Preparazione del modello di sottosquadro epilettogenesi Post-Traumatico in roditori

Summary

Parzialmente isolato corteccia ("sottosquadro") è un modello animale efficiente epilettogenesi post-traumatico. Qui mostriamo come fare un nuovo dispositivo chirurgico e usarlo per fare le lesioni più precisi e concordanti per generare questo modello.

Abstract

Parzialmente isolato corteccia ("sottosquadro") è un modello animale di epilettogenesi post-traumatico. La procedura chirurgica coinvolge tagliare attraverso la corteccia sensomotoria e sotto la materia bianca (sottosquadro) in modo che una specifica regione della corteccia cerebrale è in gran parte isolato dalla corteccia e le regioni confinanti subcorticali ^1-3. Dopo una latenza di due o più settimane dopo l'intervento, scariche epilettiformi possono essere registrate in fettine di cervello di roditori ^1; e convulsioni elettriche o comportamento si può osservare in vivo da altre specie come il gatto e la scimmia ^4-6. Questo modello animale ben consolidata è efficiente per generare e imita molte caratteristiche importanti traumi cerebrali. Tuttavia, è tecnicamente difficile tentativo di rendere precise lesioni corticali del cervello piccolo roditore con una mano libera. Sulla base della procedura stabilita inizialmente nel laboratorio del Dr. David Principe presso l'Università di Stanford ^1, qui vi presentiamo una tecnica migliore per eseguire un intervento chirurgico per la preparazione di questo modello in topi e ratti. Dimostriamo come fare un semplice dispositivo chirurgico e usarla per ottenere un miglior controllo della profondità di taglio e l'angolo per generare risultati più precisi e coerenti. Il dispositivo è facile da fare, e la procedura è veloce da imparare. La generazione di questo modello animale fornisce un efficiente sistema per lo studio sui meccanismi di epilettogenesi post-traumatico.

Protocol

1. Fare un semplice dispositivo per la chirurgia sottosquadro

1. Il dispositivo sottosquadro abbiamo creato si compone di tre parti (Fig. 1): (1) una piastra di supporto in acciaio inox o in plastica che consente l'attaccamento di un tubo di guida e un ago, e si siede sulla finestra cranico durante l'intervento chirurgico, (2) un tubo di guida che contiene un ago in posizione e permette la rotazione dell'ago, e (3) un ago che viene piegato a 90 gradi ~ 3 mm dalla punta, ed è mobile con rotazione e di inserimento.
2. Tagliare un pezzo di 1-1,5 mm di spessore, 7 ~ 10 x 30 mm in acciaio inox o rettangolare di plastica trasparente (1) di fare la piastra di sostegno. Preparare un 1,5 pollici da 22 gauge (BD società, # 305156) e un 1,5 pollici da 25 gauge (BD società, # 305127) ago della siringa. Per fare un tubo di guida, tagliare l'estremità in plastica e la punta dell'ago inferiore del 22-ago da siringa in modo che la sua lunghezza totale è di circa 31-32 mm (2). Sabbia fine di metallo per renderla piatta e liscia. La lunghezza finale di questo tubo guida dovrebbe essere di circa 5-6 mm più corto del 25-gauge siringa.
3. Utilizzare colla cianoacrilato per fissare il tubo guiding sulla piastra di supporto, facendo in modo che l'ago sia perpendicolare al bordo del metallo.
4. Inserire l'ago calibro 25 siringa nel tubo di guida, e piegare l'ago a 90 gradi a 2,5-3 mm dalla punta (Fig. 1).
5. Regolare la portata verticale movimento dell'ago incollando un tubo di plastica piccolo sul finire dell'ago (fig. 1, fermata ago). La gamma di finale in movimento dell'ago determina la profondità l'ago può essere inserito nella corteccia, e dovrebbe essere 1,6-1,8 mm per P21 ratti e 1,3-1,5 mm per P21 topi. Questa lunghezza deve essere adattata per le varie specie ed età degli animali.
6. Collegare un filo sottile di rame o un piccolo pezzo di nastro sulla parte superiore dell'ago nella stessa direzione, come la punta piegata (Fig.1 indicatore ad ago). Il filo o nastro indica l'angolo di rotazione dell'ago durante l'intervento chirurgico sottosquadri (fig. 1).

