Preparando Modelo de rebaixo de epileptogênese Pós-Traumático em Roedores

Summary

Córtex parcialmente isolado ("minar") é um modelo animal eficiente de epileptogênese pós-traumático. Aqui demonstramos como fazer um novo dispositivo cirúrgico e usá-lo para fazer lesões mais precisas e consistentes para gerar este modelo.

Abstract

Córtex parcialmente isolado ("minar") é um modelo animal de epileptogênese pós-traumático. O procedimento cirúrgico envolve o corte através do córtex sensório-motor e por baixo da substância branca (minar) para que uma região específica do córtex cerebral é em grande parte isolado do córtex e regiões vizinhas subcortical ^1-3. Após uma latência de duas ou mais semanas após a cirurgia, descargas epileptiformes podem ser gravados em fatias de cérebro de roedores ^1; e convulsões elétricas ou comportamento pode ser observado in vivo a partir de outras espécies como gato e macaco ^4-6. Este modelo animal bem estabelecido é eficiente para gerar e imita diversas características importantes da lesão cerebral traumática. No entanto, é tecnicamente desafiador tentar fazer precisas lesões corticais no cérebro de pequenos roedores com uma mão livre. Com base no procedimento estabelecido inicialmente no laboratório do Dr. David Príncipe na Universidade Stanford ^1, aqui apresentamos uma técnica aprimorada para realizar uma cirurgia para a elaboração deste modelo em camundongos e ratos. Demonstramos como fazer um dispositivo cirúrgico simples e usá-lo para obter um melhor controle da profundidade de corte e ângulo de gerar resultados mais precisos e consistentes. O dispositivo é fácil de fazer, eo procedimento é rápido para aprender. A geração deste modelo animal fornece um sistema eficiente para o estudo sobre os mecanismos de epileptogênese pós-traumático.

Protocol

1. Fazendo um dispositivo simples para a cirurgia undercut

1. O dispositivo undercut criamos consiste em três partes (Fig. 1): (1) uma placa de suporte de aço inoxidável ou de plástico que permite a conexão de um tubo guia e uma agulha, e se senta do outro lado da janela craniana durante a cirurgia (2); um tubo de guia que contém uma agulha em posição e permite a rotação da agulha, e (3) uma agulha que é dobrado 90 graus em ~ 3 mm da ponta, e é móvel por rotação e de inserção.
2. Corte um pedaço de 1-1,5 mm de espessura, 7 ~ 10 x 30 mm de aço inoxidável ou retangular de plástico transparente (1) para fazer a placa de suporte. Prepare um de 1,5 polegadas calibre 22 (BD empresa, # 305156) e um de 1,5 polegadas de calibre 25 (BD empresa, # 305127) agulha da seringa. Para fazer um tubo-guia, corte a extremidade de plástico e na ponta inferior da agulha da agulha da seringa de calibre 22 para que seu comprimento total é de cerca de 31-32 mm (2). Areia ao fim de metal para torná-la plana e lisa. O comprimento final desse tubo orientador deve ser de cerca de 5-6 mm mais curta do que a agulha da seringa de calibre 25.
3. Use cola de cianoacrilato para fixar o tubo guiando para a placa de suporte, certificando-se que a agulha é perpendicular à borda do metal.
4. Inserir a agulha da seringa de calibre 25 dentro do tubo-guia, e dobrar a agulha a 90 graus em 2,5-3 mm da ponta (Fig. 1).
5. Ajustar o intervalo vertical em movimento da agulha colando um pequeno tubo de plástico para a extremidade da agulha para cima (Fig. 1, pare de agulha). A faixa final, movimento da agulha determina o quão profundo a agulha pode ser inserida no córtex, e deve ser 1,6-1,8 mm para P21 ratos e 1,3-1,5 mm para P21 camundongos. Este comprimento precisa ser ajustado para diferentes espécies e idades dos animais.
6. Anexar um fio de cobre pequeno ou um pequeno pedaço de fita adesiva sobre a extremidade superior da agulha na mesma direção como a ponta dobrada (Fig.1 indicador de agulha). O fio ou fita indica o ângulo de viragem da agulha durante a cirurgia undercut (Fig. 1).

