Summary
Zebrafish böbrek, her iki böbrek ve hematopoetik yetişkin kök / progenitör hücrelerin ev ve bu omurgalı bir model organizmadaki hücre tipleri ve onların soyu incelemek için olağanüstü bir fırsat teşkil etmektedir. Burada, yetişkin zebrafish böbrek hücre izolasyonu, nakli, böbrek ve / veya kan hücre popülasyonlarının ifade çalışmaları gibi uygulamalar için de kullanılabilir belirlemek ve cerrahi kaldırmak için araştırmacı sağlayan ayrıntılı bir diseksiyon prosedürü göstermektedir.
Abstract
Gelişen erişkin kök hücre biyolojisi alanında çalışan araştırmacılar, kök hücrelerin normal homeostaz ve hastalık durumlarında sırasında davranış ve fonksiyon düzenleyen sinyalleri anlamaya çalışıyoruz. Anlayış yetişkin kök hücrelerin rejeneratif tıp 1 geleceği için geniş kapsamlı etkileri vardır. Örneğin, yetişkin kök hücre biyolojisi hakkında daha iyi bilgi organları kendileri ya da in vitro insanlarda 1 naklediliyor olabilir büyüyen organlar için yöntemlerin oluşturulması bile iyileşmek için devreye girdiği tedavi stratejileri tasarımı kolaylaştırabilir . Zebra balığı omurgalı hücre biyolojisi 2 çalışma için güçlü bir hayvan modeli haline gelmiştir. Kapsamlı bir belgeleme ve analiz zebrafish 3 embriyonik gelişme olmuştur. Sadece son zamanlarda Erişkin çalışmalarında bu araştırma organizmanın uygulamalarını genişletmek için, zebrafish toplum içinde ilerici bir hareket var olduğu gibi, yetişkin anatomi ve cerrahi diseksiyon teknikleri 4 belgelemek için çalışan bilim adamları var. Örneğin, yetişkin kök hücre popülasyonlarının biyolojisi araştırmak ve kanser 5 gibi hastalıkların gelişmiş yetişkin modeller yapmak için zebrafish kullanarak çıkarları genişletiyoruz . Tarihsel olarak, böbrek kan hücresi üretimi balık 6,7 anatomik konuma olarak zebrafish yetişkin böbrek izolasyonu, hematopoez çalışmak için enstrümantal olmuştur. Böbrek müdahale alanlarda boyunca dağınık hematopoetik doku ile çevrili arborized düzenlemeler bulundu nefron işlevsel birimler oluşur. Hematopoetik bileşeni ölümcül 8 ayırt kadar böbrek yaşamaktadır hematopoietik kök hücreleri (HKH'lerin) ve döl oluşur. Buna ek olarak, diğer balık türlerinin 9-11 de görüldüğü gibi, böbrek kök / progenitör hücrelerin (RPC) bir grup da Zebra balığı böbrek organ yaşayan ve böbrek yenilenme ve büyüme hem etkinleştirmek takdir edilmektedir. , Bu yeni bulgunun ışığında, zebrafish bir böbrek, iki yetişkin kök hücre biyolojisi çalışmaları için heyecan verici fırsatlar yerini barındıran bir organdır. Bu çok üstün sorular bu deneysel sistem ile servis olabilir açıktır. Bu alanda genişleme teşvik etmek, görselleştirme ayrıntılı yöntemleri belge ve daha sonra yetişkin zebrafish böbrek organın izole faydalıdır. Bu protokol, Sabitlenmemiş hem de sabit hayvanlar yetişkin böbrek diseksiyon için bizim prosedür. Böbrek organ Diseksiyon, histoloji, floresan hücre aktif sıralama (FACS) 11,12, ifade profil 13,14 ve 11,15 nakli olarak kurulan teknikleri kullanarak ve böbrek hematopoetik kök hücreler ve onların çocukları izole ve karakterize etmek için kullanılabilir. Biz bu protokolün bu yayılması, sonuçta insan uygulama için tercüme edilebilir zebrafish çalışmaların daha geniş kullanım uygulamak için bilgi ile araştırmacılar sağlayacaktır umuyoruz.
