Summary
산화 세포 환경을 감지하는 심사 방법은 CM - H2DCFDA의 산화를 측정하는 것입니다. 일단 비 형광의 형광 화합물로 세포, CM - H2DCFDA 변경 내에 산화. 형광에이 변경 사항은 유동세포계측법으로 측정하고 산화 환경에서 세포의 수를 나타냅니다.
Abstract
의 연결을 손상을 유도 바이러스의 자주 제안 메커니즘은 산화 스트레스입니다. Astrocytes는 중추 신경계 (CNS)의 산화 스트레스를 조절에 중요한 역할을했습니다. Astrocytes는 반응 산소 종 (ROS)에서 뉴런뿐만 아니라 보호하는 뉴런에 생체 항상성 환경을 유지할 수 있도록 도와주십시오. CM - H2DCFDA는 ROS의 존재에 대한 세포 침투성 표시기입니다. CM - H 2 DCFDA이 아닌 형광 화합물로 세포를 입력하고, 휴대폰 esterases은 아세테이트 그룹을 제거한 후 형광되고, 화합물이 산화됩니다. 녹색 fluorescing 것으로 판단될 유동세포계측법에 의해 측정한 세포의 숫자는 산화 상태에있는 세포의 수를 나타냅니다. CM - H 2 DCFDA 다른 ROS 다수에 의해 산화 쉽습니다. 이 분석에 관계없이하는 산소의 산화 세포 환경을 화면으로 사용할 수로 ROS는 CM - H 2 DCFDA을 산화 수있는에 대한 특이성의이 부족은,이 화합물 pathogenesis 조사의 초기 단계에 사용하기 위해 가치있는 리젠트합니다 ROS의 급진 또는 조합은 세포 조건에 책임이 있습니다. 일단 그것은 ROS가 CM - H 2 DCFDA의 산화에 의해 현재 다음 추가 실험이 ROS 또는 로스의 조합이 특정 pathogenesis 과정에 참여하는 결정하기 위해 수행할 수있는 것으로 설립되었습니다. 본 연구의 결과는 과산화수소 CM - H 2 DCFDA의 증가 또한이 분석은 G355 - 5 세포 내에서 산화 환경을 검출을위한 가치있는 테스트입니다 나타내는 생리 컨트롤에 상대적으로 감지되었습니다 형광 것을 입증 고양이 astrocyte 세포 라인.
Protocol
1. 세포 고양이 astrocytes의 문화와 H 2 O 2와 치료
- 37 DMEM 미디어 플러스 영양소와 75cm이 플라스크에 문화 세포주 G355 - 5 ° C와 5% CO 2 60 % 합류 (~ 5 일)까지. 모든 1~2일 미디어를 교체 또는 건강한 문화를 유지하는 데 필요한.
- 미디어를 제거하고 0.25 %의 트립신 2 ML를 추가합니다. 45 S에 대한 pipetting하여 세포를 리프트 - 실내 온도 (RT)에서 1 분.
- 신속 미디어 10 ML을 포함한 15 ML 원뿔 관에 현탁액을 전송하기만하면됩니다. 부드럽게 섞는다.
- 펠렛을 얻기 위해 3 분 300 XG, 23 ° C에서 원심 분리기. 펠렛을 방해하지 않고 뜨는 폐기하십시오.
- 신선한 미디어 6-7 ML을 추가하고 세포를 resuspend.
- 6 잘 플레이트의 각 잘하는 셀 ~ 1 ML을 추가합니다. 각 물론 미디어로부터 2-3 ML을 추가하고 80~90%의 합류까지 품어.
- 미디어 과산화수소의 100μM 솔루션 (H 2 O 2)를 준비합니다.
- 각 우물에서 미디어를 제거하고 하나 둘 ML 신선한 매체 (제어), H 2 O 2 (치료) 또는 DPBS의 2ml 2 ML로 바꿉니다. ° C, 5 % CO 2 3 H. 위해 37 알을 품다
- 솔루션을 제거하고 세포를 리프트하는 트립신 1 ML를 추가합니다. 0.5 ML의 DPBS을 포함하는 1.7 ML Eppendorf 튜브에 세포를 전송합니다. 이 단계는 연장 트립신 보육에서 세포 죽음을 방지하기 위해 각 잘 개별적에서 수행되어야합니다.