2. Preparação de animais

1. Todos os instrumentos cirúrgicos precisam ser autoclavado, esterilizado com um esterilizador de bolas de gude, ou desinfetados com álcool 70%.
2. Usamos Sprague / Dawley em idade pós-natal 20-22 dias (P20-22) ou CD1 ratos da mesma idade. Diferentes linhagens de camundongos ou ratos pode ser usado para projetos específicos.
3. Anestesiar o rato com uma injeção ip de cetamina 80 mg / kg e xilazina 8 mg / kg. O procedimento cirúrgico começa depois que o animal não responde a pitada cauda. Durante a cirurgia, se necessário, uma dose de reforço de um terço da dose original do cocktail anestésico pode ser dada para restaurar o estado anestésico original.
4. Cortar o cabelo no couro cabeludo do animal com um aparador de pêlos elétrico. Aplique uma pequena quantidade de pomada oftálmica para os olhos do animal para proteção contra o ressecamento durante a anestesia. Desinfectar o couro cabeludo usando a 10% de solução de iodo-povidona, seguido por etanol 70%.
5. Montar o animal em um aparelho estereotáxico para manter a cabeça em uma posição estável fixo. Durante toda a cirurgia, nós manter o animal em uma almofada de aquecimento para evitar a hipotermia.
6. Faça uma incisão ântero-posterior da linha média no couro cabeludo utilizando um bisturi, que se estende desde a lambda entre os olhos. Use hemostats para puxar a pele para o lado e expor o crânio deixado suficientemente.
7. Faça um corte retangular na caveira da esquerda, e use o bisturi para raspar periósteo. Esta etapa irá reduzir o sangramento e facilitar a perfuração no crânio.

3. Fazendo undercuts

1. Adicionar uma pequena quantidade de salina estéril para a área do crânio exposta, e, em seguida, usar vários Q-dicas para limpar o sangue e seque a área.
2. Sob um microscópio cirúrgico, iniciar a perfuração de um sulco retangular (~ 5 x 7 mm em ratos, 4 x 5 mm em camundongos) no centro do crânio esquerda (acima de aproximadamente esquerda córtex sensório-motor). Aplicação de uma gota de solução salina no crânio facilita a perfuração e calor se dissipa. Após cerca de 2 / 3 da profundidade do osso é perfurado, remova o excesso salina e limpe a área de perfuração com um Q-Tip. Lenta e cuidadosamente perfurar mais fundo até que a peça central do osso é móvel ao toque suave de uma pinça.
3. Remova cuidadosamente a peça central do osso através da inserção de uma ponta afiada de uma pinça na borda do osso e, lentamente, levantando a pinça para expor o hemisfério esquerdo.
4. Sob o microscópio cirúrgico, segure o dispositivo minar, e orientar a agulha em uma direção perpendicular parasagital ea placa de suporte à linha média, inclinação do aparelho ligeiramente caudalmente de forma a manter a visualização da ponta da agulha e região-alvo cortical. Com a ponta da agulha para uma área de 1-2 milímetros lateral à sutura sagital superior, no meio da janela do crânio, e evitar a penetração direta dos grandes vasos.
5. Inserir a agulha em um sentido horizontal através da dura-máter e sob a pia, de modo a poupar os vasos sanguíneos. Sente-se na parte inferior do dispositivo undercutem ambas as bordas da janela do crânio de modo que a agulha está posicionada perpendicular à superfície cortical (Fig. 1). Descansando o dispositivo nas bordas tanto da janela do crânio com a mão irá reduzir significativamente ou eliminar a mão trêmula durante o procedimento a seguir. Levante a agulha debaixo da pia e desça lentamente para criar um corte transcortical até que a agulha não pode ir mais fundo. ~ Girar 135 ° de distância da linha média para criar uma questão semi-círculo branco / camada profunda VI undercut. Em seguida, levante a agulha novamente para debaixo da pia. Incline o dispositivo para trás e retire a agulha.
6. Opcionalmente, pode-se repetir o procedimento acima (passo 2.5), mas sem virar a agulha de forma a criar um corte adicional transcortical nas bordas laterais da janela. Isso irá criar um isolamento mais completo cortical.
7. Coloque um pedaço de filme plástico (6 x 6 mm) para a janela do crânio para a proteção, e sutura no couro cabeludo. Colocar o animal em uma almofada aquecida até que esteja totalmente recuperado da anestesia.

4. Resultados representativos:

Coronal fatias corticais podem ser preparados para confirmar o sucesso da cirurgia undercut. Em fatias preparadas> 2 semanas após a cirurgia, cortes transcortical e minar são discerníveis no âmbito do objectivo de baixa potência de um microscópio (Fig. 2). O córtex parcialmente isolado geralmente se torna um pouco mais fino, e atividade epileptiforme pode ser detectada na maioria dos fatias corticais com a gravação de campo potencial (Fig. 3).

Na formação de contraste, de grandes buracos na substância branca ou em camadas profundas cortical, dramática afinamento do córtex lesionado, ou um corte errante estar acima ou abaixo da substância branca do cérebro fará inutilizável para novas experiências.