2. Preparazione degli animali

1. Tutti gli strumenti chirurgici devono essere sterilizzati in autoclave, sterilizzati con una perlina di vetro sterilizzatore, o disinfettata con etanolo al 70%.
2. Noi usiamo Sprague / Dawley all'età postnatale 20-22 giorni (P20-22) o topi CD1 alla stessa età. Diversi ceppi di topi o ratti possono essere utilizzati per progetti specifici.
3. Anestetizzare il mouse con una iniezione ip di ketamina 80 mg / kg e xilazina 8 mg / kg. La procedura chirurgica inizia dopo che l'animale non risponde alla pizzico coda. Durante l'intervento, se necessario, una dose di richiamo di un terzo la dose originale del cocktail anestetico può essere somministrato a ripristinare lo stato originale anestetico.
4. Tagliare i capelli sul cuoio capelluto dell'animale con un trimmer capelli elettrici. Applicare una piccola quantità di pomata oftalmica sul occhi dell'animale per la protezione da secchezza durante l'anestesia. Disinfettare il cuoio capelluto con un 10% di povidone-iodio soluzione, seguita dal 70% di etanolo.
5. Montare l'animale su un apparato stereotassico per mantenere la testa in una posizione stabile fisso. In tutto l'intervento, teniamo l'animale su una piastra elettrica per prevenire l'ipotermia.
6. Effettuare una linea mediana anteriore-posteriore incisione sul cuoio capelluto con un bisturi, che si estende da lambda per mezzo agli occhi. Usa hemostats per tirare la pelle da parte ed esporre il cranio sinistra a sufficienza.
7. Fare un taglio rettangolare sul cranio a sinistra, e usare il bisturi per togliere periostio. Questo passo sarà ridurre il sanguinamento e facilitare la foratura sul cranio.

3. Fare sottosquadri

1. Aggiungere una piccola quantità di soluzione salina sterile al cranio zona esposta, quindi utilizzare alcuni dei cotton fioc per pulire il sangue e asciugare la zona.
2. Sotto un microscopio operatorio, cominciare ad esercitarsi una scanalatura rettangolare (~ 5 x 7 mm in ratti, 4 x 5 mm nei topi) sul centro del cranio a sinistra (circa al di sopra della sinistra sensomotorio corteccia). Applicando una goccia di soluzione salina sul cranio facilita la foratura e dissipa il calore. Dopo circa 2 / 3 di profondità l'osso si è esercitato, rimuovere salina in eccesso e pulire la zona di foratura con un Q-tip. Lentamente e con attenzione foratura profonda fino a quando il pezzo centrale di osso è mobile su tocco gentile di una pinza.
3. Rimuovere con attenzione il pezzo centrale di osso inserendo una punta acuminata di una pinza sul bordo dell'osso e lentamente sollevando il forcipe per esporre l'emisfero sinistro.
4. Sotto il microscopio operatorio, tenere il dispositivo sottosquadro, e orientare l'ago in senso perpendicolare parasagittale e la piastra di supporto alla linea mediana, inclinando il dispositivo leggermente caudalmente in modo da mantenere la visualizzazione della punta dell'ago e della regione bersaglio corticale. Puntare la punta dell'ago ad una zona 1-2 millimetri laterale alla sutura sagittale superiore, al centro della finestra del cranio, ed evitare la penetrazione diretta dei grossi vasi.
5. Inserire l'ago in senso orizzontale attraverso la dura e sotto la pia in modo da risparmiare i vasi sanguigni. Sedersi nella parte inferiore del dispositivo sottosquadrosu entrambi i bordi della finestra del cranio in modo che l'ago è in posizione normale alla superficie corticale (Fig. 1). A riposo il dispositivo su entrambi i bordi della finestra del cranio a mano in modo significativo ridurre o eliminare stretta di mano durante la seguente procedura. Sollevare l'ago al di sotto della pia, quindi abbassare lentamente per creare un taglio transcorticale che l'ago non può andare più in profondità. Ruotare ~ 135 ° di distanza dalla linea mediana per creare un semicerchio della sostanza bianca / strato profondo VI sottosquadro. Poi sollevare l'ago di nuovo per sotto la pia. Inclinare il dispositivo indietro e ritirare l'ago.
6. Opzionalmente, si può ripetere la procedura (passo 2,5), ma senza girare l'ago in modo da creare un taglio ulteriore transcorticale ai bordi laterali della finestra. Questo creerà un isolamento più completo corticale.
7. Posizionare un pezzo di pellicola di plastica (6 x 6 mm) sulla finestra del cranio per la protezione e sutura al cuoio capelluto. Mettere l'animale su un blocco riscaldato fino alla completa guarigione dall'anestesia.

4. Rappresentante dei risultati:

Coronale fette corticale può essere pronti a confermare il successo della chirurgia sottosquadro. A fette preparato> 2 settimane dopo l'intervento, tagli transcorticale e minano sono discernibili nell'ambito dell'obiettivo di bassa potenza di un microscopio (Fig. 2). La corteccia parzialmente isolata di solito diventa leggermente più sottile, e l'attività epilettiformi possono essere rilevati nella maggior parte dei fettine corticali con registrazione campo potenziale (Fig. 3).

Al contrario, la formazione di grandi buchi nella materia bianca o in profondità strati corticali, drammatico assottigliamento della corteccia lesione, o un taglio errante essere al di sopra o al di sotto della sostanza bianca del cervello renderà inutilizzabile per ulteriori esperimenti.

