Summary
Partiellement isolé du cortex («dégagement») est un modèle animal l'efficacité de l'épileptogenèse post-traumatique. Ici, nous montrer comment faire un nouveau dispositif chirurgical et l'utiliser pour faire des lésions plus précise et plus cohérente pour générer ce modèle.
Abstract
Partiellement isolé du cortex («dégagement») est un modèle animal de l'épileptogenèse post-traumatique. La procédure chirurgicale consiste à couper à travers le cortex sensori-moteur et le dessous de la substance blanche (dessous) afin qu'une région spécifique du cortex cérébral est largement isolés du cortex voisins et régions sous-corticales 1-3. Après un temps de latence de deux semaines ou plus après la chirurgie, décharges épileptiformes peuvent être enregistrés dans des tranches de cerveau de rongeurs 1 et crises électriques ou de comportement peuvent être observés in vivo à partir d'autres espèces comme chat et le singe 4-6. Ce modèle animal bien établi est efficace pour générer et imite plusieurs caractéristiques importantes de lésions cérébrales traumatiques. Cependant, il est techniquement difficile de tenter de faire précise des lésions corticales du cerveau petit rongeur avec une main libre. Basé sur la procédure établie initialement au laboratoire du Dr David Prince à l'Université Stanford 1, ici nous présentons une technique améliorée pour effectuer une intervention chirurgicale pour la préparation de ce modèle chez la souris et les rats. Nous démontrons comment faire un simple dispositif chirurgical et l'utiliser pour acquérir une meilleure maîtrise de la profondeur de coupe et l'angle de générer des résultats plus précis et plus cohérents. L'appareil est facile à faire, et la procédure est rapide à apprendre. La génération de ce modèle animal fournit un système efficace pour l'étude sur les mécanismes de l'épileptogenèse post-traumatique.
Protocol
1. Faire un simple appareil pour la chirurgie de dégagement
- Le dispositif de dégagement nous avons créé est composé de trois parties (fig. 1): (1) une plaque de support en acier inoxydable ou en plastique qui permet la fixation d'un tube de guidage et d'une aiguille, et s'assoit en face de la fenêtre lors de la chirurgie crânienne, (2) un tube de guidage qui détient une aiguille dans la position et permet la rotation d'aiguilles, et (3) une aiguille qui est plié à 90 degrés à environ 3 mm de la pointe, et est mobile par rotation et d'insertion.
- Coupez un morceau de 1-1,5 mm d'épaisseur, 7 ~ 10 x 30 mm en acier inoxydable ou rectangulaire en plastique transparent (1) pour faire la plaque de support. Préparer un pouce 1.5 de calibre 22 (BD société, # 305156) et un pouce 1.5 de calibre 25 (BD société, # 305127) aiguille de la seringue. Pour faire un tube de guidage, couper le bout de plastique et la pointe inférieure aiguille de l'aiguille de la seringue de calibre 22 de sorte que sa longueur totale est d'environ 31 à 32 mm (2). Sable fin en métal pour le rendre plat et lisse. La longueur finale de ce tube de guidage devrait être d'environ 5-6 mm plus courte que l'aiguille de la seringue de calibre 25.
- Utilisez de la colle cyanoacrylate pour fixer le tube de guidage sur la plaque de support, en s'assurant que l'aiguille est perpendiculaire au bord du métal.
- Insérez l'aiguille de calibre 25 dans le tube de guidage, et pliez les 90 degrés l'aiguille de 2,5-3 mm de la pointe (fig. 1).
- Réglez la plage de déplacement vertical de l'aiguille en collant un petit tube en plastique sur l'extrémité de l'aiguille (fig. 1, arrêt de l'aiguille). La gamme de finale déplacement de l'aiguille qui détermine la profondeur de l'aiguille peut être insérée dans le cortex, et devrait être 1.6 à 1.8 mm pour P21 rats et 01.03 à 01.05 mm pour P21 souris. Cette longueur doit être ajusté pour les différentes espèces et l'âge des animaux.
- Attachez un fil de cuivre de petites ou un petit morceau de ruban adhésif sur l'extrémité supérieure de l'aiguille dans la même direction que le bout plié (Fig.1 indicateur à aiguille). Le fils ou des bandes indique l'angle de braquage de l'aiguille lors de la chirurgie inférieurs (Fig. 1).
2. La préparation des animaux
- Tous les instruments chirurgicaux doivent être autoclavés, stérilisés avec un stérilisateur perles de verre, ou désinfectée avec de l'éthanol à 70%.
- Nous utilisons des rats Sprague / Dawley à l'âge post-natal de 20 à 22 jours (P20-22) ou de souris CD1 au même âge. Différentes souches de souris ou de rats peut être utilisé pour des projets spécifiques.
- Anesthésier la souris avec une injection ip de la kétamine 80 mg / kg et de xylazine 8 mg / kg. La procédure chirurgicale commence après que l'animal ne répond pas à pincer la queue. Pendant la chirurgie, si nécessaire, une dose de rappel d'un tiers de la dose initiale du cocktail anesthésiant peut être donnée pour restaurer l'état original anesthésique.