Figura 1. Estrutura e aplicação de um dispositivo de minar. Um tubo guia (2) é colado em uma placa de suporte (1) que é feito de aço inoxidável ou plástico transparente. A agulha da seringa (3) é inserido através do tubo guia e dobrados em ~ 3 mm até a ponta. Uma agulha parar feita de tubo de plástico é colado sobre a extremidade superior da agulha de modo que a faixa vertical em movimento da agulha é limitada a 1,2 mm ~ e ~ 1,5 mm para uso em P21 camundongos e ratos, respectivamente. Um segmento de fio de cobre de pequeno porte é preso sob a alça agulha como indicador para a orientação da agulha torta. Note-se que o dispositivo é inclinado e em contacto com ambas as extremidade da janela do crânio de modo que um corte pode ser feita paralelamente à superfície pial.

Figura 2. A imagem representativa da fatia undercut. A. Imagem fluorescente de uma fatia que foi preparado de duas semanas após lesão undercut em um rato P48. A ferida de corte foi rotulado por fluorescentes DII corante. As setas brancas da direita indicam corte transcortical, e as setas na parte inferior indicam minar que passaram embora a fronteira entre a camada IV e substância branca.

Figura 3. Gravação de campo potencial de minar uma fatia. Campo registro do potencial de uma fatia do cérebro undercut exibiu atividade epileptiforme, sugerindo hiperexcitabilidade do tecido lesado cortical.

Discussion

Minar o modelo é um sistema altamente eficiente para o estudo da epileptogênese pós-traumático. A cirurgia típica leva apenas cerca de 20-30 minutos para terminar, e evocou ou atividade epileptiforme espontânea pode ser gravado em fatias de a maioria dos animais de duas semanas após a cirurgia ^1-2. Mais importante, este modelo imita os aspectos de alterações após uma lesão cerebral traumática, tais como hemorragia, inflamação, edema axotomia e morte neuronal ^7. Não só tem atividade epileptiforme foi observada em roedores e outros animais, mas também crises epilépticas têm sido documentados em humanos que sofrem lesões corticais comparável ^8. Progressos significativos foram feitos para elucidar os mecanismos subjacentes nos últimos anos. Espontânea e evocada descargas epileptiformes interictais foram registrados em fatias de cérebro> 2 semanas após a lesão, e essas atividades foram encontradas para originar na camada cortical do rato V ^1. Evidência de reorganização do circuito, perda de interneurônios GABAérgicos e desinibição, aumento da excitabilidade da membrana neuronal, e aumenta em acoplamento sináptica excitatória também foram demonstrados, particularmente na camada cortical V ^2,9-13.

Aqui nós introduzimos um novo instrumento para a tomada de lesões undercut. Quando se realiza a cirurgia de minar com uma mão livre, a mão agitando frequentemente causa dificuldades em tornar estável e precisa lesões corticais. Embora a prática e experiência pode melhorar a qualidade da cirurgia, uma variabilidade significativa na profundidade e qualidade das lesões existe. O dispositivo que introduzimos aqui é benéfico em três aspectos. Em primeiro lugar, descansando sobre as bordas da janela do crânio, o dispositivo elimina em grande parte o problema da mão trêmula durante a cirurgia, tornando assim possível fazer um corte suave através do tecido cerebral delicada. Segundo, a profundidade da inserção da agulha e do grau de rotação pode ser cuidadosamente controlada, o que torna possível reduzir de forma mais precisa e consistente na substância branca abaixo da camada VI. Em terceiro lugar, a superfície do hemisfério cortical é curvo: com a medial sendo maior do que o lado lateral (Fig. 1), que pode causar falta o assunto alvo branco se o ângulo da agulha não é ajustado em conformidade. Descansando o dispositivo na janela do crânio, a agulha é inclinado lateralmente, e do ângulo de corte é automaticamente ajustado para que a rotação da agulha é sempre paralela à superfície do córtex e lesão precisas sejam obtidas (Fig. 2). Um problema potencial com o uso desse dispositivo é que ele pode interferir com a visualização direta da agulha sob o microscópio. Este problema pode ser resolvido por um pouco inclinando o dispositivo para a direção caudal ao penetrar o pial eo córtex. Assim que a agulha é reduzido na substância branca, o dispositivo precisa ser ajustado para se tornar vertical para a superfície cortical, e descansou no crânio. Neste momento, olhando para o indicador de agulha é suficiente para monitorar a rotação da agulha. Em resumo, com estas diversas vantagens e sua relativa facilidade de construção, o modelo de minar se tornará mais acessível e útil para o estudo da epileptogênese pós-traumático.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Foredom micromotor kit	equipment	Foredom	K.1070
1.5 inch 22-gauge syringe needle	material	BD Biosciences	305156
1.5 inch 25-gauge syringe needle	material	BD Biosciences	305127
Cyanoacrylate glue	material	Ted Pella, Inc.	14450