Protocol
1. Sabitlenmemiş bir hayvan örneği, erişkin zebrafish böbrek Diseksiyon
- Diseksiyon için yaş 3-6 ay arasında bir yetişkin zebrafish seçin.
- Balık solungaçları hareketli ve kalbim duracak gibi oluyor durdurmak görmek için dikkatle izlerken, yaklaşık 4-5 dakika boyunca,% 0.2 Tricaine pH 7.0 ile bir çanak içine yerleştirerek Euthanize.
- Bir kaşık kullanarak, küçük bir miktar çözüm Tricaine banyo balık kaldırmak çözüm süzün ve yavaşça bir kağıt havlu üzerine hayvan.
- Diseksiyon makas keskin bir çift solungaç operculum'un (Şekil 1, yolu A) hemen arkasında bir kesim yapma, hayvanın baş kaldırmak için kullanın. Biohazard bir çöp bidonuna kafa atın.
- Başlayarak baş ve kuyruk yüzgeci tabanı (Şekil 1, yol B) kuyruk sonlandırma, uzun ventral kesi yaparak, hayvanın vücut açmak için diseksiyon makas kullanın.
- Bir çift diseksiyonu cımbız / forseps kullanarak hayvanın iç organları çıkarın ve biyolojik tehlikeli atık koyun. Bu böbrek yeri (Şekil 2) olarak, dorsal vücut duvarı fırça için dikkatli olun. Eğer bir kadın balık seçtiyseniz, gelişmekte olan yumurta, vücut boşluğu, açılı çift forseps veya cımbız kullanarak en kolay yapılabilir kepçe gerekecektir.
- Diseksiyonu tepsiye beden duvarları açık pin ve böbrek görüntülenmiştir böylece pimleri açısını diseksiyon iğneleri kullanın. Böbrek, karakteristik bir şekli (baş, gövde / eyer, kuyruk) ve renk siyah Mutfak dekorasyonunun puf noktalari pigmentasyon (Şekil 2) ile serpiştirilmiş sahip olacaktır. Ayrıca, periferik kan, organ yapısı orta hatta aşağı doğru akıyor dolu aort görebilirsiniz.
- Dorsal vücut duvarı, böbrek, böbrek, bunun altında yatan bağ doku organ ayrı olarak kaldırmak için forseps bir çift kullanarak ayırmak için ince forseps kullanın.
- FACS hazırlanması için 1x PBS içeren bir mikrosantrifüj tüp olarak daha fazla canlı hücre çalışmaları, istenilen araca böbrek yavaşça yerleştirin.
2. Sabit bir hayvan örneği yetişkin zebrafish böbrek hazırlanması ve diseksiyon
- % 4 paraformaldehyde/1X PBST bir çözüm hazırlayın. PFA çözüm içine çözmek için çözüm kaynatın, sonra 4 ° C karışımı serin ve% 0.1 dimethylsülfoksit eklemek. Biz dondurulmuş alikot karşı taze yapılmış PFA çözümleri kullanılarak doku korunması ile en başarılı olmuştur. Diseksiyon sırasında yetişkin zebrafish batığın için yeterli bir çözüm olun.
- Diseksiyonu tepsi batığın diseksiyonu sırasında yetişkin zebrafish için yeterli fiksasyon çözümü ile doldurun. Biz fiksasyon kokulara maruz kalma en aza indirmek için bir kimyasal başlığı yerleştirilebilir mikroskop altında konumlandırılmış bu tepsi, sonraki adımları gerçekleştirin.
- Diseksiyon için yaş 3-6 ay arasında bir yetişkin zebrafish seçin.
- Görmek için dikkatle izlerken, yaklaşık 5 dakika boyunca% 0.2 Tricaine pH 7.0 ile bir çanak içine koyarak balık Euthanize solungaçları ve kalp durma dayak.
- Bir kaşık kullanarak, küçük bir miktar çözüm Tricaine banyo balık kaldırmak çözüm süzün ve yavaşça bir kağıt havlu üzerine hayvan.
