Summary
Teilweise isoliert Cortex ("unterboten") ist ein effizientes Tiermodell der posttraumatischen Epileptogenese. Hier zeigen wir, wie eine neuartige chirurgische Gerät zu machen und es verwenden, um genauere und konsistente Läsionen zu machen, um dieses Modell zu generieren.
Abstract
Teilweise isoliert Cortex ("unterboten") ist ein Tiermodell für posttraumatische Epileptogenese. Der chirurgische Eingriff beinhaltet das Schneiden durch die sensomotorischen Kortex und der unter der weißen Substanz (Hinterschnitt), so dass eine bestimmte Region der Großhirnrinde weitgehend aus dem benachbarten Kortex und subkortikale Regionen 1-3 isoliert. Nach einer Latenzzeit von zwei oder mehr Wochen nach der Operation können epileptiforme Entladungen in Hirnschnitten von Nagetieren 1 aufgezeichnet werden, und elektrische oder Verhalten Anfälle können in vivo aus anderen Arten wie Katze und Affe 4-6 beobachtet werden. Dieses etablierte Tiermodell ist effizient zu erzeugen und imitiert mehrere wichtige Merkmale von Schädel-Hirn-Verletzungen. Allerdings ist es technisch anspruchsvollen Versuch, präzise kortikalen Läsionen in der kleinen Nager Gehirn mit einer freien Hand zu machen. Basierend auf dem Verfahren zunächst in Dr. David Prince Labor an der Stanford University 1 festgestellt, hier präsentieren wir eine verbesserte Technik, um eine Operation für die Vorbereitung dieses Modell bei Mäusen und Ratten durchgeführt. Wir zeigen, wie man einen einfachen chirurgischen Gerät zu machen und es verwenden, um eine bessere Kontrolle der Schnitttiefe und der Winkel, um genauere und reproduzierbare Ergebnisse erzeugen zu gewinnen. Das Gerät ist einfach zu machen, und das Verfahren ist schnell zu erlernen. Die Erzeugung dieses Tiermodell bietet ein effizientes System zur Studie über die Mechanismen der posttraumatischen Epileptogenese.
Protocol
1. Eine einfache Vorrichtung für unterboten Chirurgie
- Der Hinterschnitt Gerät, das wir geschaffen besteht aus drei Teilen (Abb. 1): (1) eine Trägerplatte aus Edelstahl oder Kunststoff, die Befestigung von einem Führungsrohr und einer Nadel ermöglicht, und sitzt auf den kranialen Fenster während der Operation gemacht, (2) einem Führungsrohr, dass eine Nadel in Position hält und erlaubt Zeigerumdrehung; und (3) eine Nadel, die 90 Grad bei ~ 3 mm von der Spitze gebogen ist, und ist beweglich durch Rotation und Einfügen.
- Schneiden Sie ein Stück von 1-1,5 mm dick, 7 ~ 10 x 30 mm rechteckig aus Edelstahl oder transparentem Kunststoff (1) auf die Trägerplatte zu machen. Bereiten Sie eine 1,5-Zoll-22-Gauge-(BD Unternehmen, # 305156) und ein 1,5-Zoll-25-Gauge-(BD Unternehmen, # 305127) Spritzennadel. Um ein Führungsrohr, schneiden Sie die Kunststoff-Ende und der unteren Nadel Spitze des 22-Gauge-Kanüle, so dass ihre Gesamtlänge ca. 31-32 mm (2) ist. Sand das Metall Ende zu machen, flach und glatt. Die endgültige Länge dieses Führungsrohr sollte ca. 5-6 mm kürzer als die 25-Gauge-Kanüle werden.
- Verwenden Sie Sekundenkleber auf dem Führungsrohr auf die Trägerplatte zu beheben, um sicherzustellen, dass die Nadel senkrecht auf die Kante des Metalls.
- Legen Sie die 25-Gauge-Kanüle in die Führungsrohr, und biegen Sie die Nadel um 90 Grad 2,5-3 mm von der Spitze (Abb. 1).
- Stellen Sie die vertikale Schwenkbereich der Nadel durch Aufkleben eines kleinen Plastikschlauch auf die bis Ende der Nadel (Abb. 1, Nadel-Stop). Die endgültige Bewegungsbereich der Nadel bestimmt, wie tief die Nadel in die Rinde eingesetzt werden kann, und sollte 1,6-1,8 mm für P21 Ratten und 1,3-1,5 mm für P21 Mäusen werden. Diese Länge muss für verschiedene Arten und Alter der Tiere angepasst werden.