- Couper les cheveux sur le cuir chevelu de l'animal avec une coupe de cheveux électriques. Appliquez une petite quantité de pommade ophtalmique sur les yeux de l'animal pour la protection de la sécheresse pendant l'anesthésie. Désinfecter le cuir chevelu avec un 10% de povidone iodée solution, suivi par 70% d'éthanol.
- Mont de l'animal sur un appareil stéréotaxique de garder la tête dans une position stable. Tout au long de la chirurgie, nous gardons l'animal sur un coussin chauffant pour prévenir l'hypothermie.
- Faites une ligne médiane antéro-postérieure incision sur le cuir chevelu à l'aide d'un scalpel, s'étendant de lambda pour entre les yeux. Utilisez hémostatiques de tirer la peau de côté et d'exposer le crâne laissé suffisamment.
- Faites une entaille rectangulaire sur le crâne de gauche, et utilisez le scalpel pour gratter le périoste. Cette étape permettra de réduire les saignements et faciliter le forage sur le crâne.
3. Faire des contre-dépouilles
- Ajoutez une petite quantité de solution saline stérile sur la zone du crâne exposé, et ensuite utiliser plusieurs Q-tips pour nettoyer le sang et sécher la zone.
- Sous un microscope chirurgical, commencer le forage d'une rainure rectangulaire (~ 5 x 7 mm chez le rat, 4 x 5 mm chez la souris) sur le centre du crâne à gauche (environ au-dessus du cortex sensorimoteur gauche). Appliquer une goutte de solution saline sur le crâne facilite le forage et la chaleur se dissipe. Après environ 2 / 3 la profondeur de l'os est percé, enlever l'excès salins et nettoyer la zone de forage avec un Q-tip. Lentement et sagement forer plus profond jusqu'à ce que la pièce centrale de l'os est mobile au toucher doux d'une pince.
- Retirez délicatement la pièce centrale de l'os en insérant une pointe acérée d'une pince sur le bord de l'os et lentement la pince de levage pour exposer l'hémisphère gauche.
- Sous le microscope chirurgical, tenez l'appareil contre-dépouilles, et d'orienter l'aiguille dans une direction parasagittale et la perpendiculaire à la plaque de support de la ligne médiane, inclinant l'appareil légèrement caudalement afin de maintenir la visualisation de la pointe de l'aiguille et la région cible corticale. Dirigez la pointe de l'aiguille d'une zone de 1-2 mm latéral à la suture sagittal supérieur, dans le milieu de la fenêtre crânienne, et d'éviter la pénétration directe des grands navires.
- Insérez l'aiguille dans une direction horizontale à travers la dure-mère et sous la pie de manière à épargner les vaisseaux sanguins. Asseyez-vous en bas de l'appareil inférieurssur les deux bords de la fenêtre crânienne afin que l'aiguille est placée perpendiculairement à la surface corticale (Fig. 1). Reposant l'appareil sur les bords de la fenêtre à la fois crânienne à la main permettra de réduire considérablement ou d'éliminer la poignée de main pendant la procédure suivante. Soulevez l'aiguille au-dessous du PIA, puis abaissez lentement pour créer une coupe transcorticale ce que l'aiguille ne peut pas aller plus loin. Rotation ~ 135 ° loin de la ligne médiane afin de créer un sujet en demi-cercle blanc / couche profonde VI dépouille. Puis levez l'aiguille de nouveau sous le pia. Inclinez l'appareil vers l'arrière et retirer l'aiguille.
- Optionnellement, on peut répéter la procédure ci-dessus (étape 2.5), mais sans tourner l'aiguille de manière à créer une coupure supplémentaire transcorticale sur les bords latéraux de la fenêtre. Cela va créer un isolement plus complet corticale.
- Placer un morceau de film plastique (6 x 6 mm) sur la fenêtre crânienne pour la protection et de suture au cuir chevelu. Placez l'animal sur un tapis chauffé jusqu'à ce que complètement récupéré de l'anesthésie.
4. Les résultats représentatifs:
Coronal tranches corticales peuvent être préparés pour confirmer le succès de la chirurgie dépouille. Dans les tranches préparées> 2 semaines après la chirurgie, les coupures transcorticale et de saper sont perceptibles dans l'objectif de faible puissance d'un microscope (fig. 2). Le cortex partiellement isolé devient généralement un peu plus mince, et l'activité épileptiforme peut être détecté dans la majorité des tranches de cortex avec enregistrement sur le terrain de potentiel (Fig. 3).
En revanche, la formation de grands trous dans la matière blanche ou dans les couches corticales profondes, dramatique amincissement du cortex lésé, ou une coupe errants dessus ou en dessous de la substance blanche du cerveau fera inutilisable pour d'autres expériences.