Figura 1. Struttura e applicazione di un dispositivo di sottosquadro. Un tubo di guida (2) è incollato su una piastra di supporto (1) che è in acciaio inox o in plastica trasparente. Un ago della siringa (3) viene inserito attraverso il tubo di guida e piegate a ~ 3 mm a punta. Un ago sosta in tubo di plastica è incollato sulla parte superiore dell'ago in modo che l'intervallo verticale movimento dell'ago è limitata a ~ ~ 1,2 mm e 1,5 mm per l'utilizzo in P21 topi e ratti, rispettivamente. Un segmento di filo di rame è fissato sotto l'impugnatura, come l'ago indicatore per l'orientamento dell'ago piegato. Si noti che il dispositivo è inclinato e in contatto con entrambi i bordi della finestra del cranio in modo che un taglio può essere fatto in parallelo alla superficie piale.

Figura 2. Un'immagine rappresentante della fetta sottosquadro. A. immagine fluorescente di una fetta che è stato preparato due settimane dopo la lesione sottosquadro in un topo P48. La ferita da taglio è stato etichettato da DII colorante fluorescente. Le frecce bianche sulla destra indicano taglio transcorticale, e le frecce in basso indicano sottosquadro che passava anche se il confine tra strato IV e della sostanza bianca.

Figura 3. Registrazione di un campo potenziale fetta sottosquadro. Campo di registrazione da una fetta di potenziali cerebrali sottosquadro esposti attività epilettiformi, suggerendo ipereccitabilità del tessuto danneggiato corticale.

Discussion

Il modello sottosquadro è un sistema altamente efficiente per lo studio dell'epilessia post-traumatico. Un intervento chirurgico tipica richiede solo circa 20-30 minuti per finire, ed evocato o attività epilettiformi spontanee possono essere registrati in fette dalla maggior parte dei animali due settimane dopo l'intervento ^1-2. Ancora più importante, questo modello imita aspetti delle seguenti modifiche lesioni cerebrali traumatiche come sanguinamento, infiammazione, edema, assotomia e la morte neuronale ^7. Non solo è l'attività epilettiformi stata osservata nei roditori e altri animali, ma anche crisi epilettiche sono stati documentati negli esseri umani che soffrono paragonabile lesioni corticali ^8. Notevoli progressi sono stati fatti per chiarire i meccanismi alla base negli ultimi anni. Scariche interictale spontanea ed evocata epilettiformi sono stati registrati in fettine di cervello> 2 settimane dopo la lesione, e queste attività sono risultate provenire strato corticale ratto V ^1. La prova di riorganizzazione circuito, perdita di interneuroni GABAergici e disinibizione, aumento della eccitabilità della membrana neuronale, e gli aumenti di accoppiamento sinaptica eccitatoria hanno anche dimostrato, in particolare in strato corticale V ^2,9-13.

Qui abbiamo introdotto un nuovo strumento per fare le lesioni sottosquadro. Quando si effettua la chirurgia sottosquadro con una mano libera, la mano tremante spesso causa difficoltà nel fare lesioni corticali stabile e precisa. Anche se la pratica e l'esperienza può migliorare la qualità della chirurgia, la variabilità significativa la profondità e la qualità delle lesioni esiste. Il dispositivo che abbiamo introdotto qui è utile in tre aspetti. In primo luogo, appoggiato sul bordo della finestra del cranio, il dispositivo elimina in gran parte il problema della mano tremante durante l'intervento, rendendo così possibile fare un taglio netto con il tessuto cerebrale delicato. In secondo luogo, la profondità di inserimento dell'ago e il grado di rotazione può essere attentamente controllata, che consente di tagliare con maggiore precisione e coerenza nella materia bianca sottostante strato VI. In terzo luogo, la superficie dell'emisfero corticale è curvo: con il mediale essere superiore alla parte laterale (Fig. 1), che può causare manca la materia bianca mirata se l'angolo di l'ago non è adeguato di conseguenza. Posizionando il dispositivo sulla finestra del cranio, l'ago viene inclinato lateralmente, e l'angolo di taglio viene regolata automaticamente in modo che la rotazione dell'ago è sempre parallela alla superficie della corteccia e lesione preciso si ottiene (Fig. 2). Un problema potenziale con l'utilizzo di questo dispositivo è che può interferire con la visualizzazione diretta dell'ago sotto il microscopio. Questo problema può essere risolto con un po 'inclinando il dispositivo verso la direzione caudale quando penetrare la piale e la corteccia. Non appena l'ago si abbassa alla materia bianca, il dispositivo ha bisogno di essere regolato per diventare verticale rispetto alla superficie corticale, e si riposò il cranio. A questo punto, guardando l'indicatore ago è sufficiente per monitorare la rotazione dell'ago. In sintesi, con questi numerosi vantaggi e la sua relativa facilità di costruzione, il modello sottosquadro diventerà più accessibile e utile per lo studio della epilettogenesi post-traumatico.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Foredom micromotor kit	equipment	Foredom	K.1070
1.5 inch 22-gauge syringe needle	material	BD Biosciences	305156
1.5 inch 25-gauge syringe needle	material	BD Biosciences	305127
Cyanoacrylate glue	material	Ted Pella, Inc.	14450