- 3 분 300 XG에 스핀, 버리고 뜨는 및 DPBS 1 ML에 resuspend.
2. ROS를위한 염색법
- 얼룩의 모든 단계 표백 방지하기 위해 최소한의 빛의 노출을 실시해야합니다.
- 긍정적인 제어 50 MM의 CCCP 1 μl를 추가합니다. 37 품어 ° C, 5 % 5 분 CO 2.
- H 2 O 2 그룹 10 MM CM - H 2 DCFDA 솔루션 5 μl를 추가합니다. 37 품어 ° C 5 % CO 15-30 분 2. 아무 얼룩은 생리 예제에 추가하지 않습니다.
- 잔여 얼룩을 제거하는 DPBS 2 ML과 샘플을 씻으십시오.
- 펠렛을 얻기 위해 3 분 300 XG에 스핀.
- DPBS 0.5 ML에서 세포를 Resuspend. 생리를 제외하고, 각 예제 1 μl PI를 추가합니다.
- 5ml 흐름 cytometer 튜브에 샘플을 전송합니다.
- 흐름 cytometer를 실행합니다.
3. 유동세포계측법
- 525, 775 및 620 nm의 모든 ± 20 nm의 : 488 nm의 아르곤 레이저 다음과 같은 밴드 패스 갖춘 베크맨 쿨터 FC500 (또는 이에 상응하는 금액)에서 샘플을 실행합니다.
- 해당 컨트롤을 준비 : 흠없는 세포가, CM - H 2 DCFDA은 (대조군) PI 단, 더블 스테인드 밖에 스테인드.
- FS 대 SS, PI 대 CM - H 2 DCFDA 다음 histoplots을 가진 프로토콜을 확인합니다. 또한 다음과 같은 histograms을 가집니다 얼룩에 해당하는 휴대폰 번호 대 FL1, FL2 및 FL3을.
- 샘플을 실행하기 전에, 장비, 유체 및 폐기물 컨테이너를 확인합니다. 최소한 20 분 장비를 따뜻하게.
- 장비를 청소하고 제조 업체의 표준에 따라 적절한 주판으로 보정을 수행합니다.
- 귀하의 프로토콜을 선택하고 샘플을 실행합니다.
- 이전 완료로 장비를 청소하십시오.
- 제조 업체의 기준에 따라 진공 라인을 청소하십시오.
- 흐름을 끄고 머리 / 진공 라인을 청소하십시오.
- 소프트웨어 및 컴퓨터를 끕니다.
4. 대표 결과 :
유동세포계측법 결과는 FlowJo 7.6과 얼룩 컨트롤이 객관적으로 게이팅을 설정하는 데 사용되었다를 사용하여 분석했다. 이것을 근거로, 건강한 세포가 히스토그램 및 ROS (산화 스트레스)의 왼쪽에 표시가 오른쪽으로 세포의 변화로 감지되었다. 그림 1은 건강한 고양이 astrocytes에 과산화수소의 효과의 결과를 보여줍니다. FL1에서 데이터는 ROS의 존재를 나타내는 CM - H 2 DCFDA의 강도를 측정하는 데 사용되었다. 예상했던대로, ROS의 높은 금액은 H 2 O 2 대우 샘플에서 발견되었다. 이것은 왼쪽에서 오른쪽으로 형광 강도의 변화로 히스토그램에 표시됩니다. DMEM 대 DPBS 취급 건강한 세포를 비교하면, ROS의 양을 (그림 2)에는 큰 변화가 없었다.
건강한 고양이 astrocytes에서 산화 스트레스의 수준과 건강한 세포에 H 2 O 2의 효과 그림 1. 유동세포계측법 결과. 결과없이 치료 (DMEM)과 세포와 비교하여 H 2 O 2 건강한 세포에 ROS의 수준을 증가시킬 수있다는 것을 나타냅니다.
DPBS와 3hrs에 대한 incubated 건강한 세포에 감지 ROS의 수준의 그림 2. 유동세포계측법 결과.
