historiskt sett har isolering av zebrafisk vuxna njur varit avgörande för att studera blodbildningen, eftersom njurarna är den anatomiska belägenhet blodkroppar produktion i fisk ^6,7. Njurarna består av nephron funktionella enheter finns i arborized arrangemang, omgiven av hematopoetisk vävnad som är spridda över hela mellanliggande utrymmen. De hematopoetiska komponenten består av hematopoetiska stamceller (HSCs) och deras avkomma som lever i njuren tills de obotligt skilja ^8. Dessutom är det nu uppskattat att en grupp av renal stam / progenitorceller (RPC) också bebor zebrafisk njuren orgel och att både njure förnyelse och tillväxt som observerats i andra fiskarter ^9-11. I ljuset av denna nya upptäckt är zebrafisk njuren ett organ som rymmer plats för två spännande möjligheter för vuxna biologi stamceller studier. Det är tydligt att många kvarstående frågor mycket väl kan serveras med detta experimentella system. För att uppmuntra expansion av detta område, är det fördelaktigt att dokumentera detaljerade metoder för att visualisera och sedan isolera den vuxna orgeln zebrafisk njure. Detta protokoll detaljer vårt förfarande för dissekering av den vuxna njure från både ofixerade och fasta djur. Dissekering av njuren organ kan användas för att isolera och karakterisera hematopoetisk och njur-stamceller och deras avkomma hjälp av etablerade tekniker såsom histologi, fluorescens aktiverad cell sortering (FACS) ^11,12, expression profiling ^13,14, och transplantation ^11,15. Vi hoppas att spridning av detta protokoll kommer att ge forskare med kunskap för att genomföra en bredare användning av zebrafisk studier som i slutändan kan översättas för tillämpning på människor.

Protocol

1. Dissektion av den vuxna zebrafisk njure från en ofixerade djur prov

1. Välj en vuxen zebrafisk mellan 3-6 månader i ålder för dissekering.
2. Euthanize fisken genom att placera den i en skål med 0,2% Tricaine pH 7,0 i ca 4-5 minuter, titta noga för att se att gälarna slutar röra och hjärtat slutar slå.
3. Med hjälp av en sked, lyfta fisk från Tricaine bad i en liten mängd lösning, häll lösningen och försiktigt placera djuret på en pappershandduk.
4. Använd en vass par dissekering sax för att ta bort huvudet av djuret, vilket gör ett snitt strax bakom gäl gällocket (Figur 1, väg A). Kasta huvudet i ett biologiskt avfallsbehållare.
5. Använd dissekering sax för att öppna kroppen av djuret, genom att göra en lång ventrala snitt, från huvudet och avslutas vid samma svans vid basen av stjärtfenan (Figur 1, stig B).
6. Ta bort de inre organen av djuret med hjälp av ett par dissektion pincett / tång, och placera dem i behållare för biologiskt avfall. Var noga med att inte borsta rygg kroppen väggen, eftersom det är platsen för njurarna (figur 2). Om du har valt en kvinnlig fisk, måste du ösa utveckla ägg ur kroppen hålighet, som kan vara enklast att använda en vinklad pincett eller pincett.
7. Använd dissekering nålar till stift öppna kroppen väggarna till en dissektion fack och vinkel stiften så att njuren kan visualiseras. Njuren kommer att ha en karakteristisk form (huvud, bål / sadel, svans) och färg, som varvas med svarta färgade pigment (Figur 2). Du kan också se stora kroppspulsådern fylld med perifert blod, som rinner ner mittlinjen orgeln struktur.
8. Använd fin pincett för att lösgöra njuren från rygg kroppen väggen, med hjälp av en pincett för att lyfta njuren som du separera organ från den bindväv som ligger bakom det.
9. Placera försiktigt njuren in önskat fordonet för fortsatta levande cell studier, till exempel en mikrocentrifugrör innehåller 1x PBS för FACS beredning.