- Diseksiyon makas keskin bir çift solungaç operculum'un (Şekil 1, yolu A) hemen arkasında bir kesim yapma, hayvanın baş kaldırmak için kullanın. Biohazard bir çöp bidonuna kafa atın ve hemen hayvan PFA içeren diseksiyon tepsisine yerleştirin.
- Başlayarak baş ve kuyruk yüzgeci tabanı (Şekil 1, yol B) kuyruk sonlandırma, uzun ventral kesi yaparak, hayvanın vücut açmak için diseksiyon makas kullanın ve vücut sırasında kısmen sular altında tutmak prosedür.
- Bir çift diseksiyonu cımbız / forseps kullanarak hayvanın iç organları çıkarın ve biyolojik tehlikeli atık koyun. Bu böbrek yeri (Şekil 2) olarak, dorsal vücut duvarı fırça için dikkatli olun.
- Beden duvarları açık iğne, böbrek görüntülenmiştir böylece pimleri açısını diseksiyon iğneleri kullanın. Böbrek siyah Mutfak dekorasyonunun puf noktalari pigmentasyon (Şekil 2) ile serpiştirilmiş olan karakteristik bir şekli (baş, sırt, kuyruk) ve renk, sahip olacaktır. Ayrıca, periferik kan, organ yapısı orta hatta aşağı doğru akıyor dolu aort görebilirsiniz.
- 4 tepsiye yerleştirerek, bir gecede Fix örnek ° C zaman istenilen örneklerin düzenlenmesi ile yapılır.
- Ertesi gün, tepsiden çıkarın ve PFA çözümü 1x PBST ile değiştirin.
- Ince forseps dikkatle dorsal vücut duvarı, böbrek, böbrek, bunun altında yatan bağ doku organ ayrı olarak kaldırmak için forseps bir çift kullanarak ayırmak için kullanın. DMSO fiksatif çözüm böbrek dokusu mümkün, tek parça olarak tüm böbrek organ incelemek için, yumuşak ve esnek olacaktır.
- Geniş birbir mikrosantrifüj tüp içine böbrek yerleştirmek için delik transfer pipetlemeyin.
- Böbrek istenilen çalışmada in situ gen ekspresyon çalışmaları histolojik veya tamamen montaj yapmak için daha da işlenebilir .
3. Temsilcisi sonuçları:
Şekil 1'de diyagramlanabilmiştir adımlar diseksiyonu prosedürü göstermektedir. Şekil 2'de gösterildiği gibi böbrek, onun karakteristik şekil ve renklenme, hayvanın vücut boşluğunun dorsal duvarında anatomik konuma dayalı tespit edilebilir. Şekil 3'te görüldüğü gibi, in situ hibridizasyon sabit bir böbrek örnek, tüm montaj diseksiyonu sonra ilgi bir gen ifadesi lokalize etmek için kullanılabilir.
Şekil 1: Prosedür zebrafish yetişkin böbrek diseksiyon için doğrudan erişim sağlar. (A) araştırmacı tam böbrek organ kolay erişim vermek için ötenazi Zebra balığı (numaraları ve oklarla gösterilir), kademeli bir biçimde disseke edilir . Görüntüler önce karın boşluğuna (B) ve sonra (C), abdominal organların çıkarılması.
Şekil 2: Bir Sabitlenmemiş örnek zebrafish böbrek Görselleştirme takiben vücut boşluğunda organlarının çıkarılması, böbrek, bağ dokuları (A) ile dorsal vücut duvarına yapışık olduğu, tek bir düzleştirilmiş organı olarak görünür ve şematize edilmiştir (B), anatomik şekil göstermek için.
Şekil 3: Tüm montaj yerinde döllemeler tüm yetişkin böbrek organ yapılan. (B (A) cadherin17 transkript, (A ') olarak büyütülmüş, yetişkin böbrek nefron tübül tespit edilir (B) mafba transkript, (panelinde tüm tübül karşılaştırmak A) erişkin böbrek proksimal nefron hücre tipleri lokalizedir . ' ) transkript, özellikle kan filtresi (glomerulus) ve dolambaçlı proksimal tübül (PCT) podosit (P) hücrelerin lokalize mafba ifade genişlemiş bir görünüm ortaya koymaktadır.