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Discussion
바이러스 자주 제안된 메커니즘의 연결 손상이 산화 스트레스 1, 4, 7, 9, 13, 15, 16, 18-22, 27, 31 유도. 기본적으로, 그것은 제안 이러한 수산화, 초과 산화물의 음이온, 질산 산화물 및 / 또는 신경에 독성이 과산화수소, 같은 바이러스성 노출을 통해 glia (astrocytes와 microglia)가 릴리스 반응 산소 래디 칼. 마찬가지로, 산화 스트레스는 또한 암페타민 유발 neurotoxicity 2, 6, 17의 주요 pathologic 메커니즘으로 제안되었습니다. 우리 그룹 CNS에 대한 학대의 바이러스와 약물 모두의 영향에 관심이 있기 때문에, 우리는 astrocytes에 초과 ROS의 현재를 결정하는 빠른 선별 검사를 사용하여 선출. 의 연결을 글루타티온의 대부분은 astrocytes 제작한 다음 뉴런 5, 8, 10-12, 24, 26, 29, 30로 전달됩니다. 따라서, 산화 스트레스에 astrocytes 역할은 뉴런에 생체 항상성 환경을 유지뿐만 아니라 ROS에서 뉴런을 보호하는 중요한이며, astrocyte 세포 배양이 연구를 위해 선택한 것을 이유이다.
CM - H 2 DCFDA도 2 ', 7' - dichlorofluorescein 및 H2DCF로 알려져 있습니다. CM - H 2 DCFDA는 반응 산소 종의 존재에 대한 세포 침투성 표시기입니다. CM - H 2 DCFDA 세포 esterases은 아세테이트 그룹을 제거한 후 형광 될 아닌 형광 화합물로 세포를 입력하고, 화합물이 산화된다. 일단 세포와 아세테이트 그룹 내부에 제거됩니다, CM - H 2 DCFDA는 녹색으로 결과, 질산 산화, peroxynitrite의 anions, 과산화수소, 그리고 유기 hydroperoxides 3, 14, 25를 포함하여, ROS 종의 숫자에 의해 산화 수 있습니다 형광 제품 23, 28. 이러한 부족 CM - H 2 DCFDA을 산화 수있는, ROS에 지정한 산화 스트레스 메커니즘이 역할을로 여겨지고있는 pathogenesis 조사의 초기 단계에서 가치 시약 만들어지만, 어떤 알 수있다 급진적인 산소 오히려 각 ROS 별도의 시험보다 참여 수 있습니다. 일단 그것은 ROS가 ROS 또는 로스의 조합이 특정 pathogenesis 과정에 관련된 CM - H 2 DCFDA 다음, 추가 실험을 확인하기 위해 수행할 수의 산화에 의해 존재하는 것을 설립되었습니다. 생리 조절에 비해이 현재 연구의 결과는 나타내는 과산화수소 CM - H 2 DCFDA 증가의 추가와 함께 발견되었다 형광 것을 보여주는 이번 분석은 G355 - 5 이내에 산화 환경을 검출 가치 테스트입니다 전지, 고양이 astrocyte 세포 라인.
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Disclosures
우리는 이러한 연구들의 관대한 지원 ReadiSorb 제품 감사합니다.
Acknowledgments
우리는 이러한 연구들의 관대한 지원 ReadiSorb 제품 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Cellgro | 15-013-CV | |
| MEM Vitamins | Cellgro | 25-020-cl | 1% (v/v) |
| L-glutamine | Hyclone | 17-605E | 1% (v/v) |
| Non Essential Amino Acids | Hyclone | 25-025-cl | 1% (v/v) |
| FBS | Hyclone | SH30071.03 | 20% (v/v) |
| Essential Amino Acids | Cellgro | 25-030-cl | 0.2% (v/v) |
| 500ml vacuum filtration system | VWR international | 87006-076 | |
| 15 ml conical tubes | Falcon BD | 352097 | |
| 75 cm2 tissue culture flasks | Falcon BD | 353136 | |
| 6 well tissue culture plate | Falcon BD | 353224 | |
| CM-H2DCFDA | Invitrogen | C6827 | |
| Propidium Iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4170-10mg | |
| Trypsin | Lonza Inc. | 17-160F | |
| H2O2 | Sigma-Aldrich | H6520 | |
| HyQ Antibiotic | Hyclone | SV30079.01 | 0.1% (v/v) |
| G355-5 cells | ATCC | CRL-2033 | Normal feline brain |
References
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