2. Upprättande och dissekering av den vuxna zebrafisk njure från en fast djur prov

1. Bered en lösning på 4% paraformaldehyde/1X PBST. Koka att lösa upp PFA i lösning och sedan svalna blandningen till 4 ° C och tillsätt 0,1% dimetylsulfoxid. Vi har haft mest framgång med vävnad bevaras från att använda nybakade PFA lösningar i motsats till fryst alikvoter. Gör nog lösningen att dränka den vuxna zebrafisk under dissektion.
2. Fyll en dissektion bricka med tillräckligt fixering lösning för att dränka den vuxna zebrafisk under dissekering. Vi utför de efterföljande stegen med detta fack placeras under mikroskop, som kan placeras i en kemisk huva att minimera exponeringen för fixering lukter.
3. Välj en vuxen zebrafisk mellan 3-6 månader i ålder för dissekering.
4. Euthanize fisken genom att placera den i en skål med 0,2% Tricaine pH 7,0 i ca 5 minuter, titta noga för att se att gälar och hjärtat slutar slå.
5. Med hjälp av en sked, lyfta fisk från Tricaine bad i en liten mängd lösning, häll lösningen och försiktigt placera djuret på en pappershandduk.
6. Använd en vass par dissekering sax för att ta bort huvudet av djuret, vilket gör ett snitt strax bakom gäl gällocket (Figur 1, väg A). Kasta huvudet i en biologiskt avfall behållare och omedelbart placera djuret i PFA innehåller dissektion facket.
7. Använd dissekering sax för att öppna kroppen av djuret, genom att göra en lång ventrala snitt, från huvudet och avslutas vid samma svans vid basen av stjärtfenan (Figur 1, stig B), och hålla kroppen delvis nedsänkt under förfarandet.
8. Ta bort de inre organen av djuret med hjälp av ett par dissektion pincett / tång, och placera dem i behållare för biologiskt avfall. Var noga med att inte borsta rygg kroppen väggen, eftersom det är platsen för njurarna (figur 2).
9. Använd dissekering nålar till stift öppna kroppen väggarna och vinkel stiften så att njuren kan visualiseras. Njuren kommer att ha en karakteristisk form (huvud, sadel, svans) och färg, som varvas med svarta färgade pigment (Figur 2). Du kan också se stora kroppspulsådern fylld med perifert blod, som rinner ner mittlinjen orgeln struktur.
10. Fixera provet över natten, placera plattan vid 4 ° C när du är klar med att arrangera den önskade prover.
11. Nästa dag, ta bort PFA-lösning från facket och ersätta med 1x PBST.
12. Använd fin pincett för att försiktigt loss njure från rygg kroppen väggen, med hjälp av en pincett för att lyfta njuren som du separera organ från den bindväv som ligger bakom det. Den njurvävnaden blir mjukt och smidigt från DMSO i fixativ lösningen gör det möjligt att dissekera hela njuren orgeln i ett stycke.
13. Använd en bredbar överföra pipett för att placera njuren till ett mikrocentrifugrör.
14. Njuren kan nu bearbetas vidare att genomföra histologiska eller hela montera in situ studier genuttryck baserat på den önskade studien.

3. Representativa resultat:

De steg som diagrammed i Figur 1 visar dissektion förfarande. Njuren kan identifieras baserat på dess karaktäristiska form och färg, och anatomiska läge på rygg väggen i djurets kropp hålighet, som visas i figur 2. Efter dissektion av en fast njure prov, hela montera in situ hybridisering kan användas för att lokalisera uttrycket av en gen av intresse, vilket visas i figur 3.

Figur 1: Förfarande som möjliggör direkt tillträde för att dissekera de zebrafisk vuxen njure. (A) avlivas zebrafisk dissekeras i en stegvis (anges med siffror och pilar) för att ge forskaren lättast tillgång till hela njuren orgel. Bilder av bukhålan före (B) och efter (C) avlägsnande av bukorganen.

Figur 2:. Visualisering av zebrafisk njurarna hos en ofixerade prov Efter borttagande av organ i kroppen hålighet visas njure som en enda tillplattad, organ som är anhängare till rygg kropp väggen via bindväv (A), och har schematized (B) för att visa sin anatomiska form.

Figur 3: Hela montera in situ hybridizations utförs på hela den vuxna njuren orgel. (A) cadherin17 utskrifter upptäcks i tubuli av vuxna njure nefroner, utvidgad (A). (B) mafba avskrifter är lokaliserade proximalt typer nephron cell i vuxen njure (jämför till hela tubuli i panel A). (B " ) en förstorad bild av mafba uttryck visar att utskrifterna är specifikt lokaliserade till podocyte (P) celler i blodet filtret (glomeruli) och proximala tubuli (PCT).

Discussion

Adulta stamceller är dynamiska och viktiga komponenter som upprätthåller den vuxna kroppen formulär ^1. Vuxna stamceller kan också användas för att motverka skador som kroppen ådrar sig vid sjukdomstillstånd och dysfunktion eller förlust av adulta stamceller kan leda till att nedgången av organfunktion och har varit inblandad köra cancer maligniteter och bidra till åldrande. Adulta stamceller uppvisar cellulära egenskaper som skiljer dem från differentierade celltyper. Vid celldelning, vuxna stamceller kan självförnyelse och produktion av stamceller som i sin tur kan ge upphov till olika differentierade avkomma. Det finns ett stort intresse av att förstå de vägar som reglerar de beslut cellen öde och styrka av adulta stamceller på grund av deras viktiga roller i vävnad homeostas ^1. Till exempel, många forskare försöker nu identifiera de signaler som upprätthåller olika vuxna populationer stamceller i sin nisch, eller specialiserade mikromiljö, och hur denna nisch påverkas av humorala faktorer.