Discussion
Yetişkin kök hücreleri, yetişkin vücut formu 1 sürdüren dinamik ve temel bileşenleridir . Yetişkin kök hücreleri hasara karşı vücudun hastalık durumlarında sırasında doğurur ve fonksiyon bozukluğu veya kaybı, yetişkin kök hücrelerin organ fonksiyonu azalmaya yol açabilir ve kanser maligniteler sürücü ve yaşlanma katkıda karıştığı edildiğini hizmet edebilir. Yetişkin kök hücreleri farklılaşmış hücre tipleri ayırt hücresel özellikleri sergilerler. Hücre bölünmesi üzerine, yetişkin kök hücreler, kendini yenileme ve progenitör hücrelerin farklı farklılaştırılmış yavrular da ortaya çıkmasına neden olabilir üretimi yeteneğine sahip. 1 doku homeostazı önemli roller nedeniyle hücre kaderinin kararları ve yetişkin kök hücreleri potens düzenleyen yollarının anlaşılmasında büyük ilgi var. Örneğin, birçok bilim adamı şu anda kendi niş çeşitli yetişkin kök hücre popülasyonlarının, ya da uzman mikroçevresinin ve bu niş humoral etkenler tarafından nasıl etkiledi korumak sinyalleri tespit etmeye.
Yetişkin hematopoietik kök hücreler (HKH'lerin) 8 hayvanların kan hücrelerinin sürekli gençleşme yakıt pluripotent hücreler. Hematopoez olgun farklılaştırılmış kan hücre tiplerinin kısa ömürlü ve dolayısıyla düzenli olarak doldurulan olmalıdır çünkü, omurgalı bir organizmanın hayatı boyunca sürekli olarak devam etmektedir canlı bir süreçtir. Bölmek gibi, kendini sürekli yenileyen ve eritroid megakaryositlerin, lenfoid ve myeloid soy doğuran atalarıdır seri üretiminde HKH'lerin, bu çok önemli bir arz talep. Bu kan hücre tiplerinin her biri, doku yaralanmaları kan damarlarının pıhtı oluşumu anlamına gelir, ya da işgalci patojenlere karşı savunma mekanizmaları tarafından sızdırmazlık için bir şekilde gaz alışverişi sağlamak da dahil olmak üzere, dolaşımda bulunan benzersiz fonksiyonları gerçekleştirir. HKH'lerin uzun yıllardır kabul edilmiş olsa da, bir bolluk, bu inanılmaz hücreler hakkında ilginç sorular cevapsız kalmaktadır. Son çalışmalar, farklı uzun vadeli kendini yenileme özellikleri ve niş parçaları ve HSC davranış 8 modüle sinyaller aydınlatılması HKH'lerin alt sınıfları belirledik . Zebra balığı, bu hayvan modelinde 8, genetik ve moleküler özellikleri hakkında göre, hematopoez araştırma paradigmaların taşları arasında . Araştırma kullanan Zebra balığı, kara memelileri gibi yüksek omurgalılar ile konserve balık kan tetkikleri 8 biyomedikal önemi vurgulayan HSC biyoloji hakkında yeni bakış açıları yol açmıştır.
Tarihsel olarak, yetişkin kök hücrelerinin vücudun diğer organları tarafından korunur keşfetmek isteyen seferler için HKH'lerin hakkında bilgi yolunu açmıştır. Beyin, bağırsak, deri, ve iskelet kası farklı yapılar arasında değişen çok sayıda yetişkin kök hücre popülasyonlarının var takdir edilmektedir. Kök hücre alanındaki çabaların sürmesi, yetişkin kök hücreleri ve hatta diğer farklılaşmış hücre tipleri çeşitli ayarları gelişmiş potens gösterilecek nasıl tespit etmeye.