Figure 1. Structure et application d'un dispositif contre-dépouille. Un tube de guidage (2) est collé sur une plaque de support (1) qui est faite d'acier inoxydable ou en plastique transparent. Une aiguille de la seringue (3) est inséré à travers le tube de guidage et plié à environ 3 mm à la pointe. Une aiguille d'arrêt en tube de plastique est collée sur l'extrémité supérieure de l'aiguille de sorte que la gamme verticale mobile de l'aiguille est limité à ~ 1,2 mm et ~ 1,5 mm pour une utilisation dans P21 souris et des rats, respectivement. Un segment de fil de cuivre est fixé petits dessous de la poignée comme aiguille de l'indicateur pour l'orientation de l'aiguille tordue. Notez que l'appareil est incliné et en contact avec les deux bords de la fenêtre crânienne afin qu'une coupe peut être faite parallèlement à la surface piales.
Figure 2. Une image représentative de la tranche dépouille. A. image fluorescente d'une tranche qui a été préparé deux semaines après la lésion dépouille dans un rat P48. La blessure de coupe a été marqué par fluorescence DiI colorant. Les flèches blanches sur la droite indiquent coupé transcorticale, et les flèches en bas indiquent inférieurs qui sont passés si la frontière entre la couche IV et la matière blanche.
Figure 3. Enregistrement sur le terrain le potentiel d'une tranche d'enregistrement inférieurs potentiels. Champ d'une tranche de cerveau présentaient une activité épileptiforme inférieurs, suggérant une hyperexcitabilité du tissu lésé corticale.
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Discussion
Le modèle dégagement est un système très efficace pour étudier épileptogenèse post-traumatique. Une chirurgie typique prend seulement environ 20-30 minutes pour finir, et évoquée ou activité épileptiforme spontanée peut être enregistré dans les tranches de la plupart des animaux deux semaines après la chirurgie 1-2. Plus important encore, ce modèle imite les aspects des changements suite à une blessure traumatique du cerveau telles que saignements, inflammation, œdème, axotomie et la mort neuronale 7. Non seulement l'activité épileptiforme été observée chez les rongeurs et autres animaux, mais aussi des crises d'épilepsie ont été documentés chez les humains qui souffrent comparables lésions corticales 8. Des progrès significatifs ont été faits pour élucider les mécanismes sous-jacents de ces dernières années. Spontanée et évoquée décharges épileptiformes intercritiques ont été enregistrées dans des tranches de cerveau> 2 semaines après la lésion, et ces activités ont été trouvés à l'origine dans la couche corticale du rat V 1. Preuve de la réorganisation du circuit, la perte d'interneurones GABAergiques et la désinhibition, l'augmentation de l'excitabilité membranaire neuronal, et des augmentations de couplage synaptique excitatrice ont également été démontrée, en particulier dans la couche corticale V 2,9-13.
Ici, nous avons introduit un nouvel instrument pour faire lésions dépouille. Quand on effectue la chirurgie inférieurs avec une main libre, la main agitant fréquemment des causes des difficultés dans la prise stable et précise des lésions corticales. Bien que la pratique et l'expérience peut améliorer la qualité de la chirurgie, la variabilité importante dans la profondeur et la qualité des lésions existe. L'appareil que nous avons introduite ici est bénéfique dans trois aspects. Tout d'abord, en prenant appui sur les bords de la fenêtre crânienne, l'appareil élimine en grande partie le problème de la main tremblante pendant la chirurgie, ce qui rend possible de faire une coupe en douceur à travers les tissus du cerveau délicat. Deuxièmement, la profondeur de l'insertion de l'aiguille et le degré de rotation peut être soigneusement contrôlée, qui permet de couper plus de précision et de manière cohérente dans la substance blanche sous la couche VI. Troisièmement, la surface de l'hémisphère cortical est courbé: avec la médiane étant plus élevée que la face latérale (fig. 1), qui peut causer manque la question ciblée blanche si l'angle de l'aiguille n'est pas ajusté en conséquence. En reposant l'appareil sur la fenêtre crânienne, l'aiguille est incliné latéralement, et l'angle de coupe est automatiquement ajustée de sorte que la rotation de l'aiguille est toujours parallèle à la surface du cortex et une lésion précise est obtenue (Fig. 2). Un problème potentiel avec l'utilisation de ce dispositif est qu'il peut interférer avec la visualisation directe de l'aiguille sous le microscope. Ce problème peut être résolu en inclinant légèrement l'appareil vers la direction caudale lors de la pénétration de la pie-mère et le cortex. Dès que l'aiguille est abaissée à la substance blanche, l'appareil doit être ajusté pour devenir verticales à la surface corticale, et reposait sur le crâne. A ce point, en regardant l'indicateur de l'aiguille est suffisante pour contrôler la rotation de l'aiguille. En résumé, avec ces nombreux avantages, et sa relative facilité de construction, le modèle inférieurs deviendra plus accessible et utile pour l'étude de l'épileptogenèse post-traumatique.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par le NIH / NINDS NS octroi 4R00 057940, et accorder SCBI 200-12 de la moelle épinière et de financer des recherches sur le cerveau des blessures de l'Indiana State Department de la Santé.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Foredom micromotor kit | equipment | Foredom | K.1070 | |
| 1.5 inch 22-gauge syringe needle | material | BD Biosciences | 305156 | |
| 1.5 inch 25-gauge syringe needle | material | BD Biosciences | 305127 | |
| Cyanoacrylate glue | material | Ted Pella, Inc. | 14450 |
References
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