- Bringen Sie einen kleinen Kupferdraht oder ein kleines Stück Klebeband auf das obere Ende der Nadel in die gleiche Richtung wie die gebogenen Spitze (Abb. 1 Nadel-Anzeige). Der Draht oder Band zeigt den Drehwinkel der Nadel während der Operation unterschritten (Abb. 1).
2. Tierische Vorbereitung
- Alle chirurgischen Instrumente müssen autoklaviert, sterilisiert werden mit einem Glas-Bead-Sterilisator oder desinfiziert mit 70% Ethanol.
- Wir verwenden Sprague / Dawley Ratten bei postnatalen Alter von 20 bis 22 Tage (P20-22) oder CD1-Mäusen im gleichen Alter. Verschiedene Stämme von Mäusen oder Ratten können für bestimmte Projekte eingesetzt werden.
- Anesthetize der Maus mit einer ip Injektion von Ketamin 80 mg / kg und Xylazin 8 mg / kg. Der chirurgische Eingriff beginnt nach dem Tier nicht bis zum Schwanz kneifen reagieren. Während der Operation, wenn nötig, eine Auffrischimpfung mit einem Drittel der ursprünglichen Dosis des Anästhetikums Cocktail gegeben, um den ursprünglichen Zustand wiederherzustellen Betäubung werden.
- Schneiden Sie die Haare auf der Kopfhaut des Tieres mit einem elektrischen Haarschneider. Eine kleine Menge von Augensalbe auf die Augen des Tieres für den Schutz vor Trockenheit während der Narkose. Desinfizieren Sie die Kopfhaut mit einer 10% PVP-Jod-Lösung, die von 70% Ethanol gefolgt.
- Montieren Sie das Tier auf einem stereotaktischen Apparat auf den Kopf in einer stabilen festen Position zu halten. Während der Operation, halten wir das Tier auf einem Heizkissen, um eine Unterkühlung zu verhindern.
- Machen Sie eine Mittellinie anterior-posteriore Inzision auf der Kopfhaut mit einem Skalpell, die sich von lambda, um zwischen den Augen. Verwenden Sie Hämostatika auf die Haut beiseite ziehen und setzen den linken Schädel ausreichend.
- Machen Sie einen rechteckigen Ausschnitt auf der linken Schädel, und verwenden Sie das Skalpell abkratzen Periost. Dieser Schritt reduziert Blutung und erleichtern die Bohrungen auf dem Schädel.
3. Machen Hinterschneidungen
- Fügen Sie eine kleine Menge von steriler Kochsalzlösung auf der exponierten Schädel-Bereich, und verwenden Sie dann mehrere Q-Tipps, die das Blut reinigen und trocknen Sie den Bereich.
- Unter einem Operationsmikroskop, Anbohren einer rechteckigen Nut (~ 5 x 7 mm bei Ratten, 4 x 5 mm in Mäusen) auf die Mitte des linken Schädel (etwa oberhalb der linken sensomotorischen Kortex). Anwenden eines Tropfen Kochsalzlösung auf dem Schädel erleichtert Bohr-und Wärmeableitung. Nach ca. 2 / 3 Tiefe der Knochen gebohrt, entfernen überschüssige Kochsalzlösung und reinigen Sie die Bohrungen mit einem Q-Tip. Langsam und vorsichtig tiefer bohren, bis das Mittelstück des Knochens ist beweglich auf sanfte Berührung einer Pinzette.
- Entfernen Sie vorsichtig das zentrale Stück des Knochens durch das Einfügen einer scharfen Spitze einer Pinzette auf die Kante des Knochens und langsam heben die Zange auf die linke Hemisphäre aussetzen.
- Unter dem Operationsmikroskop, halten die Hinterschneidung Gerät, und richten Sie die Nadel im parasagittal Richtung und die Trägerplatte senkrecht zur Mittellinie, Kippen des Gerätes leicht nach kaudal, so dass die Visualisierung der Nadelspitze und Ziel kortikalen Bereich aufrecht zu erhalten. Richten Sie die Spitze der Nadel in einen Bereich von 1-2 mm lateral der überlegenen Pfeilnaht, in der Mitte des kranialen Fenster, und vermeiden Sie direkte Eindringen von großen Schiffen.