Böbrek ile ilgili olarak, böbrek kök hücreler 16 var olup olmadığını nefrolog arasında büyük bir tartışma yaşandı . Bağımsız bulgular böbrek hücreleri nüfusu rejeneratif potansiyeli değişen derecelerde sahip memeliler belgelenmiş, ama bu raporların uyumlu bir anlayış sağlanabilir henüz. İlginçtir ki, birçok balık türünün sağlam hasarlı nefron rejenerasyon yanı sıra yakıt, yetişkinlik 9 sırasında tamamen yeni bir nefron büyüyebilir hücrelerin sahip olduğu görüşünü desteklemek için güçlü bir kanıt yoktur. Son çalışmalar, erişkin böbrek kök hücrelerin moleküler işaretlerinden tespit zebrafish 10,11 ve bu sözde böbrek kök / progenitör hücrelerin (RPC) 11 kendi kendini yenileme potens gösterdi . Gelecek çalışmalar memelilerde analog böbrek hücreleri mevcut olup olmadığını tespit etmek için gerekli. Bununla birlikte, balık RPC düzenleyen hücresel ve moleküler mekanizmalar hakkında devam eden araştırmalar memeli böbrek rejeneratif kahramanlık nasıl teşvik edilebilir içgörü sağlayabilir. Bu çok RPC hakkında anlaşılabilir kalır ve zebrafish araştırmacı şimdi birçok araç bu ilginç soruları çözmek için uygulanabilir olduğu açıktır.
Bu protokolde, yetişkin zebrafish böbrek anatomik tanımlama ve diseksiyon yöntemi tarif. Alternatif adımlar diseksiyon makas kullanılarak ventral kesi ile karın boşluğuna açılması gibi böbrek, incelemek için kullanılabilir; ancak, karın duvarı açık tutturulmuş ve baş kaldırıldığında tüm böbrek erişimde en başarılı karşılaştı. Bu hücre tiplerinin izole etmek ve çalışmak isteyen hem kan ve böbrek araştırmacılar diseksiyon yöntemi birini kullanabilirsiniz. Belirtmek gerekir ki, yalıtma ve workin için tarif yöntemig zebrafish yetişkin böbrek ile kesinlikle bu organ diseksiyonu fizyolojisi ile yaşlanma arasında değişen konular hakkında soruşturmalar takip eden araştırmacılar için çalışmalarını kolaylaştıracak gibi, yetişkin kök hücre biyolojisi sorular takip etmek isteyen bilim adamları ile sınırlı değildir. Dahası, bu yöntem moleküler etiket ve daha sonra kan veya böbrek hücreleri wild tip veya genetik mutant zebrafish 11 ayrı alt popülasyonlar arındırmak ve eğitim amacıyla böyle transgenik gibi diğer teknolojileri ile birleştiğinde olabilir . Böyle ayrıntılı arıtma işlemleri, kök ve progenitör hücre tiplerinin ileri davranışlarını nasıl düzenlendiği hakkında bilgi edinmenin önemli arıyorsunuz nakli veya progenitör kültür gibi operasyonel testler esas teşkil gibi, bu hücrelerin potens ve kimlik tanımlanır. Hematopoetik progenitör kültür yöntemleri son gelişmeler için birçok çalışma yeni yollar açmak ve böbrek popülasyonları 17 kültür adapte olabilir. Zebra balığı kimyasal genetik HKH'lerin ve çeşitli bağlamlarda 18-20 böbrek atalarıdır modüle ve yukarıdaki hücre biyolojisi teknikleri ile birlikte test etmek için yararlı bir cadde olmaya devam edecektir yollarının belirlenmesinde başarılı olmuştur. Birlikte ele alındığında, bir dizi zebrafish modeli kullanılarak, hematoloji ve nefroloji alanlarında çığır açan katkıları olmuştur ve bu alanlarda araştırma devam önümüzdeki yıllarda ellerinde daha fazla dönüştürücü anlayışlar vaat ediyor.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
RAW Zon ve Davidson araştırma laboratuarları, kademeli olarak, son on yılda yetişkin zebrafish bu diseksiyon tekniği şekillendiren stratejiler geliştirmek için yardımcı olmak için onların sayısız katkılarından dolayı üyelerine teşekkür etmek istemektedir. Buna ek olarak, bizim Zebra balığı koloni için mükemmel devam eden hayvancılık bakım sağlamak için Notre Dame Zebra balığı Araştırma Merkezi personeli için şükranlarımızı ifade etmek istiyoruz. RAW NIH-NIDDK hibe DK083512 araştırma fonu aldı ve University of Notre Dame cömert laboratuar start-up finansman.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5882 | |
| Dissection forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5010 | |
| Dissection angled forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5058 | |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 19210 |
References
- Stocum, D. L., Zupanc, G. K. Stretching the limits: stem cells in regeneration science. Dev. Dyn. 237, 3648-3671 (2008).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat. Rev. Genet. 8, 353-367 (2007).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullman, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of organs from the adult zebrafish. J Vis Exp. (37), (2010).