Vuxna hematopoetiska stamceller (HSCs) är pluripotenta celler som driver kontinuerlig föryngring av blodceller hos djur ^8. Hematopoes är en levande process som ständigt pågår under livet av en ryggradsdjur organism eftersom de mogna differentierade blodet celltyper är kortlivade och därför måste fyllas på regelbundet. När de klyftan, HSCs leverera denna viktiga efterfrågan genom att själv förnya och producera en serie av stamceller som ger upphov till erytroida, megakaryocyte, lymfoida och myeloida linjerna. Var och en av dessa typer blodkroppar utför unika funktioner i cirkulationen, bl.a. skall gasväxling på vävnad, ett sätt för tätning skador på blodkärl med hjälp av koagelbildning eller försvarsmekanismer mot invaderande patogener. Medan HSCs har redovisats i många år, en uppsjö av fascinerande frågor förblir obesvarade om dessa fantastiska celler. Nyligen genomförda studier har identifierat subklasser HSCs med olika långsiktiga självförnyelse egenskaper, och klarlägga nisch komponenter och signaler om att modulera HSC beteende ^8. Den zebrafisk är nu bland de hörnstenar paradigm blodbildningen forskning, baserad på den genetiska och molekylära egenskaper hos denna djurmodell ^8. Forskning utnyttja zebrafisk har lett till nya insikter om HSC biologi som bevaras med högre ryggradsdjur som däggdjur, betonar biomedicinska relevansen av undersökningarna fisk blod ^8.

Historiskt har kunskap om HSCs banade väg för expeditioner försöker upptäcka om andra kroppens organ upprätthålls av vuxna stamceller. Många vuxna stamceller är nu uppskattas att existera, allt i olika strukturer från hjärnan till tarmen, huden och skelettmuskulaturen. Fortsatta ansträngningar i stamceller fältet försöka identifiera hur adulta stamceller och även andra differentierade celltyper kan visa förbättrade styrkan i olika miljöer.

Med avseende på njurarna, har det varit stor debatt bland nefrologer om huruvida nedsatt stamceller finns ^16. Oberoende fynd har dokumenterat populationer av njure hos däggdjur som har olika grader av regenerativ potential, men en samlad förståelse av dessa rapporter har ännu inte uppnåtts. Intressant, det finns starka belägg för uppfattningen att många fiskarter har celler som klart kan bränslet regenerering av skadad nefroner liksom växer helt nya nefroner i vuxen ålder ^9. Senaste arbete har identifierat den molekylära kännetecknen för vuxna celler njure stamceller i zebrafisk ^10,11 och visade självförnyelse styrkan hos dessa så kallade nedsatt stam / progenitorceller (RPC) ^11. Framtida studier behövs för att avgöra om motsvarande njurceller finns i däggdjur. Kan dock fortsatt utredning om de cellulära och molekylära mekanismer som reglerar fisk RPC ger inblick i hur regenerativ bedrifter kan stimuleras i däggdjur njuren. Det är uppenbart att mycket återstår att förstå om RPC, och att många verktyg nu tillgängliga för zebrafisk forskare kan genomföras för att tackla dessa spännande frågor.

I detta protokoll, beskriver vi vår metod för anatomisk kartläggning och dissekering av den vuxna zebrafisk njuren. Alternativa åtgärder kan användas för att dissekera njurarna, såsom att öppna bukhålan med en ventral snitt med dissektion sax, men vi har stött på det mest framgång i att få tillgång till hela njuren när bukväggen är låst öppen och huvudet är borttaget. Blod och njure forskare såväl som vill isolera och arbeta med dessa typer av celler kan använda antingen dissekeringsmetod. Det bör noteras att den metod vi beskriver för isolering och Working med zebrafisk vuxna njur är definitivt inte begränsad till forskare som vill driva frågor om adulta stamceller biologi, dissektion av detta organ kan underlätta studierna för de forskare utföra undersökningar om ämnen som sträcker sig från fysiologi till åldrandet. Dessutom kan denna metod tillsammans med annan teknik, såsom transgena, så molekylärt att märka och sedan rena och studera diskreta delpopulationer av blod eller njure celler från wildtype eller genetiskt muterade zebrafisk ^11. Ser fram emot är sådana detaljerade rening förfaranden av stamceller och stamceller celltyper viktigt att få kunskap om hur deras beteende är reglerad, eftersom operativa tester som transplantation eller stamfader odling utgör grunden med vilken styrka och identitet av dessa celler definieras. Senaste framstegen inom hematopoetiska metoder stamceller kultur öppnar många nya vägar för studier, och kan anpassas till odling av nedsatt populationer ^17. Zebrafisk kemisk genetik har varit framgångsrika i att identifiera vägar som modulerar HSCs och nedsatt stamceller i olika sammanhang ^18-20, och kommer att fortsätta att vara en bra väg att testa i kombination med ovanstående tekniker cellbiologi. Sammantaget har det funnits ett antal banbrytande bidrag till inom hematologi och nefrologi med zebrafisk-modellen, och fortsatt forskning inom dessa arenor lovar att utöva ytterligare omvälvande insikter under de kommande åren.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissection scissors	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5882
Dissection forceps	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5010
Dissection angled forceps	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5058
Tricaine	Sigma-Aldrich	E10521
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	19210