- Führen Sie die Nadel in horizontaler Richtung durch die Dura und unter der Pia, so dass die Blutgefäße zu schonen. Sit der Unterseite des Gerätes unterschrittenauf den beiden Rändern des kranialen Fenster, so dass die Nadel positioniert ist normal, dass die kortikale Oberfläche (Abb. 1). Halten Sie das Gerät auf den beiden Rändern des kranialen Fenster von Hand erheblich reduzieren oder zu eliminieren Hand schüttelte während des folgenden Verfahrens. Heben Sie die Nadel unter die pia anschließend langsam wieder an einen transkortikalen Schnitt erstellen, bis die Nadel nicht gehen kann tiefer. Drehen ~ 135 ° von der Mittellinie entfernt, um einen Halbkreis weißen Substanz / tiefe Schicht VI unterboten zu schaffen. Dann heben Sie die Nadel wieder unter der Pia. Kippen Sie das Gerät zurück und ziehen Sie die Nadel.
- Optional kann man den obigen Vorgang wiederholen (Schritt 2,5), aber ohne Drehen der Nadel so als zusätzliche transkortikalen Schnitt an den seitlichen Rändern des Fensters zu schaffen. Dadurch wird eine vollständigere kortikalen Isolation.
- Legen Sie ein Stück Plastikfolie (6 x 6 mm) auf den kranialen Fenster für den Schutz und Naht der Kopfhaut. Legen Sie das Tier auf einem Heizkissen, bis sie vollständig aus der Narkose erholt.
4. Repräsentative Ergebnisse:
Koronare kortikalen Scheiben herstellen, um den Erfolg der Hinterschneidung Operation zu bestätigen. In Scheiben> 2 Wochen nach der Operation vorbereitet werden transkortikalen und unterboten Schnitte unter Low-Power-Objektiv eines Mikroskops (Abb. 2) erkennbar. Die teilweise isoliert Kortex der Regel wird etwas dünner, und epileptiforme Aktivität kann in der Mehrzahl der kortikalen Scheiben mit Feldpotential Aufnahme (Abb. 3) nachgewiesen werden.
Im Gegensatz, die Bildung von großen Löchern in der weißen Substanz oder in tiefen kortikalen Schichten, dramatischen Ausdünnung des lädierten Kortex oder eine fehlgeleitete Schnitt oberhalb oder unterhalb der weißen Substanz wird das Gehirn unbrauchbar für weitere Experimente.
Abbildung 1. Aufbau und Anwendung einer Hinterschneidung Gerät. Ein Führungsrohr (2) wird auf eine Trägerplatte (1), die aus Edelstahl oder transparentem Kunststoff geklebt ist. Eine Kanüle (3) wird durch das Führungsrohr und bog bei ~ 3 mm an der Spitze eingesetzt. Ein Nadelstopp aus Kunststoff Rohr ist auf das obere Ende der Nadel, so dass die vertikalen Bewegungsbereich der Nadel ~ 1,2 mm und ~ 1,5 mm für den Einsatz in P21 Mäusen und Ratten ist jeweils begrenzt geklebt. Ein Segment der kleinen Kupferdraht ist unter dem Griff als Nadel Indikator für die Ausrichtung der gebogenen Nadel befestigt. Beachten Sie, dass das Gerät gekippt wird und in Kontakt mit den beiden Rand des kranialen Fenster, so dass ein Schnitt gemacht parallel zur pialen Oberfläche.
Abbildung 2. Ein repräsentatives Bild unterbieten Scheibe. A. Fluoreszenzbild von einer Scheibe, die zwei Wochen vorbereitet, nachdem unterboten Läsion in einer P48 Ratte wurde. Das Schneiden Wunde wurde mit Fluoreszenzfarbstoff DiI markiert. Die weißen Pfeile auf der rechten Seite zeigen transkortikalen geschnitten, und die Pfeile auf dem Boden zeigen, unterboten, dass, obwohl die Grenze zwischen der Schicht IV und weiße Substanz bestanden.
Abbildung 3. Feldpotential Aufnahme von einer Hinterschneidung in Scheiben schneiden. Feldpotential Aufnahme von einer Hinterschneidung Hirnschnitt ausgestellt epileptiforme Aktivität, was darauf hindeutet Übererregbarkeit des verletzten kortikalen Gewebe.