- Mione, M. C., Trede, N. S. The zebrafish as a model for cancer. Dis. Model Mech. 3, 517-523 (2010).
- Zon, L. I. Developmental biology of hematopoiesis. Blood. 86, 2876-2891 (1995).
- Davidson, A. J., Zon, L. I. The 'definitive' (and 'primitive') guide to zebrafish hematopoiesis. Oncogene. 23, 7233-7246 (2004).
- Orkin, S. H., Zon, L. I. Hematopoiesis: an evolving paradigm for stem cell biology. Cell. 132, 631-644 (2008).
- Reimschuessel, R. A fish model of renal regeneration and development. ILAR J. 42, 285-291 (2001).
- Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebrafish. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 299, F1040-F1047 (2010).
- Diep, C. Q., Ma, D., Holm, T., Naylor, R., Arora, N., Wingert, R., Bollig, F., Djordjevic, G., Lichman, B., Zhu, H. Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish. Nature. 470, 95-100 (2011).
- Traver, D., Paw, B. H., Poss, K. D., Penberthy, W. T., Lin, S., Zon, L. I. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nat. Immunol. 4, 1238-1246 (2003).
- Weber, G. J., Choe, S. E., Dooley, K. A., Paffett-Lugassy, N. N., Zhou, Y., Zon, L. I. Mutant-specific gene programs in the zebrafish. Blood. 106, 521-530 (2005).
- Sumanas, S., Jorniak, T., Lin, S. Identification of novel vascular endothelial-specific genes by the microarray analysis of the zebrafish cloche mutants. Blood. 106, 534-541 (2005).
- Burns, C. E., Traver, D., Mayhall, E., Shepard, J. L., Zon, L. I. Hematopoietic stem cell fate is established by the Notch-Runx pathway. Genes Dev. 19, 2331-2342 (2005).
- Little, M. H., Bertram, J. F. Is there such a thing as a renal stem cell. J. Am. Soc. Nephrol. 20, 2112-2117 (2009).
- Stachura, D. L., Reyes, J. R., Bartunek, P., Paw, B. H., Zon, L. I., Traver, D. Zebrafish kidney stromal cell lines support multilineage hematopoiesis. Blood. 114, 279-289 (2009).
- North, T. E., Goessling, W., Walkley, C. R., Lengerke, C., Kopani, K. R., Lord, A. M., Weber, G. J., Bowman, T. V., Jang, I. H., Grosser, T. Prostaglandin E2 regulates vertebrate haematopoietic stem cell homeostasis. Nature. 447, 1007-1011 (2007).
- Wingert, R. A., Selleck, R., Yu, J., Song, H. D., Chen, Z., Song, A., Zhou, Y., Thisse, B., Thisse, C., McMahon, A. P., Davidson, A. J. The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros. PLoS Genet. 3, 1922-1938 (2007).
- de Groh, E. D., Swanhart, L. M., Cosentino, C. C., Jackson, R. L., Dai, W., Kitchens, C. A., Day, B. W., Smithgall, T. E., Hukriede, N. A. Inhibition of histone deacetylase expands the renal progenitor cell population. J. Am. Soc. Nephrol. 21, 794-802 (2010).