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Discussion
Der Hinterschnitt-Modell ist ein hocheffizientes System zur Untersuchung von posttraumatischen Epileptogenese. Eine typische Operation dauert nur ca. 20-30 Minuten zu beenden, und evozierte oder spontane epileptiforme Aktivität kann in Scheiben von den meisten Tieren 2 Wochen nach der Operation 1-2 aufgenommen werden. Noch wichtiger ist, ahmt dieses Modell Aspekte der Veränderungen nach Schädel-Hirn-Verletzungen wie Blutungen, Entzündungen, Ödemen, Axotomie und neuronalen Tod 7.. Nicht nur, dass epileptiforme Aktivität bei Nagern und anderen Tieren beobachtet worden, sondern auch epileptische Anfälle bei Menschen, die vergleichbar kortikalen Läsionen leiden 8 wurden dokumentiert. Bedeutende Fortschritte wurden gemacht, um die zugrunde liegenden Mechanismen in den letzten Jahren verdeutlichen. Spontane und evozierte interiktale epileptiforme Entladungen in Hirnschnitten wurden> 2 Wochen nach der Verletzung aufgezeichnet, und diese Aktivitäten erwiesen sich bei Ratten Rindenschicht V 1 stammen. Der Nachweis der Schaltung Reorganisation, Verlust von GABAergen Interneuronen und Enthemmung, steigt in der neuronalen Erregbarkeit Membran und erhöht in exzitatorischen synaptischen Kopplung haben auch gezeigt, vor allem in kortikalen Schicht V 2,9-13.
Hier führten wir ein neuartiges Instrument für die Herstellung unterboten Läsionen. Wenn eine Hinterschneidung Operation mit einer freien Hand führt, bewirkt die Hand schütteln häufig Schwierigkeiten, stabile und präzise kortikale Läsionen. Obwohl die Praxis und Erfahrung die Qualität der Chirurgie verbessern kann, gibt es erhebliche Unterschiede in der Tiefe und Qualität der Läsionen. Das Gerät haben wir hier eingeführt wird, von Vorteil in drei Aspekten. Erstens, indem ruhen auf den Kanten des kranialen Fenster, das Gerät weitgehend beseitigt das Problem der Hand schüttelte während der Operation, wodurch es möglich ist, um einen glatten Schnitt durch den zarten Hirngewebe zu machen. Zweitens kann die Tiefe der Nadel und der Grad der Drehung sorgfältig kontrolliert werden, was es möglich macht, genauer und konsequent geschnitten in der weißen Substanz unterhalb Schicht VI. Drittens ist die Oberfläche des kortikalen Hemisphäre gebogen: mit der medialen höher ist als der lateralen Seite (Abb. 1), die dazu führen fehlende gezielte weißen Substanz kann, wenn der Winkel der Nadel nicht angepasst wird. Durch Ruhe das Gerät auf dem Schädel-Fenster, wird die Nadel seitlich gekippt und den Schnittwinkel wird automatisch angepasst, so dass die Drehung der Nadel ist immer parallel zur Oberfläche des Kortex und präzise Läsion erreicht ist (Abb. 2). Ein mögliches Problem bei der Verwendung dieses Gerätes ist, dass es mit direkter Visualisierung der Nadel unter dem Mikroskop stören. Dieses Problem kann durch leichtes Kippen des Gerätes nach kaudal gelöst werden beim Durchdringen der Pia und der Hirnrinde. Sobald die Nadel an der weißen Substanz gesenkt wird, muss das Gerät angepasst werden senkrecht zur kortikalen Oberfläche, und ruhte am Schädel. An dieser Stelle mit Blick auf die Nadel-Indikator ist ausreichend, um Zeigerumdrehung überwachen. Zusammenfassend mit diesen viele Vorteile und seine relative Einfachheit der Konstruktion, wird die Hinterschneidung Modell leichter zugänglich geworden und nützlich für die Untersuchung von posttraumatischen Epileptogenese.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde vom NIH / NINDS gewähren 4R00 NS 057940, und gewähren SCBI 200-12 aus dem Rückenmark und Hirn-Trauma Forschung Fonds aus der Indiana State Department of Health unterstützt.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Foredom micromotor kit | equipment | Foredom | K.1070 | |
| 1.5 inch 22-gauge syringe needle | material | BD Biosciences | 305156 | |
| 1.5 inch 25-gauge syringe needle | material | BD Biosciences | 305127 | |
| Cyanoacrylate glue | material | Ted Pella, Inc. | 14450 |
References
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